Diversità tra i viventi
Proprietà della VITA
La CELLULA
Classificazione dei viventi
1
Ciascun vivente nasce, cresce, genera dei figli a lui
simili e muore. La nascita, la crescita, la generazione
di figli e la morte rappresentano le più evidenti
manifestazioni della vita.
Perché un vivente può realizzare questi eventi ?
Tutti i viventi possiedono
delle caratteristiche comuni
2
Le proprietà della vita (1/4)
Organizzazione
particelle
subatomiche
1
atomo molecola organulo
cellula
tessuto
organo
apparato
popolazione comunità
ecosistema
biosfera
organismo
Tutti i viventi sono formati da
materia, organizzata in molecole,
come i non viventi. La composizione
chimica del vivente è, tuttavia,
qualitativamente diversa rispetto a
quella
dell'ambiente
che
lo
circonda. Le molecole dei viventi,
inoltre,
sono
organizzate
in
"impalcature"
che
costituiscono
sistemi altamente complessi.
La vita è organizzata su più livelli
di complessità crescente
3
Le proprietà della vita (2/4)
2
Capacità di trasformare
materia ed energia
Attraverso la nutrizione il cibo
Per mantenere la loro particolare
organizzazione i viventi devono
assumere materia e “spendere”
energia. L’energia è indispensabile
per trasformare la materia in
strutture viventi.
viene trasformato in materia vivente
4
Le proprietà della vita (3/4)
3
Capacità di rispondere
agli stimoli
Un vivente può muoversi per
afferrare la preda, per sfuggire al
pericolo, o, come nel caso delle
piante, per “inseguire”la luce.
Un vivente è inoltre in grado di
trasformarsi per
sopravvivere
anche
in
condizioni
avverse
(evoluzione).
4
Un vivente è in grado di reagire
di fronte al pericolo
e di adattarsi ai cambiamenti ambientali
Adattamento
5
Le proprietà della vita (4/4)
5
Capacità moltiplicarsi
Qualsiasi organismo vivente è
destinato
presto
o
tardi
a
scomparire: con la riproduzione la
vita passa da un individuo all’altro,
permettendo
la
perpetuazione
della specie.
La riproduzione consente di mantenere
la vita nel tempo
6
La cellula :
espressione minima della vita
Tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule: è la cellula la più
piccola porzione organizzata di materia che possiede le caratteristiche della vita.
si autoregola
scambia materia
ed energia
CELLULA
si riproduce
con l’ambiente
si può evolvere
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La cellula procariota
La cellula procariota è organizzata
per garantire la sopravvivenza di
organismi molto semplici, con
minime richieste energetiche, e non
risulta specializzata nel compiere
funzioni particolari.
membrana cellulare
regione nucleare
Tutto il volume cellulare è occupato
da un liquido di consistenza
gelatinosa (il citoplasma), in cui
sono immersi tuti i costituenti
chimici della cellula, e dei piccoli
organuli (ribosomi), deputati alla
sintesi delle proteine.
Il materiale genetico (DNA) si trova
fluttuante nel citoplama, in una
regione priva di una membrana che
la delimiti (non esiste un nucleo vero
e proprio).
parete cellulare
citoplasma
ribosomi
Esiste invece una struttura rigida di
protezione e di contenimento, la
parete cellulare, che la separa
dall’ambiente esterno.
8
La cellula eucariota
membrana nucleare
La cellula eucariota è un tipo di
cellula molto più voluminosa e
complessa della cellula procariota.
Al suo interno lo spazio è
organizzato in settori cui compete
una certa funzione in modo da
assicurarne la sopravvivenza e la
riproduzione.
citoplasma
membrana
cellulare
Le diverse regioni all’interno della
cellula
sono
delimitate
da
membrane interne. In particolare ,
una
membrana
(membrana
nucleare) delimita il nucleo, in cui
si trova il materiale genetico (DNA)
che presiede al controllo di tutte le
attività della cellula stessa.
La cellula eucariota possiede inoltre
numerosi organuli, in alcuni dei
quali hanno luogo i processi
metabolici
fondamentali
:
nei
ribosomi, ad es.,avviene la sintesi
delle proteine; i mitocondri sono
la sede della respirazione cellulare
nucleo
mitocondri
Reticolo endoplasmatico
con ribosomi
9
Tassonomia : livelli gerarchici
La chiave della classificazione naturale
del mondo vivente è la specie.
SPECIE
Generi
Famiglie
Ordini
Linneo
Riconoscere individui della stessa specie può risultare abbastanza
complesso. Ecco una definizione di specie universalmente
accettata: “la specie rappresenta una categoria sistematica
comprendente una o più popolazioni di individui con caratteri
simili, in grado di accoppiarsi originando prole feconda”.
Varie specie con caratteristiche comuni vengono raggruppate in
generi; a loro volta i generi possono essere riuniti tra loro per
alcuni caratteri generali e raggruppati in famiglie; le famiglie in
ordini; gli ordini in classi; le classi in tipi di phila per gli
animali e divisioni per i vegetali; i phila/divisioni in regni.
Phyla
Classi
Divisioni
REGNI
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PIANTE FUNGHI ANIMALI
I cinque regni
Organismi eucarioti pluricellulari
( differiscono principalmente per il
modo di nutrirsi )
Il modello ad albero di Whittaker in cinque
regni evidenzia l’origine comune e la successiva
evoluzione di tutte le forme viventi.
Organismi eucarioti per lo più
unicellulari
Organismi unicellulari procarioti
PROTISTI
MONERE
11
Caratteristiche dei regni
Regno
Tipo cellula
Nutrizione
Num. cellule
Monere
Procariote
Autotrofi e
eterotrofi
Unicellulari
Protisti
Eucariote
Autotrofi e
eterotrofi
Principalmente
unicellulari
Funghi
Eucariote
Eterotrofi
Principalmente
pluricellulari
Vegetali (Piante)
Eucariote
Autotrofi
Pluricellulari
Animali
Eucariote
Eterotrofi
Pluricellulari
12
Coltura Cellulare
●Insieme di cellule mantenute “in vitro”,
derivanti dalla disgregazione di tessuti o
isolate da fluidi biologici come il sangue.
●Le cellule vengono poste a contatto di tutti i
fattori e metaboliti necessari alla loro
crescita.
13
Coltura Cellulare
14
15
Tecniche Sterili o Asettiche
• Per impedire la contaminazione
accidentale dovuta a microbi
provenienti da fonti esterne
• Per impedire la contaminazione di se
stessi o di terzi
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Metodi di Sterilizzazione
• Sterilizzazione al calore rosso su fiamma
• Sterilizzazione al calore secco mediante
l’utilizzo di un forno ad una temperatura di
circa 160°C per almeno 2 h. Particolarmente
indicata per la vetreria di laboratorio
• Sterilizzazione al calore umido mediante
l’utilizzo dell’autoclave a 121 °C per almeno 15
min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi
non sensibili al calore e per la vetreria di
laboratorio dopo l’uso
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Laboratorio di Coltura
Cellulare
•
•
•
•
•
Spazio o area di lavoro
Abbigliamento da laboratorio
Reagenti colturali
Vetreria e Plastica di laboratorio
Cappa a flusso laminare
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CAPPA A FLUSSO LAMINARE
• Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di
aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra
loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5
m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di
lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici.
• Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono
la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di
microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la
superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere
particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa
tra 99,97% e 99,99%.
• Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la
protezione del campione da contaminazioni non la
protezione dell’operatore e dell’ambiente
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20
Cappa a flusso laminare di
classe II
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●Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in
laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite
cappe di sicurezza microbiologica
●Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura
totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le
manipolazioni all’interno della camera sono consentite da
due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della
cappa.
I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un
sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in
ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita
-Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente.
-Manipolazioni ad alto rischio biologico
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Condizioni fisico-chimiche
●All’interno dell’organismo, le funzioni vitali
(nutrizione, controllo di pH, protezione,
mantenimento della temperatura…) sono
regolate nei tessuti da differenti sistemi di
controllo. Una volta che le cellule sono nel
terreno di cultura, queste funzioni, oltre
all’ambiente di coltura, devono essere sostituite
dallo strumento.
23
Condizioni fisico-chimiche
● pH 7.2-7.4
● Sistema tampone (NaHCO3)
● Temperatura 35-37°C
24
Condizioni fisico-chimiche
● Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura
rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente.
● Anche se normalmente le cellule di mammifero si
coltivano a 37°C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve
poter essere regolato in modo preciso anche a 30°C o 34°C.
25
Condizioni fisico-chimiche
●Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per
mantenere costante il pH
●Il pH del terreno dipende generalmente dalla %CO2 nell’incubatore
●La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in
funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH
desiderato
26
Relazione tra [NaHCO3] e il pH
27
Condizioni fisico-chimiche
● In alcuni casi si può incorporare nel medium di
crescita un colorante sensibile al pH per avere un
controllo visivo dello stato del pH durante la
crescita.
rosso-arancio a ph 7.3
Rosso Fenolo
rosso-viola a ph alcalino
giallo-arancio a ph acido
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●La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle
cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti
(35-45 mmHg, equivalgono al 4.6- 5.9% di CO2). Così l’incubatore
riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle
cellule.
29
●Triturazione tessuto
● I frammenti vengono sottoposti
all’azione di agenti chelanti
(EDTA,) o enzimi proteolitici
(tripsina o collagenasi) che degradano
la matrice del tessuto
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Sospensione Cellulare Mista
Approcci per separare i diversi tipi cellulari:
●proprietà fisiche
●capacità di adesione
●proprietà di legame con anticorpi specifici
●uso di terreni o condizioni di coltura selettivi
31
Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”
Coltura Primaria
Coltura Secondaria
32
Coltura Primaria
●Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in
grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro
dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene
indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la
crescita)
Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le
attività biochimiche delle cellule in vivo
Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo
termine
33
Ciclo vitale di Cellule Primarie
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Linea Cellulare Continua
●Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato
annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte
● Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di
colture primarie non tumorali
Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose
Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati
meno variabili delle colture primarie
Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare
35
36
Coltura Primaria
Coltura a breve termine
< 10 duplicazioni
Coltura a lungo termine
50-60 duplicazioni
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Coltura Secondaria
Linea Cellulare Continua
>150-200 duplicazioni
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Linea Cellulare Continua
• Capacità di crescere indipendentemente
dall’organismo da cui è derivata
• Crescita ininterrotta per oltre un anno
• Immortale
39
Le prime Linee Cellulari Continue
1952, Johns Hopkins
University
HELA
1963, University of
Ibadan
RAJI
40
Medium di Coltura
●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i
componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule
●I più comuni terreni base di coltura:
-MEM: Minimum Essential Medium
-DMEM: Dulbecco’s modification of MEM
-RPMI: Roswell Park Memorial Institute
Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per
la concentrazione di glucosio
41
Medium di Coltura
Sali inorganici
Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni
cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del
pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo
▪ Cloruro di calcio anidro
▪ Solfato di magnesio anidro
▪ Cloruro di potassio
▪ Nitrato di potassio
▪ Cloruro di sodio
▪ Fosfato di sodio bibasico
▪ Bicarbonato di sodio
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Medium di Coltura
Vitamine
Biotina
Pantotenato
Acido folico
Agiscono come catalizzatori o come substrati
Inositolo
per facilitare o controllare alcune funzioni
Nicotinamide
metaboliche
Piridossina
Riboflavina
Tiamina
Vitamina B12
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Medium di Coltura
Amminoacidi-isomeri L
Alanina
Arginina
Asparagina
Acido aspartico
Cisteina
Glutamina
Acido glutamico
Glicina
Istidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Necessari per la sintesi delle proteine
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Medium di Coltura
Zuccheri
Glucosio
Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio
per le biosintesi
45
Medium di Coltura
• Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di
essere utilizzato, viene complementato con:
• Glutammina (aa essenziale molto labile)
• Antibiotici (penicillina/streptomicina)
• Siero (supplemento più comune delle colture
cellulari)
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SIERO
• Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali
per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule
• Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF
• Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina
• Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi
grassi e glucorticoidi, elementi minerali
Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)
47
SIERO
48
Sistemi di Crescita
ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o
mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi)
Fenomeno che richiede l’interazione
di recettori di membrana con proteine
adesive, adsorbite sulla superficie della
piastra di coltura
SOSPENSIONE: cellule di
origine ematopoietica (che
normalmente vivono in un
mezzo fluido)
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Distacco delle cellule in adesione
• Soluzione di EDTA e tripsina
-EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per
l’adesione
-Tripsina: enzima proteolitico, derivato da
pancreas porcino. Degrada le proteine della
matrice che mantengono le cellule aderenti al
substrato
50
Protocollo di tripsinizzazione
●Lavare le cellule (2X) con PBS (phosphate buffered saline)
●Aggiungere un volume adeguato di tripsina
(pre-riscaldata)
●Incubare a 37°C per almeno 3 min
●Neutralizzare la tripsina con medium completo di FBS
( che contiene inibitori della tripsina)
51
Protocollo di tripsinizzazione
●Trasferire la sospensione ina provetta e centrifugare 5 min
per 900-1000 giri al min
●Aspirare il sovranatante
●Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule
●Distribuire nelle nuove piastre
Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità
in modo da tenere le cellule fuori dall’incubatore il minor
tempo possibile
52
Plastica per coltura
• Sono generalmente in polistirene:
-materiale rigido con superficie lucida
-buona resistenza chimica a soluzioni acquose
-limitata resistenza a solventi
-totale assenza di tossicità per le cellule in coltura
-trasparenza che consente una osservazione diretta al
microscopio
-la superficie è trattata chimicamente per renderla
idrofila e carica negativamente (per favorire i legami
stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)53
Efficienza di semina
-Generalmente le cellule, al di sotto di una certa
densità non crescono in modo efficiente
-Regola generale: densità > 104 cellule/cm2
Tempo di duplicazione
-La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di
cellule raddoppia ad ogni duplicazione
-Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea
cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule
umane
54
Piastre
55
Tipi di Piastre
Diametro
(mm)
Superficie
(cm2)
Volume
(ml)
35
8
1-2
60
21
4-5
100
55
10-12
150
148
20-30
56
Multi-well
57
Tipi di Multi-well
Multi-well
Superficie
(cm2)
Volume
(ml)
96
0,32
0,1-0,2
48
1,0
0,3-0,6
24
1,88
0,5-1,2
12
3,83
1,0-2,4
6
9,40
2.0-3,0
58
Fiasche
59
Tipi di Fiasche
Fiasche
Superficie
(cm2)
Volume
(ml)
T-25
25
5-10
T-75
75
15-25
T-150
150
30-50
T-175
175
35-60
T-225
225
45-70
60
microscopio a contrasto di fase:
un diaframma anulare origina un cono di luce cavo.
quando un raggio di luce colpisce
un campione viene ritardata
rispetto ad un raggio che non
colpisce il campione
i due raggi vengono rimessi in
fase passando une lamina di fase
e formeranno un'immagine
definita
61
FIBROBLASTI
microscopio a contrasto di fase (400X)
62
Coltura primaria in confluenza alla fine
della seconda settimana
63
Conta Cellulare
• Diversi metodi: un metodo semplice ed economico è
l’uso dell’emocitometro o camera di Burker
-La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata
una camera capillare; la parte superiore della
camera è costituita da un vetrino bloccato
lateralmente.
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Procedura per Conta Cellulare
Prima del conteggio si devono staccare le cellule dalla piastra e eliminare gli aggregati
cellulari mediante trattamento enzimatico o chimico (es. tripsina, EDTA). La conta del
numero di cellule in genere si effettua con la camera di Burker.
Questa è costituita da un vetro spesso, in cui è ricavata una camera capillare, la parete
superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato da due graffe laterali.
Al microscopio diventano evidenti una serie di linee ortogonali tra loro, che definiscono
una serie di aree e, quindi, di volumi.
65
Protocollo di Conta Cellulare
Per effettuare il conteggio:
dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato un
dato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti
nei quadrati delimitati da una doppia barra e quelle presenti su due
lati dello stesso quadrato (non si contano, invece, quelle su gli altri
due lati).
Si ripete la conta per almeno tre quadrati, si fa una media del numero
di cellule contate e si ricava il numero totale di cellule moltiplicando
il numero ottenuto per 25x104; si corregge poi per il volume totale
della sospensione (il numero che si ottiene è riferito, altrimenti, ad
1ml).
66
Numero di cellule
-La sospensione cellulare viene risospesa in egual
volume di Trypan blue
-La sospensione viene fatta scorrere per capillarità
all’interno della cameretta
-Si contano le cellule non colorate e quelle colorate
67
Percentuale di Vitalità
-Il trypan blue è in grado di colorare le cellule necrotiche
-Percentuale di vitalità:
N° cellule vitali/N°cell. non vitali + cellule vitali X 100
Concentrazione Cellulare
N° cellule vitali (media dei 3 quadrati) X 10000 X 2
68
