Lo screening di HCV-RNA su mini-pool di

Lo screening di HCV-RNA su mini-pool di plasma
da singolo donatore: validazione della procedura
ed esperienze preliminari
Paola Iudicone, Manuela Testi, Michelina Miceli, Alessandra Moscetti,
Angela Candido, Carmela Amedeo, Emilio Mannella
Centro Nazionale Trasfusione Sangue - Croce Rossa Italiana - Direttore Dott. E. Mannella
The European Commission for Proprietary
Medicinal
Products
(CPMP)
issued
the
Recommendation 390/97 that requires from 1st July
1999 that all fractionated plasma products must be
derived from plasma pools tested and found to be
negative for HCV-RNA using a validated nucleic acid
amplification technology (NAT). Concern over the
development of different criteria, in terms of safety, for
release of plasma products and blood components led
to consideration of the requirement for HCV-RNA
testing for labile components, too. Amplification of viral
genomes provides a method for viral detection which
is much more sensitive than that of antigen/antibody
assays. These methods allow to detect infectious blood
donations earlier than antigen/antibody assays, thereby
reducing the window period during which infection can
not be detected by currently used screening assays.
The highest benefit of introducing this new technology
in the transfusion setting is expected for HCV, taking
into account the length of the diagnostic window period
for this virus (75 days).
Moreover, the application of NAT to the screening of
blood donations could allow to provide the plasma
derivative manufacturers of pre-tested source material.
The aim of this study was to evaluate the impact of
introducing NAT based screening assay, as a releasing
criterion for blood components, on the work-flow of our
blood centre. The Cobas Amplicor HCV test v 2.0 was
validated according to the guidelines PA/PH/OMCL/ (98)
and introduced as a routine screening. Five thousands
donations were screened by testing pools of 10
samples. Five pools were found reactive for both HCVRNA and anti-HCV antibody screenings, whereas no
viremic but seronegative blood donor was found.
Work is in progress by investigating the Cobas
Ampliscreen HCV test which has been designed to
Ricevuto: 10 febbraio 2000 - Accettato: 30 marzo 2000
Corrispondenza:
Dott.ssa Paola Iudicone
Centro Nazionale Trasfusione Sangue - Croce Rossa Italiana
Via B. Ramazzini 15
00151 Roma
194
screen pools of plasma samples, currently for detection
of HCV-RNA. The near future this test will be extended
to other agents such as HIV-1 and likely HBV.
Parole chiave: HCV-RNA screening , sicurezza degli
emocomponenti, plasma mini-pool
Key words:NAT screening, blood safety, plasma mini-pool
Introduzione
Il virus dell'epatite C (Hepatitis C Virus, HCV) è
considerato il principale agente eziologico dei casi di epatite
non-A non-B post-trasfusionale. La causa è da attribuirsi
soprattutto ad un "periodo di finestra diagnostica"
precedente la sieroconversione che può durare fino a oltre
due mesi, periodo in cui non sono ancora presenti in circolo
gli anticorpi specifici rilevabili con i test di screening
indiretti1. La recente disponibilità di test basati sulla tecnica
di amplificazione degli acidi nucleici (Nucleic Acid
Amplification Technology, NAT) consente, invece, di
accertare precocemente un'infezione da HCV con
conseguente riduzione del periodo di "finestra diagnostica"
fino a 15-20 giorni2-4. L'introduzione di questa metodologia
nello screening delle donazioni può, quindi, consentire
un'ulteriore riduzione del rischio residuo di trasmissione di
HCV, aumentando la sicurezza degli emocomponenti
destinati a terapia trasfusionale5,6. Inoltre, l'elevata carica
di genomi virali nella fase precoce dell'infezione da HCV e
l'elevata sensibilità dei test molecolari può consentire la
loro applicazione non necessariamente a singoli campioni,
ma anche a pool costituiti da più campioni7-10. Pool costituiti
da numeri elevati di unità sono, infatti, utilizzati dalle
industrie produttrici di plasma derivati che eseguono il test
per la ricerca di HCV-RNA, prima di avviare il plasma alla
lavorazione, come previsto in Italia dal DM 29 marzo 1999
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45 - num. 4 luglio - agosto 2000 (194-200)
Screening HCV-RNA su mini-pool di plasma
che ha recepito la Raccomandazione del CPMP/BWP 390/97.
Le metodiche impiegate per la rilevazione di HCV-RNA e la
loro eventuale applicazione a pool costituiti da diversi
campioni necessitano, tuttavia, di una procedura di
validazione prima di essere introdotte in attività di routine,
come indicato dalla Linea Guida del Consiglio d'Europa
PA/PH/OMCL (98) 22 (Guidelines for validation of nucleic
acid amplification technology for detection of hepatitis
C virus RNA in plasma pool). In questo studio, il test
Roche Amplicor Hepatitis C Virus versione 2.0 modificata
è stato validato secondo le Linee Guida del Consiglio
d'Europa ed è stata avviata una esperienza preliminare di
applicazione del test NAT-HCV allo screening di 5.000
unità di sangue testate in pool costituiti da 10 campioni.
Materiali e metodi
amplificazione che di rilevazione dell'acido nucleico
bersaglio. Utilizzando kit commerciali questi parametri sono
definiti dalle ditte produttrici del test. È tuttavia garanzia
per l'operatore verificare la specificità del test analizzando
nel proprio laboratorio almeno 100 campioni HCV-Ab
negativi e HCV-RNA negativi e confermarli non reattivi. A
questo scopo, 100 campioni di plasma risultati HCV-Ab
negativi e non reattivi per HCV-RNA utilizzando la metodica
TMA (Transcription Mediated Assay, Chiron Gen-Probe,
Emeryville, CA, USA) sono stati testati con il kit Roche
Amplicor versione 2.0 modificata. La metodica TMA,
rispetto alla metodica Roche, utilizza diversi metodi di
estrazione (cattura su microparticelle magnetiche),
amplificazione (sintesi di nuove catene di RNA a opera
della T7 RNA polimerasi su un DNA copia dell'RNA
bersaglio retrotrascritto mediante la trascrittasi inversa
MMLV) e rilevazione (chemiluminescenza mediante test di
protezione degli amplificati ibridati).
Validazione del metodo
Per la rilevazione di HCV-RNA in pool di plasma è stato
impiegato un test analitico qualitativo per la cui validazione,
come previsto dalle Linee Guida, sono state valutate: la
specificità, il limite di rilevazione, la robustezza del metodo
e la cross-contaminazione, quest'ultima legata soprattutto
alla manualità degli operatori.
- Kit utilizzato - HCV-RNA Roche Cobas Amplicor
versione 2.0 modificata (Roche Molecular System,
Branchburg, NJ, USA) con l'introduzione di uno step di
ultracentrifugazione.
- Standard - Working reagent: HCV-RNA 0498 ISS
Roma (1698 UI/mL 1b)11 calibrato contro lo standard
internazionale del WHO12.
- Plasma-Pool - La dimensione del pool da testare ai
fini dello screening per HCV-RNA è stata valutata per
un massimo di 20 campioni, considerato il numero di
campioni che afferisce giornalmente presso il laboratorio
di Sierologia del CNTS-CRI e l'esigenza di non bloccare
un numero elevato di unità in caso di pool reattivi.
Pertanto per la validazione è stata preparata una matrice
costituita da 20 campioni di plasma in EDTA negativi
sia per gli anticorpi anti-HCV che per HCV-RNA. Il pool
è stato utilizzato per diluire lo standard e come pool
negativo di riferimento.
Limite di rilevazione (cut-off)
E' indicato dalla Farmacopea come il numero minimo di
sequenze target rilevabili nel 95% dei test eseguiti. A tale
scopo sono stati testati 24 replicati di 4 serie di diluizioni
dello standard HCV-RNA 0498. Le concentrazioni dello
standard da utilizzare nelle prove di validazione sono state
definite sulla base dei risultati di prove preliminari di
sensibilità del kit in uso. Lo standard è stato diluito nel
"plasma-pool matrice" alle seguenti concentrazioni: 31,7
UI/mL; 10 UI/mL; 3,17 UI/mL; 1 UI/mL. I risultati ottenuti
sono stati analizzati mediante analisi statistica con il metodo
dei probit per il calcolo del cut-off.
Parametri esaminati
Robustezza
È intesa come la capacità della procedura di restare
inalterata a seguito di piccole variazioni introdotte nella
procedura stessa. In particolare, è stato necessario validare
la robustezza della metodica Roche Amplicor versione 2.0
modificata a seguito dell'introduzione dello step iniziale di
ultracentrifugazione testando, in un'unica seduta, 20
campioni HCV-RNA positivi- HCV Ab negativi. A questo
scopo, è stato utilizzato lo standard HCV-RNA 0498 che,
diluito 1:4 nel plasma-pool matrice, risultava negativo al
test per la rilevazione di anticorpi anti-HCV ma positivo per
HCV-RNA.
Lo standard è stato testato alle seguenti concentrazioni
di HCV-RNA: 169 UI/mL (4 replicati); 106 UI/mL (7 replicati);
84,9 UI/mL (9 replicati).
Specificità
La specificità di un test analitico NAT dipende
essenzialmente dalla scelta dei primers e dei probes e dalle
condizioni di stringenza del test sia nella fase di
Cross-contaminazione
È intesa come l'affidabilità nel processare campioni
positivi e negativi senza contaminare quest'ultimi,
producendo risultati falsi positivi. A questo scopo sono
195
P. Iudicone et al.
stati testati 10 plasma-pool HCV-RNA negativi (plasmapool matrice) alternati a 10 plasma-pool negativi (plasmapool matrice) infettati con un campione HCV-RNA positivo
(53.843 gEq/mL, test HCV Monitor Roche, diluito 1:10
raggiungendo una concentrazione finale di 5.384 gEq/mL).
I campioni sono stati testati in un'unica seduta.
Biohazard dedicata impiegando materiale sterile e RNAse-free.
I campioni primari erano conservati a 4 °C per almeno 3 giorni.
Area pre-amplificazione
Lo screening di cui sono riportati i risultati è riferito al
bimestre agosto-settembre 1999. Considerata la riduzione
dei prelievi durante il periodo estivo e quindi la limitata
disponibilità di emocomponenti, si è valutato di procedere
alla ricerca di HCV-RNA in pool di plasma costituiti da 10
campioni. Lo screening per HCV-RNA è stato condotto in
parallelo allo screening sierologico delle unità di sangue.
Quest'ultimo è stato eseguito mediante dosaggio
immunoenzimatico a cattura di microparticelle (MEIA)
utilizzando il sistema Axsym (Abbott, Chicago, ILL, USA).
I campioni risultati positivi o borderline al test di screening
sierologico (zona grigia: ratio: S/CO≥0,7≤1,0) sono stati
confermati mediante dosaggio immunoblot utilizzando il
test CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA. (Ortho-Clinical
Diagnostics, Raritan, NJ, USA).
Per lo screening di HCV-RNA è stato impiegato il kit
HCV-RNA Roche Amplicor versione 2.0 modificato. Il test
è stato eseguito secondo le istruzioni del fornitore
lavorando in cappa Biohazard e utilizzando strumentazione
dedicata e materiale sterile e RNAse-free.
In breve, viene eseguita manualmente la fase di
preparazione del campione che prevede:
- concentrazione del virus eventualmente presente nel
campione mediante ultracentrifugazione 1 h , 4 °C, 24.000g;
- lisi delle particelle virali mediante l'uso di guanidina
isotiocianato in tampone Tris-HCl con estrazione degli
acidi nucleici, precipitazione in isopropanolo e
risospensione di HCV-RNA in appropriato diluente;
- distribuzione dei campioni e della miscela di
amplificazione in apposite provettine di amplificazione
("A-ring" - Roche).
I campioni di estratti di acido nucleico erano congelati
a –20 °C per 1 settimana prima di essere eliminati.
Area preparazione campione
Area di amplificazione e post-amplificazione
Non essendo ancora disponibile il preparatore con
apposito software per la distribuzione automatica dei
campioni con formazione e identificazione dei plasma-pool,
i pool sono stati preparati manualmente inserendo tutti i
campioni pervenuti quotidianamente nel nostro laboratorio
secondo il seguente schema operativo:
- accettazione campioni raccolti in EDTA e conservati a
temperatura ambiente se inviati entro le sei ore dal
prelievo; in EDTA o in tubi PPT e conservati a 4 °C
(Becton Dickinson, Heidelberg, D), se inviati dopo le 6
ore dal prelievo;
- centrifugazione dei campioni 20' a 2.800 rpm;
- lettura dei bar-code dei campioni e stampa della relativa
lista di lavoro
- assegnazione dei campioni al relativo pool da 10 con
identificazione dello stesso mediante apposito barcode; ai fini della tracciabilità, il bar-code del pool era
applicato sulla provetta e sulla corrispondente lista di
lavoro in cui erano identificati i singoli campioni
componenti il pool;
- prelievo di aliquote da 100 µL di plasma da ogni singolo
campione per formare il pool da 10 raggiungendo il
volume finale di 1 mL richiesto dalla metodica;
- invio dei pool all'area di pre-amplificazione e avvio della
procedura analitica.
La preparazione del pool è stata effettuata in cappa
Le fasi successive di amplificazione e rilevazione sono
automatizzate nello strumento Roche Cobas Amplicor e
prevedono:
- retrotrascrizione RNA⇒ cDNA;
- amplificazione del cDNA mediante reazione a catena
mediata dalla polimerasi (PCR, Polymerase Chain
Reaction) utilizzando primers biotinilati;
- reazione di ibridazione con probes specifici legati a
microparticelle magnetiche;
- rilevazione colorimetrica mediante ossidazione
catalizzata dalla perossidasi del substrato TMB (3,3',5,5'tetrametilbenzidina) con formazione di un prodotto
colorato la cui assorbanza è misurata a 660 nm.
Il sistema automatico non richiede l'intervento
dell'operatore e consente pertanto l'esecuzione di sedute
overnight.
Screening HCV-RNA dei plasma-pool
196
Controlli e validazione della seduta analitica
-
In ogni seduta analitica sono stati inseriti:
1 controllo positivo del kit;
1 controllo negativo del kit;
1 run control (standard 0498 ad una concentrazione
pari a tre volte il cut-off) che viene analizzato con le
stesse modalità operative dei campioni in esame dalla
Screening HCV-RNA su mini-pool di plasma
Figura 1: valutazione del cut-off mediante analisi statistica con il metodo dei Probit. In ascissa sono riportati in scala
logaritmica le concentrazioni di HCV-RNA espresse in UI/mL. In ordinata il calcolo statistico dei Probit
fase di preparazione del campione a quella di rilevazione.
Ad ogni campione è stato aggiunto un controllo
interno che segue tutte le fasi di lavorazione (estrazione,
amplificazione, rivelazione), consentendo di monitorare
l'intero processo operativo e, in particolare, la presenza di
inibitori della reazione di amplificazione. Ai fini della
validazione della seduta analitica, il controllo positivo e il
run control devono risultare positivi; il singolo campione
è accettato negativo se il suo controllo interno risulta
positivo. I campioni negativi sono stati rilasciati entro le 24
h dal prelievo.
validazione hanno mostrato per le 4 concentrazioni di
standard utilizzate (31,7 - 10 – 3,17 e 1 UI/mL)
rispettivamente 24 replicati positivi su 24 per la prima
concentrazione, 19 per la seconda, 16 per la terza e 4 per
la quarta (sempre su 24).
Sulla base dei suddetti risultati, per ogni diluizione di
standard saggiata è stata calcolata la percentuale di
positività e individuato il rispettivo valore di Probit.
Dalla regressione libeare "Probit = a+b log dose", il
limite di rilevabilità è stato calcolato secondo la formula:
dose 95% = Probit 95% - Intercetta/Pendenza
Risoluzione di pool reattivi
Nel caso di pool reattivo, considerate le sue piccole
dimensioni, non è stato adottato il sistema dei pool intermedi
o della matrice bidimensionale, ma si è proceduto direttamente
al test sui singoli campioni costituenti il pool, al fine anche di
rilasciare in tempi brevi le unità di sangue bloccate.
Risultati
Validazione
- Limite di sensibilità: i risultati relativi al protocollo di
Il limite di rilevazione (cut-off) è stato calcolato pari a 23
UI/mL (Figura 1), che rappresenta la concentrazione di HCVRNA rilevabile nel 95% dei casi.
- Robustezza: i campioni sono risultati, come atteso, tutti
positivi.
- Cross-contaminazione: analizzando campioni HCV-RNA
positivi alternati a campioni HCV-RNA negativi non è
stata osservata contaminazione dei campioni negativi
e, quindi, non sono stati rilevati campioni falsi positivi.
- Specificità: i 100 campioni di plasma HCV-Ab negativi e
HCV-RNA non reattivi in TMA si sono confermati
negativi con il test Roche Amplicor 2.0.
197
P. Iudicone et al.
Figura 2: risultati dello screening NAT HCV-RNA su 5.000
donazioni e confronto con i risultati dello screening
sierologico
Figura 3: risultati dello screening sierologico e del test di
conferma dei 5 campioni in cui è stata rilevata
la presenza di HCV-RNA
Figura 4: risultati relativi e al test di conferma dei campioni
risultati positivi allo screening sierologico e
negativi allo screening NAT-HCV
Figura 5: risultati relativi al test di conferma dei campioni
risultati borderline allo screening sierologico e
negativi allo screening NAT-HCV
Screening HCV-RNA
I risultati relativi allo screening sierologico e allo
screening NAT HCV-RNA sono riassunti in figura 2. Dei
500 pool testati (5.000 unità di sangue) sono stati identificati
sei pool reattivi e di questi un falso positivo; quest'ultimo
è risultato negativo ripetendo il test sia sull'acido nucleico
già estratto e conservato overnight a –20 °C, sia estraendo
nuovamente l'acido nucleico dal pool fresco, ripreparato
dai campioni primari opportunamente conservati. I cinque
pool reattivi sono stati risolti testando direttamente i
campioni primari componenti il pool e identificando il
campione reattivo. Tutti i campioni positivi in HCV-RNA si
sono confermati positivi anche allo screening sierologico
e al test di conferma (Figura 3). Sette campioni sono risultati
positivi allo screening sierologico e negativi per la presenza
di RNA; di questi, il test di conferma evidenziava un
campione positivo, quattro indeterminati e due negativi
(Figura 4). Cinque campioni risultati borderline al dosaggio
MEIA e negativi per HCV-RNA, al test di conferma
risultavano due indeterminati e tre negativi (Figura 5).
198
Screening HCV-RNA su mini-pool di plasma
Nessun campione è risultato positivo per HCV-RNA e
negativo alla ricerca di anticorpi anti-HCV.
Discussione
L'introduzione della Raccomandazione CPMP/BWP/
390/97 che prevede la rilevazione di HCV-RNA con metodica
NAT nei pool di plasma destinati alla produzione di
plasmaderivati ha suscitato una serie di problematiche
prevalentemente di carattere medico legale e riflessioni di
carattere etico nell'ambito delle strutture trasfusionali.
Sebbene il rischio di trasmissione di HCV sia più elevato
nel caso di terapie con plasmaderivati rispetto alle terapie
con emocomponenti di pronto impiego poiché il numero di
unità di plasma che compongono il pool destinato alla
lavorazione è piuttosto grande, non è tuttavia accettabile
che diversi livelli di prevenzione per le malattie trasmissibili
siano adottati per prodotti terapeutici derivanti da uno
stesso materiale biologico di partenza.
In Germania, l'applicazione della Raccomandazione è
stata, infatti, estesa fin dall'inizio agli emocomponenti di
pronto impiego e la maggior parte dei paesi europei si è
successivamente orientata in questa direzione.
Indubbiamente, i test molecolari applicati allo screening
costituiscono un'evoluzione tecnologica che potrà
consentire un'ulteriore riduzione del rischio trasfusionale.
Sono, tuttavia, complessi i problemi di gestione, fattibilità
e costi connessi all'applicazione di queste metodologie
affiancate allo screening sierologico per la validazione
biologica dell'unità di sangue11-16.
L'introduzione della metodica NAT-HCV come test di
screening presso il nostro centro è stata iniziata con la
costituzione di un gruppo di operatori con esperienza nel
campo della biologia molecolare e della sierologia.
L'integrazione delle rispettive esperienze ha consentito di
cominciare a confrontarsi con le problematiche di
applicazione di un test molecolare allo screening di routine.
Il metodo NAT impiegato è stato validato secondo le Linee
Guida specifiche ed è risultato molto sensibile, considerato
il cut-off calcolato pari a 23 UI.
Introdotto, quindi, nello screening di routine per la
ricerca di HCV-RNA, ha consentito di evidenziare cinque
campioni positivi che, tuttavia, risultavano positivi anche
per la presenza di anticorpi anti-HCV. Non è stato rilevato
alcun campione positivo per HCV-RNA e negativo allo
screening sierologico, come peraltro atteso, considerato il
numero limitato di campioni testati. Dal punto di vista
operativo, la strutturazione del laboratorio, della turnazione
degli operatori e dell'interfaccia con i centri di prelievo e i
centri di distribuzione degli emocomponenti ha richiesto
un attento lavoro organizzativo, mirato a garantire
comunque la disponibilità degli emocomponenti labili in
tempo utile.
Attualmente, stiamo procedendo all'applicazione di un
preparatore con apposito software di gestione per la
preparazione dei mini-pool al fine di sostituire la
preparazione manuale, impegnativa sul piano operativo e
non esente da rischi di errore, con un sistema automatico
aumentando a 20 il numero dei campioni costituenti il pool.
L'impatto economico di questa nuova applicazione
necessita certamente di una valutazione costo-beneficio,
che al momento è forse prematura. È rilevante l'approccio al
test molecolare, considerata l'elevata sensibilità di queste
indagini, utilizzando mini-pool, poiché consente una
notevole riduzione dei costi, a fronte, però, di
un'organizzazione centralizzata per l'esecuzione del test.
L'esecuzione del test NAT su mini-pool richiede, infatti, la
lavorazione di un numero consistente di campioni per
costruire un numero adeguato di plasma-pool che consenta
di evitare sprechi di reattivi.
A questo scopo, il numero ottimale di pool da testare in
ciascuna seduta analitica è nove, pari a 90 campioni per
pool da 10 e 180 campioni per pool da 20. È, inoltre,
auspicabile una riduzione dei costi del test stesso
nell'eventualità di una sua estensione a livello di screening,
come anche una sua ulteriore automazione.
Test molecolari destinati specificamente allo screening
sono già in fase di validazione presso l'ISS e sono già
proiettati all' estensione della ricerca del genoma virale,
oltre che del virus dell'epatite C, anche di altri virus rilevanti
in campo trasfusionale.
In proposito abbiamo iniziato la sperimentazione del kit
Ampliscreen Roche realizzato specificamente per lo
screening di mini-pool di plasma da singolo donatore, per
la rilevazione di HCV-RNA e prossimamente di HIV-RNA.
La sfida successiva sarà l'approccio al virus dell'epatite B,
che ancora pone seri problemi in ambito trasfusionale, e
probabilmente a nuovi virus emergenti. Non si può,
pertanto, trascurare l'apporto che può offrire il progresso
nel campo della biologia molecolare virale anche alla
problematica della sicurezza della terapia trasfusionale,
obiettivo quest'ultimo che non si può mai considerare
definitivamente raggiunto, ma che richiede, invece, una
costante e continua attenzione.
Riassunto
La Raccomandazione CPMP/BWP/390/97, che ha introdotto dal 1 luglio 1999 la rilevazione di HCV-RNA
con metodica NAT nei pool di plasma destinati alla produzione di emoderivati, ha suscitato una serie di
problematiche prevalentemente di carattere medico legale e riflessioni di carattere etico nell'ambito delle strutture trasfusionali.
In questo studio il test di amplificazione degli acidi
nucleici (NAT) per la rilevazione di HCV-RNA è stato
introdotto, dopo opportuna validazione, nello screening
199
P. Iudicone et al.
di routine al fine di cominciare a confrontarsi con le
problematiche di applicazione di test molecolari allo
screening per la validazione degli emocomponenti di pronto impiego.
Il test è stato eseguito su pool di plasma costituiti da
10 campioni. Sono stati testati 5.000 campioni e sono
stati rilevati 5 campioni positivi che, tuttavia, risultavano positivi anche allo screening di base per la ricerca di
anticorpi anti-HCV.
È attualmente iniziata la sperimentazione del kit
Ampliscreen Roche, realizzato specificamente per lo
screening di mini-pool di plasma da singolo donatore
per la rilevazione di HCV-RNA e, in un prossimo futuro,
di HIV-RNA e HBV-DNA..
Ringraziamenti
Gli AA ringraziano il Dott. G. Gentili, il Dott. G. Pisani e
il Dott.G.M. Bisso del Laboratorio di Immunologia dell'ISS
per la disponibilità e fattiva collaborazione.
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