Il microambiente tumorale come bersaglio
terapeutico
Area Tematica 2
Bioterapie dei tumori
Sottoprogetto 2.3
Sviluppo di protocolli di terapia combinata,
inclusi trattamenti integrati di chemioimmunoterapia
1
Razionale e Premesse
•
•
In vivo la crescita tumorale è influenzata in modo determinante dalle cellule del
microambiente (fibroblasti, cellule del sistema immunitario innato e adattativo,
cellule della rete vascolare e linfatica) e da componenti della matrice
extracellulare (citochine, componenti dello stroma)
La prova di principio che è possibile controllare la crescita di tumori umani
agendo sul microambiente anziché direttamente sulla cellula neoplastica, è
rappresentata da un numero crescente di esempi. In particolare:
– Talidomide nel mieloma
– Bevacizumab nei tumori del colon
– Rituximab nel linfoma di Hodgkin classico (CD20-neg)
– Terapia anti H. pylori nel linfoma MALT dello stomaco
– Prevenzione dei tumori del colon-retto con farmaci anti-infiammatori
(NSAIDs)
2
Obbiettivi del Sottoprogetto
• Identificare nel microamiente tumorale nuovi bersagli per il
controllo della crescita neoplastica
• Convalidare in vivo in modelli animali l’attività antitumorale di
inibitori/modulatori dei bersagli in studio
• Verificare in tumori umani l’azione antitumorale di composti con
attività sul microambiente
3
Schema riassuntivo dei bersagli in studio
Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica]
Malorni
[Autofagia/xenofagia]
Pelicci G. [Gene Rai]
Corti [NGR-TNF, VS-1]
Gianni [endotelio]
Colombo [SPARC]
Tagliabue
[serpina, fibulina]
Allavena [macrofagi]
Gianni [CD4+]
Anichini [IL-19R]
Anichini [IL-19]
Allavena [PTX-3]
4
INT, Milano
Andrea Anichini
Bersaglio
Mediatori solubili (IL-19, IL-9, IL-23) prodotti da cellule di
melanoma e attivi su fibroblasti tumore-associati (TAF) e cellule
immunitarie
Obbiettivo
preclinico
•
•
Valutare l’attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di
citochine prodotte da cellule di melanoma (IL-19,IL-9,IL-23, e
altre);
Blocco dell’attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di IL19 con anticorpi neutralizzanti IL-19, e con inibitori della via di
segnale di IL-19R nei TAF. Gli esperimenti verranno ripetuti con
altre citochine espresse dal melanoma.
Avanzamento Profilo di espressione genica in fibroblasti normali vs. TAF esposti
lavori
a IL-19, tramite piattaforma ILLUMINA Bead Station 500.
5
Esperimenti in corso
Espressione di IL-19 in-vivo in melanomi primitivi
Melan-A/MART-1
IL-19
6
INT, Milano
Mario Colombo
Bersaglio
SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine); proteina
matricellulare con ruolo chiave nella modulazione del
microambiente, nella progressione tumorale e nella formazione
di metastasi.
Obbiettivo
preclinico
Verificare nel carcinoma mammario se anticorpi anti-SPARC
potenziano l’attività antitumorale
Obbiettivo
traslazionale
Isolamento di anticorpi umani anti-SPARC
Avanzamento E’ stato isolato un anticorpo monoclonale murino anti-SPARC con
lavori
attività inibitoria
7
Tumors from SPARC KO mice lack of the fibrous stroma
wt
KO
Our aim was to create a species specific Ab that given in vivo
could reduce the tumor stroma and perhaps facilitate drug influx
MP Colombo
8
We immunized SPARC KO mice with a SPARC over-expressing
tumor cell line and selected Ab able to block SPARC inhibition of
wound closure as readout of biological function
t0
t48
t72
t96
Our Ab
Ig
mouse
MP Colombo
9
INT, Milano
Elda Tagliabue
Bersaglio
Proteine della matrice extracellulare (serpina B5, fibulina-1)
Obbiettivo
preclinico
Analisi, in modelli animali geneticamente manipolati, della risposta
alla chemioterapia in funzione del livello di espressione di
componenti del microambiente (serpina B5, fibulina-1)
Obbiettivo
traslazionale
• Valore prognostico del profilo di espressione di geni del
microambiente in pazienti con tumore della mammella operato;
• Isolamento di anticorpi monoclonali anti-serpina e anti-fibulina, e
valutazione di una loro attività di potenziamento della
chemioterapia nel carcinoma mammario
Avanzamento • Produzione di vettori virali per l’espressione di serpinaB5 in
lavori
cellule di carcinoma mammario
• Produzione e purificazione di serpinaB5 ricombinante da
utilizzare per la produzione di anticorpi monoclonali
• Messa a punto di un saggio di Real Time-PCR per la
determinazione dei livelli di espressione di serpinaB5 nei
campioni tumorali fissati
10
• Produzione di vettori virali per
l’espressione di serpinaB5 in
cellule di carcinoma mammario
• Messa a punto di un saggio di
• Produzione e purificazione di
Real Time-PCR per la valutazione
serpinaB5 ricombinante per
produzione di anticorpi monoclonali dei livelli di espressione di
serpinaB5 in campioni PFFE
5’utr bm40 Serpin B5
Serpin B5
Core biopsies
Vettore virale
Infezione di cellule di
carcinoma mammario
Analisi delle cellule infettate
pCEP-Pu
9900 bp
Vettore di espresione
(peptide segnale per la
secrezione;
tag di 6 Histidine)
Trasfezione di cellule
eucariote
Estrazione dell’RNA
RT-PCR relativa
Purificazione con resina Ni-NTA di
serpinaB5 dai surnatanti di coltura
lisato surnatante
WT Serpin WT Serpin
50
35
Immunizzazione degli
animali
11
IEO, Milano
Pier Giuseppe Pelicci, Bruno Amati
Bersaglio
Nicchia emopoietica (osteoblasti SNO, N-caderina, ß-catenina)
Obbiettivo
preclinico
Studio dei fattori del microambiente midollare che regolano
l’equilibrio tra self-renewal e differenziamento delle cellule
staminali leucemiche (LSC)
Obbiettivo
traslazionale
Eliminazione del clone leucemico attraverso modifica delle
interazioni anti-apoptotiche tra LSC e microambiente (in particolare
cellule SNO)
Avanzamento Evidenziamento del ruolo della ciclina E1 nella regolazione del selflavori
renewal in cellule staminali ematopoietiche
12
Competitive Bone Marrow transfer
Bone Marrow cells
X Rays
X Rays
X Rays
WT (competitor)
vs
cycE1-WT Tg-GFP
or
cycE1-KO Tg-GFP
1:1 mix
BMMNC
transplant
coBMT-1
BMMNC
transplant
coBMT-2
coBMT-3
129/C57-GFP+
Test Blood for Chimerism (% GFP+ cells)
E1-WT
E1-KO
P=0,000004
La perdita di ciclina E1 aumenta il potenziale
di Self-renewal delle cellule staminali
ematopoietiche
13
IEO, Milano
Giuliana Pelicci
Bersaglio
Gene Rai espresso da cellule di glioblastoma
Obbiettivo
preclinico
Studiare in vitro e in vivo le proprietà biologiche delle cellule
staminali di glioblastoma, e in particolare il ruolo di Rai su selfrenewal, proliferazione d differenziazione
Obbiettivo
traslazionale
Conferma del ruolo di Rai come possibile bersaglio di composti ad
attività anti-glioblastoma
14
IEO, Milano
Giuliana Pelicci [continuazione]
Avanzamento 1) Rai è espressa nel 60% dei GBM esaminati. L’espressione di
lavori
Rai all’interno del tumore e’ disomogenea. Rai è sempre
espresso, ad elevati livelli, nelle hTNSCs isolate.
2) È stato caratterizzato in vitro ed in vivo il comportamento di
hTNSCs isolate da GBM umani, in cui l’espressione di Rai è
stata spenta stabilmente mediante la tecnica dell’RNA
interference.
3) hTNSCs interferite stabilmente per Rai mostrano una ridotta
capacita’ proliferativa ed un importante deficit di migrazione
rispetto alle cellule di controllo esprimenti Rai.
4) L’inoculo intracranico di cellule staminali tumorali neuronali
umane in topi immunosoppressi determina l’insorgenza di
tumori con le caratteristiche di un glioblastoma. Il silenziamento
genico di Rai e’ in grado di indurre una maggiore sopravvivenza
in tutti gli animali sottoposti ad inoculo.
15
1
RAI EXPRESSION LEVEL IS VARIABLE IN
SAMPLES FROM DIFFERENT PATIENTS
RAI IS ALWAYS EXPRESSED IN hTNSCs
ISOLATED FROM HUMAN GBMs
2
hTNSCs
hTNSCs
WT
empty
vector
siRAI
Vinculin
Lentiviral infection
64
64
52
RAI
10X
Interfered hTNSCs
IB α RAI
IB α RAI
IHC anti RAI on human GBMs tissues
3
4
RAI SILENCING AFFECTS hTNSCs’
hTNSCs’ GROWTH AND MIGRATION
empty vector
Cell number (log scale)
siRAI
4X
RAI SILENCING IMPAIRES GLIOBLASTOMA FORMATION
WT, mock transduced and RAI-interfered hTNSCs were injected in the caudate nucleus of nude
mice. RAI silencing results in delayed mortality due to impaired glioblastoma formation, as
shown by (a) MRI analysis and (b) Kaplan Meier survival curve.
100.000.000.000
10.000.000.000
empty vector
siRAI
1.000.000.000
a.
b.
WT
empty vector
siRAI
100.000.000
10.000.000
1.000.000
100.000
0
6
13
19
26
33
39
A
46
B
C
DIV (Days in Vitro)
4X
GFP/Ki67
Colocalization
RAI-silenced hTNSCs are smaller and grow slower compared with RAI-expressing
counterparts
a.
52
empty vector
siRAI
b.
empty vector
Homolateral
hemisphere
Contralateral
cortex
A
siRAI
5X
20X
40X
5X
20X
40X
5X
20X
0/EGF
t0
4X
4X
t 7d
4X
0/FGF
B
The tumor is widely diffused,
infiltrates the ventricles and the
ippocampus after the injection of
both (A) WT and (B) control
hTNSCs. (C) RAI-interfered hTNSCs
induce a well delineated noninfiltrating tumor.
0/FGF+EGF
4X
RAI-silenced hTNSCs show impair migration in both (a) wound-healing and (b)
Boyden Chamber assays in response to different attractors
C
16
IEO, Milano
Walter Malorni [ISS, Roma]
Bersaglio
Autofagia (self-cannibalism) e xenofagia (xeno-cannibalism)
cellulare, che rappresentano un importante meccanismo di
resistenza delle cellule tumorali alla chemioterapia
Obbiettivo
preclinico
1) studio in vitro della suscettibilita’ apoptotica e delle capacità
auto/xenofagiche di cellule isolate da tumori primari e
metastatici (carcinomi e melanomi) in condizioni di
microambiente sfavorevole;
2) modulazione farmacologica dell’ autofagia/xenofagia con inibitori
della diidrofolato reduttasi (es. pirimetamina) in cellule
intrinsecamente resistenti ai chemioterapici;
3) valutazione in topi SCID dell’attività dei farmaci testati in vitro:
es. pirimetamina in terapia combinata.
Obbiettivo
traslazionale
Messa a punto di protocolli di chemioterapia associata a inibitori
della sopravvivenza autofagica
Avanzamento Induzione in vitro di autofagia in cellule di melanoma metastatico
lavori
intrinsecamente resistenti alla chemioterapia e inibizione
farmacologica attraverso la pirimetamina.
17
18
Humanitas, Milano
Paola Allavena
Bersaglio
Microambiente tumorale di soft tissue sarcomi (liposarcomi)
Proteina di fase acuta PTX-3; Monociti/macrofagi intra-tumorali
Obbiettivo
•
Obbiettivo
traslazionale
Valutare in pazienti con sarcoma in trattamento con Trabectedin:
• L’attività del farmaco in liposarcomi.
• Il suo effetto inibitorio sulla secrezione di mediatori infiammatori espressi
nel micro-ambiente.
• Se i livelli di PTX-3 circolante nei pazienti in terapia con Trabectedin
rappresentano un marcatore predittivo di risposta tumorale.
Avanzamento
lavori
•I liposarcomi sono molto suscettibili all’effetto citotossico di Trabectedin a
concentrazioni nel range nanomolare.
•I liposarcomi producono elevate quantita’ di diversi mediatori infiammatori il
cui ruolo nel micro-ambiente e’ sotto studio. Tra questi, PTX3 e CCL2
(chemochina attiva sui monociti) sono significativamente ridotti daTrabectedin
Definizione del ruolo di PTX-3 e dei monociti/macrofagi nella crescita dei
sarcomi mediante trattamento in vitro e in vivo con il farmaco Trabectedin
(potente inibitore della sintesi di PTX-3 e e CCL2, e dotato di attività
citotossica nei confronti di monociti/macrofagi, oltre che delle cellule
tumorali)
19
Effetto anti-tumorale del farmaco Trabectedin
su cellule di liposarcoma umano
% di cellule vive
120
402.91
100
Linee di liposarcoma risultano molto
suscettibili a basse dosi farmaco, ma a
tempi relativamente lunghi di 48 ore
24h
48h
80
72h
60
40
20
0
Ctrl
1.2nm
2.5nM
5nM
Trabectedin
Geni apoptotici upregulati dopo
trattamento con Trabectedin
35
80
25
Ctrl
1.2nm
2.5nM
5nM Trabectedin
L2
B
C
1
L2
L1
1
C
R
AD
D
AK
B
C
B
R
EL
B
AP
AF
1
F
TN
B
B
C
3
PM
AI
P1
DD
AL
P1
N
-25
LR
0
AS
P1
0
FA
S
-15
B
IK
1765
-5
TN
20
5
C
40
15
FR
SF
10
A
B
C
L2
A1
60
Fold increase
% di cellule vive
100
-35
20
Trabectedin inibisce la produzione di PTX3 e CCL2
in cellule di liposarcoma, ma non di IL-6
PTX3
Espressione di PTX3 in due distinti liposarcomi umani.
Il pattern di positivita’ puo’ risultare etereogeneo (Prof. S.Pilotti)
4
3.5
ng/ml
3
2.5
2
*
1.5
1
*
0.5
0
CTR
2.5
0,6
1,2
2,5
CCL2
5.0
2.0
*
1.0
ng/ml
4.0
1.5
ng/ml
IL-6
*
0.5
3.0
2.0
1.0
0
0
CTR
0,6
1,2
Trabectedin (nM)
2,5
CTR
0,6
1,2
2,5
Trabectedin (nM)
21
Humanitas, Milano
Angelo Corti [HSR, Milano]
Bersaglio
Endotelio vascolare tumorale
Obbiettivo
preclinico
Valutazione in vivo nel topo del meccanismo d’azione e dell’attività
antitumorale di composti antiangiogenetici di sintesi originale:
vasostatina-1 (frammento N-terminale della cromogranina A) e
NGR-TNF (TNF fuso con il peptide CNGRC, espresso dai vasi
angiogenici)
Obbiettivo
traslazionale
Studi clinici di fase I/II con NGR-TNF, da solo e in combinazione
con chemioterapici o con vasostatina-1
Avanzamento 1. E’ stato messo a punto un metodo per la preparazione di NGRlavori
TNF libero da contaminanti deamidati (P3). L’attività dell’NGRTNF/P3 è stata valutata in modelli animali (20 pg sono risultati
sufficienti per indurre effetti terapeutici).
2. E’ stata prodotta la vasostatina-1 ricombinante necessaria per
lo studio nei modelli animali (prodotti >50 mg di vasostatina
purificata)
22
Produzione e caratterizzazione di NGR-TNF/P3 (privo di contaminanti deamidati)
RP-HPLC
SE-HPLC
SDS-PAGE
Effetto anti-tumorale di NGR-TNF/P3 da solo e in combinazioone con melphalan
Fibrosarcoma di topo WEHI-164
Linfoma di topo RMA
23
INT, Milano
A. Massimo Gianni
Bersaglio
Cellule del microambiente nel linfoma di Hodgkin (T linfociti, B
linfociti)
Obbiettivo
traslazionale
Valutare l’attività anti-linfoma indiretta di composti attivi su cellule
presenti nel microambiente di HL (linfociti B, linfociti T, endotelio
vascolare). In particolare:
– Anticorpo anti-CD4 (zanolimumab)
– Anticorpo anti-CD20 (rituximab)
– Anticorpo anti-CD52 (alemtuzumab)
– Anti-VEGF (sorafenib)
24
INT, Milano
A. Massimo Gianni [continuazione]
Avanzamento • Stesura di un protocollo clinico multicentrico randomizzato che
lavori
confronta chemioterapia seguira da radioterapia (ABVD-RT) con
chemio-immunoterapia con rituximab e senza RT (R-ABVD), nel
linfoma di Hodgkin in stadio iniziale;
• Arruolamento in corso di pazienti con HL candidati a trattamenti
di terza linea (fallimento per ricaduta o progressione di una
seconda linea) in uno studio monoistitutzionale con impiego di
sorafenib;
• Arruolamento in corso di pazienti con HL, con cellule del
microambiente CD52+, in un saggio terapeutico “off-label” che
impiega alemtuzumab;
• Trattative in corso con Genmab per uno studio clinico di chemioimmunoterapia (chemioterapia di salvataggio associata a
zanolimumab) [lo studio approvato da Serono è stato cancellato
per restituzione dei diritti di sviluppo dell’anticorpo alla Genmab]
25
INT, Milano
A. Massimo Gianni [continuazione]
26
Schema riassuntivo dei bersagli in studio
Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica]
Malorni
[Autofagia/xenofagia]
Pelicci G. [Gene Rai]
Corti [NGR-TNF, VS-1]
Gianni [endotelio]
Colombo [SPARC]
Tagliabue
[serpina, fibulina]
Allavena [macrofagi]
Gianni [CD4+]
Anichini [IL-19R]
Anichini [IL-19]
Allavena [PTX-3]
27
