Piano di attività - Università di Bologna

TUTOR
Marco Seri
TITOLO DEL PROGETTO
Targeting the chromosome 19p13.2 locus (MYO1F) in familial non-medullary thyroid cancer
DESCRIZIONE DEL PROGETTO
Stato dell’Arte e Razionale
L’aggregazione familiare è un fattore di rischio importante per il tumore della tiroide di derivazione follicolare (NonMedullary Thyroid Carcinoma, NMTC). La componente ereditaria è evidente nella predisposizione a NMTC e diversi
gruppi di ricerca hanno identificato loci di predisposizione, su differenti cromosomi, inclusa la regione sul cromosoma
19p13.2. Tramite l’approccio di analisi dell’esoma (whole exome sequencing) il nostro gruppo di ricerca ha identificato
nei pazienti della famiglia originale in cui era stato identificato il locus 19p13.2 una nuova mutazione nel gene MYO1F
in the 19p13.2 locus (TCO, Thyroid Carcinoma with cell Oxyphilia), con un modello di trasmissione autosomico
dominante.
L’analisi WES è stata svolta in collaborazione con la Dr A. Bowcock (Dept. of Genetics, Washington University, St.
Louis, US) su tre individui affetti. Le librerie esomiche sono state preparate con il kit Nimblegen SeqCap EZ Exome e
sequenziate sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000. Tutte le varianti annotate (con ANNOVAR) sono state filtrate sulla
base dei dbSNP databases. Le variants presenti in dbSNP129 e dbSNP132 sono state eliminate. Tra le restanti varianti
le mutazioni potenzialmente patogenetiche sono state selezionate in base alla classe funzionale e alla localizzazione nel
locu cromosomico 19p13.2 e presenti in tutti e 3 gli individui affetti. Un’unica variante in eterozigosi nell’intevallo di
linkage era condivisa dai 3 affetti, corrispondente alla mutazione missenso in MYO1F cDNA (NM_012335),
c.400G>A, con sostituzione p.134G>S. Questa variante non è presente in NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) e
Exome Aggregation (ExAc) database e non era presente in 1000 in-house cromosomi di controllo control. La variante
co-segrega con il fenotipo tumore nella famiglia ed è predetta dannosa. Il gene MYO1F consiste di 28 esoni e codifica
per una proteina di 1098 amminoacidi, che appartiene alla classe delle miosine non-convenzionali. L’espressione di
MYO1F si ritrova in tutti i tessuti, incluso la tiroide. La comprensione del ruolo funzionale di questa mutazione nello
sviluppo del tumore della tiroide sarà al centro dell’attività dell’assegnista di ricerca. In particolare l’attività sarà svolta
per elucidare le conseguenze funzionali della mutazione MYO1F p.134G>S in modelli cellulari tiroidei, in termini di
espressione di markers tiroidei, di trasporto dello ioduro, e di acquisizione di un fenotipo tumorale.
Obiettivi e Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…)
Per comprendere se la mutazione p.134G>S modifica l’accumulo di ioduro nelle cellule per la sintesi degli ormoni
tiroidei, l’uptake dello ioduro sarà misurato tramite live cell imaging con la proteina YFP-H148Q/I152L, un sensore
fluorescente sensibile ai livelli di ioduro. Per una misurazione efficiente l’assegnista genererà cellule co-esprimenti la
proteina MYO1F wt o mutata (resistenza a neomicina) e la proteina YFP-H148Q/I152L (resistenza a zeomicina).
Tramite doppia selezione con neomicina e zeomicina si otterranno le cellule stabilmente esprimenti tali proteine protein.
La fluorescenza cellulare sarà monitorata tramite microscopia a fluorescenza. La concentrazione intracellulare di ioduro
sarà monitorata in continuum tramite influsso di ioduro e susseguente lavaggio, misurando l’influsso NIS-dipendente e
efflusso. Per comprendere se la mutazione p.134G>S influenza l’espressione di geni specifici della tiroide, sarà valutata
l’espressione di specifici marcatori (TSH receptor, thyroid peroxidase, TPO, thyroglobulin, Tg, Sodium Iodide
Symporter, NIS) tramite RT-PCR quantitativa nelle linee esprimenti la proteina wt o mutata (mesi 6-12).
Per comprendere se la mutazione p.134G>S predispone allo sviluppo di tumore, le linee FRTL-5 esprimenti la proteina
wt o mutata saranno testate per valutare differenze in proliferazione cellulare, crescita indipendente dal substrato e
invasività, in confronto alle linee esprimenti il vettore vuoto di controllo. La proliferazione cellulare sarà valutata con il
test SRB, mentre la crescita sarà valutata come numero di colonie formate in soft agar. L’acquisizione delle immagini
sarà svolta con il software ImageJ. L’invasività sarà misurata con il saggio di chiusura della ferita. Le differenze
saranno misurate con il software TScratch. Differenze quantitative saranno valutate con il test statistico ANOVA.
Risultati attesi
L’identificazione di una forma genetica di tumore della tiroide è critica per una diagnosi precoce e per un trattamento
mirato, dato che questi pazienti di solito presentano tumori più aggressivi e con prognosi peggiore. L’elucidazione di
come mutazioni in MYO1F portino allo sviluppo di un tumore della tiroide chiarirà i meccanismi alla base di tale
patologia.
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA
Nello svolgimento dell’attività di ricerca l’assegnista con competenze di biologia molecolare e cellulare di base
acquisirà le conoscenze necessarie per la generazione di linee stabili trasfettate a partire da cellule di tiroide di ratto
(FRTL-5) modello di epitelio tiroideo altamente differenziato e simile alle cellule normali del follicolo tiroideo. Le
cellule FRTL-5 trasfettate con il vettore di espressione contenente il cDNA di MYO1F wt e mutato (ottenuto per
mutagenesi sito-diretta) e il vettore vuoto di controllo saranno selezionate con G418.
Scansione temporale della formazione
In tale progetto l’assegnista acquisirà competenze altamente specializzate per la generazione di modelli cellulari
geneticamente modificati (mesi 1-6), per la valutazione della crescita tumorale, e per la valutazione dell’effetto di
composti in real-time sulle cellule, utile in processi di drug-screening (mesi 6-12).
Scheda attività assistenziale (se prevista)
PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA
ATTIVITÀ
N. ORE SETTIMANA
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA