LABORATORIO del 5,03,2014 COLORAZIONE DELLE
annuncio pubblicitario
TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-2014 LABORATORIO del 5,03,2014 COLORAZIONE DELLE CELLULE IN MONOSTRATO CON GIEMSA Introduzione L’esercitazione ha lo scopo di fornire allo studente le conoscenze di base per l’allestimento di una colorazione con Giemsa e l’individuazione delle caratteristiche morfologiche di una coltura di fibroblasti cresciuti in monostrato. Il monitoraggio della morfologia cellulare attraverso colorazioni è essenziale sia per l’analisi dello stato di salute delle cellule nella routine dei passaggi di coltura, sia per la valutazione delle alterazioni morfologiche indotte da specifiche condizioni sperimentali oggetto di studio. Il Giemsa è un colorante policromatico che permette di distinguere le diverse strutture cellulari, colorando di rosa-magenta il nucleo, blu-scuro i nucleoli e grigio-blu (chiaro) il citoplasma. La colorazione va applicata previa fissazione del monostrato in alcool o paraformaldeide. Le fasi per l’allestimento di una colorazione con Giemsa sono: - Fissazione in metanolo - Colorazione con Giemsa - Osservazione al microscopio Approfondimento consigliato: “Visualizzazione delle cellule” capitolo 9, pagine 586-5593, Biologia molecolare della cellula (Alberts et al. Zanichelli), “Primary culture” capitolo 16, pagine 250-252, Culture of Animal Cells (Freshney RI, Wiley –Liss Pub) TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-2014 Materiali e Reagenti necessari - Cellule cresciute in monostrato su Petri dish o Flask - PBS - PBS-metanolo, 1:1 - Soluzione Giemsa - Metanolo puro - Acqua deionizzata - Pipette Pasteur Protocollo - Scartare il medium dalla Petri. - Sciacquare bene il monostrato con PBS e scartare. - Aggiungere 1 mL di PBS-metanolo (1:1), lasciare agire per 2 minuti e scartare. - Risciacquare il preparato con metanolo fresco e scartare. - Aggiungere 0,5 mL di Giemsa puro. - Dopo due minuti aggiungere 1,5 mL di acqua deionizzata e agitare gentilmente per 2 minuti. - Scartare il liquido e risciacquare il preparato gentilmente in acqua corrente per rimuovere la schiuma e i precipitati. Scartare. - Sciacquare con acqua deionizzata, scartare. - Osservare al microscopio. Note: il preparato, una volta asciugato all’aria, può essere conservato in frigo e riosservato previa reidratazione con acqua distillata. Cosa osservare? - Valutazione della confluenza - Riconoscimento morfologia fibroblast-like - Riconoscimento strutture nucleari - Presenza di nucleoli TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-2014 Monostrato di fibroblasti fetali ovini colorato con Giemsa ottenuta al termine dell’esercitazione del 5,03,2014 – 3° anno Biotecnologie – aa 2013-2014
