histo type b27 - Astraformedic

- PRONTE ALL’USO, PREALIQUOTATE Istruzioni d’uso
HISTO TYPE B27
0123
Kit per la tipizzazione degli alleli B*27
in biologia molecolare
IVD
48 Tipizzazioni / REF 7070
96 Tipizzazioni / REF 7071
Indice:
1. Introduzione
2
1.1 Significato clinico del B27
2
1.2 Principio del test
2
2. Materiali
3
2.1 Contenuto HISTO TYPE B27 Kit
3
2.2 Materiale necessario supplementare
3
2.2.1 Reagenti
3
2.2.2 Strumentazione
3
2.3 Conservazione e stabilità
4
3. Dati per l'esecuzione
4
4. Procedura del test
4
4.1 Condizioni di sicurezza e indicazioni speciali
4
4.2 Estrazione del DNA
5
4.3 Amplificazione
5
4.4 Procedura del test
5
4.5 Gel Elettroforesi
6
4.6 Documentazione
7
5. Interpretazione
7
6. Avvertenze e precauzioni
7
7. Risoluzione del problemi
8
8. Referenze
8
9. Spiegazione dei simboli usati sulle etichette
9
Versione: 07/2011
BAG Health Care GmbH
Amtsgerichtsstraße 1-5
Tel.: +49(0) 6404/ 925- 0
35423 Lich/Germany
Fax: +49(0) 6404/ 925- 250
www.bag-healthcare.com
[email protected]
Auftragsannahme/Ordering:
Tel.: +49(0) 6404/ 925- 450
Fax: +49(0) 6404/ 925- 460
[email protected]
Customer Service:
Tel.: +49(0) 6404/ 925- 125
Fax: +49(0) 6404/ 925- 421
[email protected]
1. Introduzione
1.1 Significato clinico del B27
Sono state riconosciute relazioni tra determinati HLA e determinate malattie per più di 40
combinazioni diverse. La più significatva è la relazione tra l’HLA-B27 e il quadro clinico di artriti
sieronegative (malattia di Bechterew, malattia di Reiter, artriti reattive). Un risultato HLA-B27
positivo viene associato ad un rischio di malattia molto elevato (vedi Tabella 1) [1, 2]. In
particolare, un risultato diagnostico confermato di HLA-B27 contribuisce in modo rilevante alla
terapia del paziente in casi incerti di malattia di Bechterew.
Malattia
Frequenza del B27 nei pazienti
Rischio relativo
Spondilite Anchilosante (malattia di Bechterew)
90.2 %
91
Malattia di Reiter
78.8 %
37.6
Artrite reattiva post-infezione
70.2 %
Tabella 1: HLA-B27 Frequenze e rischi.
1.2 Principio del test
L’uso della Polymerase Chain Reaction (PCR) nella tipizzazione HLA è diventato di routine
negli ultimi anni. Il sequenziamento degli alleli HLA [3] ha reso possibile una tipizzazione
specifica e positiva a livello del DNA con una risoluzione più alta con molti vantaggi rispetto ai
tradizionali metodi sierologici. Il materiale di partenza per la tipizzazione con l’HISTO TYPE B27
è il DNA leucocitario purificato. Il test si basa sul metodo Sequence Specific Primer (SSP) PCR
(vedi Fig. 1). Questo metodo si basa su fatto che la riuscita della PCR dipende dall’esatto
match di entrambi i primers in particolare all’estremità 3’ [4]. Perciò l’amplificazione avviene solo
se i primers sono complementari alla sequenza target, e
di seguito è evidenziata
dall’elettroforesi del gel di agarosio.
Match esatto  Amplificazione
(Allele specifico)
Mismatch  Nessuna Amplificazione
(Allele non specifico)
Fig. 1: Principio dell’ SSP-PCR
I primers specifici sono stati selezionati in modo che vengano riconosciuti i sottotipi più frequenti
(*2701-17, 19-21, 24-28, 30-32, 34-64N,65N,66N-79). Inoltre ogni reazione contiene una coppia
di primer di controllo che devono sempre dare origine ad un’amplificato.
Se questa banda è mancante è stato fatto un errore di semina oppure il DNA conteneva
sostanza inibitorie (vedi Soluzione dei problemi); in questo caso il test non può essere
HISTO TYPE B27
Pagina 2 di 9
interpretato! Per ogni test, è necessario un pozzetto di reazione nel quale sono stati
prealiquotati reagenti liofilizzati. Il volume finale è di 10 µl.
2. Materiali
2.1 Contenuto dell’HISTO TYPE B27 Kit
6 (12) strisce di HISTO TYPE (ciascuna contenente 8 provette da PCR a parete sottile)
sufficienti per 48 (96) tipizzazioni HLA-B27. I reagenti prealiquotati e liofilizzati
contengono primers allele specifici, i primers del controllo interno (specifici per il gene
G3PDH umano) e i nucleotidi.
1.0 ml 10x PCR buffer
Istruzioni d’uso.
2.2 Materiale necessario supplementare
2.2.1 Reagenti
BAG EXTRA-GENE Kit (facoltativo) per l’estrazione del DNA da sangue / linfociti /
leucociti / o materiale per estrazione del DNA con altri metodi.
Taq polymerase (5 U/µl) , (Perkin Elmer).
Agarosio.
Buffer TBE 0.5 x (45 mM di tris, 45 mM di acido borico, 0.5 mM di EDTA ).
DNA-length standard (Codice 7097).
Etidio bromuro (EtBr).
2.2.2 Strumentazione
Termociclatore (per es. PTC 200-96V con ”Hot Bonnet”; BioRad).
Cella elettroforetica con pettini e alimentatore (200 - 300 V, 200 mA).
Transilluminatore UV (220 - 310 nm).
DNA-length standard (Codice 7097).
Macchina fotografica (per es. sistema Polaroid) con pellicole (Polaroid Tipo 667).
Pipette (0.5 - 250 µl) e puntali sterili con filtro.
HISTO TYPE B27
Pagina 3 di 9
2.3 Conservazione e stabilità
I kits sono consegnati senza ghiaccio secco. Al ricevimento, conservare tutti i kits a –20/-80°C
al buio. La data di scadenza indicata sull’etichetta esterna si riferisce a tutti i reagenti contenuti
nel kit ed è valida anche dopo il primo utilizzo. Scongelare a temperatura ambiente il PCR
buffer 10x prima dell’uso.
3. Dati per l’esecuzione
Sensibilità analitica:
Una tipizzazione attendibile viene garantita usando 40 -80 ng di DNA per
ciascuna mix di reazione.
Specificità diagnostica: La composizione della misela dei primer garantisce un’identificazione
attendibile dei sottotipi B27 (basata sui dati delle ultime sequenze)
indicata nel principio del test (Capitolo 1). Gli aggiornamenti saranno
effettuati regolarmente.
Per ogni lotto la specificità del primer mix è stata verificata con DNA di campioni di riferimento.
E’ stato eseguito uno studio della performance dell’ HISTO TYPE B27 kit con almeno 50
campioni di DNA. I risultati confrontati con quelli ottenuti mediante kit SSP di un altro fornitore,
non mostrano discrepanze.
4. Procedura del test
4.1 Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali
La PCR è un metodo particolarmente sensibile e dovrebbe essere eseguito da personale
debitamente addestrato con esperienza in tecniche di genetica molecolare e di istocompatibilità.
Per ridurre i rischi di false tipizzazioni dovrebbero essere seguite le linee guida dei trapianti così
come gli standard EFI , in particolare nei casi di discrepanza tra il metodo sierologico e quello
molecolare .
Si devono osservare condizioni speciali di sicurezza per evitare contaminazioni e perciò false
reazioni:
Indossare sempre i guanti durante il lavoro (se possibile senza polvere).
Usare un nuovo puntale per ogni semina (con filtro integrato).
Lavorare in due aree separate per la pre-amplificazione (estrazione del DNA e preparazione delle reazioni) e post-amplificazione (elettroforesi del gel e documentazione).
Preferibilmente usare due stanze separate.
Usare strumentazione e altro materiale solo nelle rispettive aree e non scambiarli.
HISTO TYPE B27
Pagina 4 di 9
4.2 Estrazione del DNA
Per la tipizzazione di un paziente sono richiesti ca. 50 ng di DNA. Per es. il BAG EXTRAGENE kit è ideale per l’estrazione poichè il DNA da sangue intero lo si può ottenere in breve
tempo senza usare reagenti chimici tossici o solventi. Inoltre, altri metodi descritti in letteratura
[5] come il metodo chloroform-triethyl-ammonium-bromide (CTAB) o la purificazione fenolocloroformio sono idonei per fornire una sufficiente purezza del DNA, così come kit commerciali
per estrazione su colonna o tramite biglie. La presenza di eparina potenzialmente inibisce la
PCR [6]. Perciò per la tipizzazione si consiglia sangue in EDTA o in citrato. Il DNA dovrebbe
avere una purezza (extinction ratio OD260/OD280 ) tra 1.5 e 2.0.
4.3 Amplificazione
Tutte le mix prealiquotate e liofilizzate contengono i primers allele specifici, i nucleotidi e i
primers per il controllo interno dell’amplificazione. I parametri di amplificazione sono ottimizzti
ad un volume finale di 10 µl.
4.4 Procedura del test
Prelevare dal congelatore il numero richiesto di piastre HISTO TYPE B27 e scongelare il 10x
PCR buffer.
I. Miscela Taq-buffer-H2O: 0.08 µl
1.0 µl
7.0 µl
Taq polymerase (5 U/µl) per n. di determinazioni + 1
(0.5 U per reazione)
PCR buffer 10 x
per n. di determinazioni + 1
H2O
per n. di determinazioni + 1
miscelare con attenzione ed aggiungere 8,0 µl della soluzione ad ogni pozzetto di reazione.
II. Aggiunta del DNA:
2.0 µl
Soluzione di DNA (20-40 ng/µl) nel corrispondente
pozzetto di reazione
Successivamente chiudere la provetta con il tappino facendo attenzione a non premere troppo.
Assicurarsi che la miscela di reazione si trovi depositata sul fondo del pozzetto! Se si usa un
coperchio termostatato non è necessario aggiungere olio minerale all’interno delle provette!
III. Mettere le provette di reazione nel termociclatore (controllare che siano sistemate
correttamente!)
HISTO TYPE B27
Pagina 5 di 9
V. Avvio del programma PCR
Parametri di amplificazione
Programma
Tempo
Temp. Numero di cicli
Tipi di termociclatore:
Prima denaturazione
5 Min
96°C
1 ciclo
PTC100 / 200-96V
Denaturazione
20 Sec
96°C
5 cicli
(MJ Research / BioRad),
Annealing+Estensione
60 Sec
68°C
Denaturazione
20 Sec
96°C
Annealing
50 Sec
64°C
Estensione
45 Sec
72°C
Denaturazione
20 Sec
96°C
Annealing
50 Sec
61°C
9600) (ABI) e Mastercycler
Estensione
45 Sec
72°C
epGradient S (Eppendorf)
Estensione finale
5 Min
72°C
GeneAmp PCR10 cicli
System 9600 / 9700
(utilizzare per favore
15 cicli
modalità di riscaldamento
1 ciclo
Con termociclatori che hanno una velocità elevata di raffreddamento e riscaldamento, si
consiglia comunque di utilizzare un programma di ramping a velocità inferiore.
Poichè i termociclatori di produttori diversi hanno performance diverse ed anche i
singoli apparecchi dello stesso tipo possono funzionare in modo diverso, potrebbe
essere necessario ottimizzare i parametri di amplificazione.
Per ottimizzare il Vs. apparecchio seguire le istruzioni seguenti:
Con reazioni false positive (bande non specifiche, additional types): aumentare la temperatura
di annealing di 1°C .
Con reazioni false negative (bande assenti): diminuire la temperatura di annealing di 1°C e/o
aumentare i tempi di annealing di 5 secondi e/o aumentare i tempi di denaturazione di 5
secondi.
Si consiglia di usare solo termociclatori regolarmente calibrati. Per questo il BAG-Cycler
Check kit è ideale (Codice 7104).
I test per il controllo di qualità sono stati eseguiti su un PTC-100/200 (MJ Research),
9700 (ABI) e Mastercycler epGradient S (Eppendorf)
4.5 Gel elettroforesi
La separazione per la valutazione dei prodotti di amplificazione si effettua tramite gel di
agarosio con un elettroforesi orizzontale. Si consiglia come tampone per l’elettroforesi TBE 0,5
x (45 mM di tris, 45 mM di acido borico, 0.5 mM di EDTA). La concentrazione del gel dovrebbe
essere 2.0 - 2.5% di agarosio. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti prima di
caricare il campione. Al termine dell’amplificazione, prelevare i campioni dal termociclatore e
HISTO TYPE B27
Pagina 6 di 9
caricare con attenzione ciascuna miscela di reazione in ogni pozzetto del gel. Inoltre caricare il
DNA length standard per la valutazione del peso molecolare. La corsa elettroforetica è eseguita
a 10-12 V/cm (con elettrodi distanti 20 cm, 200-240 V circa) per 20-40 min. Al termine della
corsa il gel viene immerso per 30 - 45 minuti in una soluzione di etidio bromura (appross. 0.5
µg/ml di EtBr in H2O o TBE buffer). In alternativa, l’EtBr (0.5 µg/ml) può essere aggiunto al
buffer per elettroforesi o al gel di agarosio. Se necessario, il gel può essere decolorato per ca.
20 - 30 minuti in H2O.
4.6 Documentazione e valutazione
Per la documentazione porre il gel su un transilluminatore UV (220-310 nm) e fotografare con una
macchina fotografica, un filtro e una pellicola adatti (per es. polaroid con pellicole 667). Scegliere i tempi
di esposizione e di apertura in modo che le bande siano ben visibili e risaltino sullo sfondo scuro (per
esempio apertura 11, tempo di esposizione 1 secondo).
5. Interpretazione
Sono da considerare positive solo le bande che hanno un peso molecolare di 420 bp e/o 85 bp
in confronto al DNA length standard. Nei casi in cui non c’è un’amplificazione specifica, il
controllo interno deve essere a 1070 bp. Nei campioni che mostrano una reazione specifica, il
controllo interno può apparire più debole o sparire completamente! Per risultati che non
possono essere interpretati, vedere 7. Soluzione dei problemi.
6. Avvertenze e precauzioni
L’etidiobromuro è un potente mutageno. Indossare i guanti quando si maneggiano i gels o
soluzioni contenenti EtBr! Fare riferimento alle istruzioni, alle avvertenze e alle precauzioni
d’uso del produttore! Il transilluminatore UV emette onde molto corte che possono causare
bruciature alla pelle e alla retina. Usare una maschera per la protezione facciale UV!
Tutti i materiali biologici impiegati per l’estrazione del DNA, per es. sangue o tessuto umano, devono
essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate
quando si maneggiano materiali biologici (non pipettare con la bocca; indossare
guanti monouso
quando si maneggia materiale biologico e si esegue il test; al termine del test disinfettare le mani).
Il materiale biologico deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave). Il materiale
smaltito deve essere autoclavato dopo l’uso.
La fuoriuscita di materiale potenzialmente infetto deve essere rimosso immediatamente con carta
assorbente e le aree contaminate pulite con un disinfettante standard o con etanalo al 70%. Il materiale
usato per pulire le fuoriuscite, incluso i guanti, deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in
autoclave).
HISTO TYPE B27
Pagina 7 di 9
7. Soluzione dei problemi
Problema
Possibile causa
Soluzione
nessuna amplificazione,
DNA contaminato con inibitori di PCR
ripetere l’estrazione del DNA,
length standard visibile
provare metodi diversi
concentrazione di DNA
modificare la concentrazionde di DNA /
troppo alta / troppo bassa
ripetere l’estrazione di DNA
enzima mancante
ripetere la tipizzazione,
o concentrazione troppo bassa
modificare
la
concentrazione
dell’enzima
DNA da sangue in eparina
ripetere la tipizzazione con sangue in
EDTA e in citrato
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedere 4.4) 
Ripetuto
ciascun
insuccesso
pozzetto
in perdita nelle provette di reazione;
(nessun evaporazione di acqua e variazione usare un’altra provetta di reazione
controllo di amplificazione)
amplificazione
della concentrazione durante la PCR
aspecifica, contaminazione
bande addizionali,
(bande
errate
con
prodotti
di ripetere la tipizzazione,
amplificazione
addizionali
dimensioni
chiudere bene le provette con i tappi;
di
assicurarsi dell’esatta procedura del
lavoro
devono DNA contaminato con sali
essere tralasciate)
ripetere l’estrazione di DNA,
provare metodi diversi
concentrazione di DNA troppo alta
usare meno DNA
concentrazione dell’enzima troppo alta usare meno enzima
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedi 4.4) 
l’interpretazione mostra più contaminazione carry-over (prodotti di controllare la Master Mix
di 2 specificità
amplificazione!)
(senza aggiunta di DNA)
nuovo allele
assicurarsi dell’esatta procedura del
lavoro
nessuna banda visibile o colorazione EtBr troppo debole
molto
debole,
ripetere la colorazione
length
standard invisibile
lo sfondo del gel è troppo colorazione troppo forte,
immergere il gel in H2O o TBE per
diminuire la concentrazione di EtBr
chiaro
concentrazione di EtBr troppo alta
bande confuse
buffer per elettroforesi troppo caldo o diminuire il voltaggio
troppo vecchio
HISTO TYPE B27
errato buffer per elettroforesi
usare buffer TBE 0,5 x nuovo
gel non polimerizzato completamente
lasciare polimerizzare il gel per 30’
Pagina 8 di 9
 Quando si usano i reagenti ed il materiale elencato, considerare come ultima risorsa l’ottimizzazione dei
parametri di amplificazione. In molti casi, è possibile interpretare il test eliminando le bande addizionali che
hanno pesi molecolari non corretti.
8. Riferimenti
1. Brewerton, DA et al., 1973. Lancet i:904-907
2. Schlosstien L et al., 1973. N. Engl. J. Med. 288:704-706
3. Bodmer, J. et al., 1997. Tissue Antigens 49:297-321
4. Newton CR, 1989. Nucleic Acids Res. 17:2503-2516
5. Maniatis et al., 1989. Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbour Laboratory
6. Beutler, E. et al., 1990. BioTechniques 9:166
9. Spiegazione dei simboli usati sull’etichette
IVD
For in vitro diagnostic use / Per uso diagnostico in vitro
Storage temperature / Temperatura di conservazione
LOT
Batch code / Codice Lotto
Use by / Usare fino a
REF
Catalogue number / Codice
Consult instructions for use / Consultare le istruzioni d’uso
HISTO TYPE B27
Pagina 9 di 9