Dante
Delivery of AdvaNced TEchnology
Anno VI - n. 2 - Settembre 2007
In questo numero:
Le mucine: una classe emergente
di marcatori immunoistochimici
• La classificazione delle mucine
• Mucine di membrana
• Mucine secretorie che formano gel
Le mucine: una classe emergente
di marcatori immunoistochimici
Marco Chilosi,
Anatomia Patologica, Università di Verona
L
e mucine costituiscono
un’ampia famiglia di glicoproteine di grandi dimensioni (peso molecolare 2-20 x 105 Dalton)
secrete da cellule epiteliali o espresse sulla loro membrana. Sono stati
individuati più di 20 tipi differenti
di mucina e la loro distinzione si
basa sulla sequenza dei differenti
backbone proteici (apomucine) codificati da geni MUC (localizzati su
differenti cromosomi). La struttura
molecolare delle mucine è complessa ed è caratterizzata dalla presenza di numerosi TR (tandem-repeats) capaci di formare un numero
enorme di siti di potenziale O-glicosilazione tramite residui di serina
o treonina. La presenza di questo
peculiare involucro di zuccheri permette alle mucine di assorbire grandi quantità d’acqua e di impedire
la proteolisi, contribuendo così al
123
mantenimento delle barriere mucose. Le mucine formano infatti la
parte preponderante della frazione
proteica del muco, con funzioni di
protezione delle mucose dall’autodigestione e dalla penetrazione di
patogeni e tossine, contribuendo
alle difese immunitarie nel tratto
gastrointestinale, nel sistema respiratorio e in quello riproduttivo. Le
molteplici e importanti funzioni
specifiche delle mucine sono legate
alle loro caratteristiche visco-elastiche nella protezione delle mucose,
ma sono coinvolte anche nella modulazione dell’adesione cellulare e
nella regolazione di importanti
pathways molecolari.
Negli ultimi anni le conoscenze
sull’eterogeneità delle mucine e
sulle loro differenti funzioni ne
hanno sottolineato l’importanza
Anno VI - n. 2 - Settembre 2007
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nella fisiologia e patologia delle
mucose. La disponibilità di anticorpi monoclonali che riconoscono
i cores proteici delle apomucine ha
consentito il superamento delle tipizzazioni istochimiche, sostituite
dall’analisi immunoistochimica.
Questo approccio metodologico,
più specifico e riproducibile, è in
notevole espansione.
L’analisi qualitativa e quantitativa
delle mucine non è semplice a causa della complessità della loro classificazione, nonché per l’occorrenza di polimorfismi e splicing alternativi. Non sempre l’espressione di
mRNA corrisponde a quella della
relativa proteina e dati contrastanti sono riportati in letteratura a
causa dell’eterogeneità metodolo-
gica. La disponibilità di anticorpi
monoclonali, specifici e sensibili, è
fondamentale per poter analizzare
con precisione e riproducibilità il
pattern di espressione delle mucine
nella patologia umana.
Le applicazioni in patologia umana
sono numerose e abbracciano diversi campi. Tra i principali ricordiamo la caratterizzazione delle lesioni pre-neoplastiche e neoplastiche del sistema gastrointestinale,
quella di neoplasie ovariche e uterine, e quella dei tumori del polmone. Appaiono rilevanti anche le
informazioni ricavabili dallo studio
delle mucine nella fisiopatologia
del “microambiente” delle mucose, in particolare in quello del sistema respiratorio. Anomalie quali-
tative e quantitative delle mucine
caratterizzano infatti la patogenesi
di malattie croniche importantissime quali l’asma, la BPCO e la fibrosi cistica (1).
Le mucine sono presenti in tutte
le mucose in differenti combinazioni, correlate alle funzioni specifiche del tessuto nonché a stimoli microambientali capaci di
influenzarne qualitativamente e
quantitativamente l’espressione.
Il pattern di espressione è in parte conservato nella trasformazione neoplastica, seguendo il fenotipo tissutale, e peculiari patterns
di espressione possono essere utilizzati diagnosticamente come
marcatori istogenetici e di differenziazione.
La classificazione
delle mucine
TABELLA 1.
Le mucine si suddividono, in base alle loro caratteristiche molecolari
(con o senza TR) e in base alle caratteristiche biologiche e al pattern di espressione,
in mucine secretorie e mucine di membrana.
Mucine di membrana: MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC13, MUC16, MUC17, MUC20
Mucine secretorie (ricche in cisteina): MUC6, MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC19
Mucine secretorie (povere di cisteina): MUC7, MUC8, MUC9
Mucine prive di TR: MUC14, MUC15, MUC18(CD146)
Da: Gene Bank e Callaghan Rose M, and Voynow JA, Physiol Rev 86:245,2006 (1)
Vedi anche: http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes.pl
TABELLA 2.
Gene
MUC1
MUC2
MUC3A
MUC3B
MUC4
MUC5AC
MUC5B
MUC6
MUC7
MUC8
MUC9
MUC11
MUC12
MUC13
MUC15
MUC16
MUC17
MUC18
MUC19
MUC20
Tipo
M
S
M
M
M
S
S
S
S
S
S, M
M
M
M
M
M
M
M
S
M
Espressione prevalente
pan-epiteliale
intestino
intestino
intestino
bronchi, colon
bronchi, stomaco
bronchi, salivari
stomaco, intestino, vescica
salivari
bronchi
tube
colon, bronchi
colon, pancreas
colon, trachea, rene
colon, bronchi
ovaio
intestino
polmone, mammella
salivari, trachea
rene, placenta, polmone ecc.
Cromosoma
1q21
11p15.5
7q22
7q22
3q29
11p15.5
11p15.5
11p15.5
4q13-21
12q24.3
1p13
7q22
7q22
3q13.3
11p14.3
19q21
7q22
11q23
12
3q29
M: mucine di membrana
S: mucine secretorie
Mucine
di membrana
T
ra le mucine di membrana
MUC1 e MUC4 sono state
particolarmente studiate in campo oncologico per le potenzialità
diagnostiche e prognostiche.
MUC1
È
una mucina di membrana
espressa da quasi tutti gli epiteli (nel duodeno è caratteristicamente assente). Questa mucina è
anche conosciuta come epithelial
membrane antigen (EMA), un
ben noto marcatore in patologia e
immunoistochimica.
L’espressione di MUC1 può subire variazioni in differenti tumori (ad es. nel carcinoma della
mammella). La molecola può essere iper-espressa e contemporaneamente ipo-glicosilata nello stesso
tumore e questa combinazione
rende MUC1 un potenziale bersaglio per strategie immunoterapeutiche e vaccini anti-tumorali (2).
MUC1 è espressa al polo apicale
delle cellule epiteliali nella maggior parte dei tessuti ove svolge
un importante ruolo fisiologico
(adesione cellulare, differenziazione, modulazione del sistema immune, regolazione dell’adesione
cellulare). La porzione intra-citoplasmatica di MUC1 è fosforilata
e può interagire con importanti
pathways molecolari (ad es. betacatenina, recettori ormonali ecc.).
La genetica di MUC1, soprattutto
particolari polimorfismi (ad es.
l’omozigosi di forme di MUC1 di
piccole dimensioni) appare correlata con la suscettibilità a sviluppare gastrite cronica, metaplasia
intestinale e carcinoma gastrico.
MUC4
È
una mucina di membrana
estesamente espressa a livello
tracheo-bronchiale, intestinale,
nel sistema riproduttivo ecc. Dati
recenti hanno dimostrato per questa mucina un ruolo fisiologico
complesso e importante. MUC4,
infatti, a livello citoplasmatico è
capace di interagire come ligando
con la tirosin-kinasi recettoriale
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ErbB2 e può contribuire alla regolazione della p27, importante
inibitor e del ciclo cellular e.
Queste funzioni sono presumibilmente correlate con le caratteristiche di marcatore “prognostico”
di MUC4 (come ad es. nel carcinoma del polmone e nel carcinoma del pancreas) (3).
In diversi tipi di epitelio MUC4
non è normalmente espressa, a
differenza di quanto osser vato
nelle corrispondenti neoplasie.
Questa eterogeneità di espressione può essere utilizzata a livello
diagnostico. Ad esempio nel pancreas MUC4 non è espressa, a differenza del carcinoma intraduttale, in cui sono rilevabili consistenti livelli di espressione. Una interessante applicazione diagnostica
di MUC4 è stata recentemente
proposta nell’ambito della diagnosi differenziale tra mesotelioma (MUC4-negativo) e carcinoma sieroso dell’ovaio (MUC4-positivo) (4).
Mucine
secretorie che
formano gel
I
n questo gruppo ci sono le mucine più utilizzate in patologia
(MUC2, MUC5AC, MUC5B, e
MUC6). I geni di queste mucine
sono localizzati sul cromosoma 11
e presentano significative analogie
di funzione e di struttura.
MUC2
Q
uesta mucina è il marker tipico della cellula goblet intestinale. La proteina, che è scarsamente solubile, caratterizza il
denso muco intestinale ed è fondamentale per le funzioni di barriera contro la penetrazione di patogeni intestinali (ad es. la
Entamoeba histolytica aderisce alla
mucina utilizzando una lectina di
170 kD ed è bloccata da questa
interazione), mentre nell’amebiasi l’invasività è determinata dalla
dissociazione del gel del muco intestinale operata dall’azione di
una proteasi MUC2-specifica.
MUC2 è considerata un ottimo
marcatore di differenziazione intestinale (insieme al fattore di trascrizione cdx-2). Elevati livelli di
espressione di MUC2 sono dimostrabili immunoistochimicamente
nelle cellule goblet intestinali, nei
carcinomi dell’intestino, nelle lesioni neoplastiche e pre-neoplastiche che presentano caratteri di
differenziazione intestinale in diversi organi come: ovaio, polmone
e stomaco, metaplasia intestinale
nello stomaco ecc.
Nell’esofago di Barrett, il profilo
di espressione delle mucine contribuisce alla definizione del tipo
di metaplasia (completa, incompleta) e del rischio di sviluppare
un carcinoma (5, 6).
Interessante notare come nei topi
knock-out (Muc2 -/-) sia possible
dimostrare un aumento della proliferazione e della motilità cellulare a livello intestinale, come an-
che il decremento dell’apoptosi.
Queste anomalie sono verosimilmente correlate nei topi Muc2 -/all’elevata frequenza di adenomi e
carcinomi gastrointestinali.
MUC5AC
N
ota come “mucina tracheobronchiale”, viene espressa
anche a livello gastrointestinale (in
particolare nelle foveole gastriche).
Nel polmone normale questa mucina è espressa a livello delle cellule caliciformi (goblet) e ne evidenzia molto precisamente l’incremento a livello bronchiolare in corso di stimolazioni flogistiche.
L’espressione di differenti tipi di
mucina, e in par ticolare di
MUC5AC, è stata utilizzata per distinguere e caratterizzare differenti tipi di adenocarcinoma del polmone. Il carcinoma a cellule con
castone è caratterizzato da elevata
espressione di MUC1, ma modesta
o nulla espressione di MUC5AC.
Il carcinoma bronchiolo-alveolare
mucinoso (m-BAC) è caratterizzato da elevati livelli di espressione di
MUC5AC, mentre MUC1 è assente o ipo-espressa. Questo particolare “profilo” di espressione rappresenta un utile marcatore diagnostico nell’ambito della diagnosi differenziale degli adenocarcinomi del polmone. Questa distinzione è clinicamente rilevante alla luce
della corrispondenza tra fenotipo
mucinoso e peculiari alterazioni
molecolari (assenza di mutazioni di
EGFR, ma presenza di mutazioni
di KRAS), che determinano la predittività sulla risposta a inibitori
delle tirosin-kinasi (7).
Nel pancreas MUC5AC non è
normalmente espressa, ma è rilevabile nel carcinoma duttale e
questa espressione è un utile marcatore diagnostico, specialmente
su prelievi con ago sottile (8). Il
profilo di espressione delle mucine, e in particolare l’espressione
di MUC5 e MUC2, caratterizza
le forme mucinose intraduttali (9).
Espressione aberrante di
MUC5AC caratterizza anche i
processi oncogenetici del grosso
intestino (10).
MUC5B
MUC6
V
definita mucina “gastrica
ghiandolare” a causa del ruolo fondamentale che ricopre nella
protezione della mucosa gastrica
(acidità, proteasi, patogeni e traumi). Livelli significativi di espressione sono però dimostrabili anche
nella cistifellea e, in minor quantità, a livello intestinale, nelle
ghiandole di Brunner. Nel carcinoma gastrico l’espressione di MUC6
è spesso diminuita e la riduzione è
correlata con l’aggressività del tumore. In questo tumore la distin-
ede tra le sue funzioni principali quella di fornire le proprietà visco-elastiche e lubrificanti
alla saliva: è infatti una mucina
espressa nelle ghiandole salivari.
Livelli significativi di espressione
sono dimostrabili anche nei bronchi, nelle ghiandole submucose e
nelle cellule goblet bronchiali, nell’endocervice, nel pancreas e nella
cistifellea. L’epitelio dell’endocervice esprime tre delle mucine secretorie: MUC5AC, MUC5B e
MUC6.
a
b
c
d
È
Figura 1. Espressione di MUC2 [Ab NCL-MUC-2] nel colon (a) e nel digiuno (b);
espressione di MUC4 [Ab NCL-MUC-4] (c) e MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (d) nel digiuno
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zione tra fenotipo “intestinale” e
“gastrico” si basa sull’identificazione di un profilo in cui le mucine sono componenti fondamentali (11). Nel carcinoma dello stomaco, infatti, vengono conservate, anche se eterogeneamente, le mucine
gastriche (MUC1, MUC5AC,
MUC6), ma viene espressa in
modo anomalo MUC2 nelle forme mucinose a differenziazione
intestinale.
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Figura 2. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a, negativa), MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b),
MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] (c) e MUC6 [Ab NCL-MUC-6] (d) in un caso di esofago di Barrett
expression of gastric-type mucins (MUC5AC, MUC6) and
TFF peptides (TFF1 and
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b
c
Figura 3. Espressione di MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC]
nelle cellule goblet bronchiolari (a),
nell’iperplasia a cellule goblet in un bronchiolo
(b) e nel BAC mucinoso (c)
a
b
c
Figura 4. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a),
MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b) e MUC5AC
[Ab NCL-MUC-5AC] (c) in un caso di carcinoma
mucinoso papillare intraduttale del pancreas
