Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Ricerca su lavaggio broncoalveolare, espettorato e campioni
associati
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Batteriologia | B 57 | Emissione no: 3 | Data emissione: 02.10.15 | Pagina: 1 di 35
© Crown copyright 2015
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Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul
sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-andconsistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi
gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steeringcommittee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i
laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo
documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-andconsistency-in-clinical-laboratories
Numero di accesso alle pubblicazioni della PHE: 2015389
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
I loghi sono corretti al momento della pubblicazione
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Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO ................................................................................................5
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................7
INTRODUZIONE .........................................................................................................................7
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................14
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................17
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE ..........................................................................................17
3
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ..................................................18
4
PROCEDURA DI PROCESSAZIONE DEL CAMPIONE .................................................18
5
PROCEDURA DI REFERTAZIONE ..............................................................................26
6
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ......................................................................27
APPENDICE 1: COLTURA PER CAMPIONI BAL...................................................................28
APPENDICE 2: COLTURA PER CAMPIONI DI ESPETTORATO .........................................29
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................30
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
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Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail:
[email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con
il sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
8/02.10.15
Emissione eliminata. no
2.5
Emissione inserita no.
3
Sezione(i) interessate
Modifica.
Intero documento,
Collegamenti ipertestuali aggiornati al gov.uk.
Pagina 2.
Loghi aggiornati aggiunti.
Scopo.
Migliorati collegamenti alle altre SMI UK.
Sezione della fibrosi cistica revisionata ed ampliata.
Incluse informazioni sulla Legionella.
Sezione relativa infezioni fungine rivista e aggiornata.
Introduzione.
Sezione sui tipi di campione revisionata e aggiornata.
Aggiunti all’introduzione microrganismi con rilascio
intenzionale.
Ampliata interpretazione della sezione colorazione
Gram.
Considerazioni sulla sicurezza.
Aggiunta nel documento informazione su Funghi del
Gruppo di Rischio 3.
Informazioni per BAL estese per chiarire il metodo
semi-quantitativo.
Inserite informazioni sulla cultura di Legionella.
Coltura e ricerca
Sezione fungina è stata divisa in fibrosi cistica e
pazienti affetti da fibrosi non cistica.
Inserita una sezione su metodi molecolari.
Aggiunta coltura per M. abscessus alla sezione della
fibrosi cistica.
Bibliografiia
Bibliografia revisionata e aggiornata.
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SMI del RU#: Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti
che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono
ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la
diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano
la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche
microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte
delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti
del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche
(prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli
algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la
diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note
orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad
esempio la validazione della prova.
La standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo.
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE,
NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali. L'elenco delle
organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/uk-standards-formicrobiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. L'inclusione del
logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di
preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del
comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti
possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui
appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno
strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con
un processo di consultazione.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata
dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida
prodotte dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO
9001:2008 .Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si
devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC
(General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
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pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard
minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel
Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i
requisiti ell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono
essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI. Le prestazioni della SMI
dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature
utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli
messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono
partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del
controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il
coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di
operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà
strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di
partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al
nostro sito web.
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e
di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-anddiversity.
I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione
efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici
coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano
modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali
modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate
nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere
sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da
parte dell’ente accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2015). Investigation of bronchoalveolar lavage, sputum and
associated specimens. UK Standards for Microbiology Investigations. B 57 Issue 3.
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistencyin-clinical-laboratories
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Scopo del Documento
Tipo di Campione
Aspirato bronchiale, aspirato transtoracico, lavaggio bronco alveolare, aspirato transtracheale, brushing
bronchiale, campioni da catetere protetto, lavaggio bronchiale, campione da tubo endotracheale, sputo –
espettorato.
Questa SMI descrive l’isolamento di microrganismi noti che causano infezioni respiratorie
batteriche e fungine da espettorato, lavaggio broncoalveolare e campioni associati
Diverse prove sono effettuate su diversi tipi di campione in funzione del gruppo di pazienti. Per
informazioni su Bordetella pertussis e Bordetella papapertussis consultare B 6. Per la ricerca su
campioni per le specie Mycobacterium consultare B 40. Per i virus consultare S 2 – Pneumonia,e.
G 8 - Respiratory viruses.
Questa SMI deve essere usata con le altre SMI.
Introduzione
La ricerca e l’isolamento di microrganismi responsabili di polmonite dipendono da:
•
•
•
•
Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie
Assenza di contaminazione della flora del tratto respiratorio superiore
Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali.
Trattamenti antimicrobici recenti in corso
La definizione dell’Infezione polmonare del tratto respiratorio inferiore (LRTI - Lower Respiratory
Tract Infection) include la polmonite, nella quale si sviluppa un’infiammazione del parenchima
polmonare, ed infezioni quali la bronchiolite che interessa le vie aeree di piccolo calibro. L’ascesso
polmonare, nel quale il parenchima è sostituito da cavità ripiene di pus, e l’empiema, in cui il pus
occupa la cavità pleurica, sono le manifestazioni meno frequenti delle patologie delle LRTI.
La differenziazione fra colonizzazione tracheobronchiale e vera infezione polmonare può risultare
difficile
Polmonite
La polmonite può essere classificata in funzione della sede di acquisizione, in comunitaria o
nosocomiale (spesso definita come acquisita più di 48 ore dopo l’ospedalizzazione). Può essere
primaria, manifestandosi in persona senza precedenti fattori di rischio noti, o secondaria. Molte
condizioni sono associate ad aumentare il rischio di polmonite. I comuni fattori di rischio includono
malattie croniche del polmone, quali una malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD, Chronic
Obstructive Polmunary Disease), diabete mellito, insufficienza cardiaca o renale ed
immunosoppressione (congenita o acquisita). I ridotti livelli di coscienza e un debole riflesso
faringeo e della tosse rappresentano i fattori di rischio per la polmonite da aspirazione. Le infezioni
recenti da virus respiratori, in modo particolare da virus influenzale, rappresentano un altro fattore
di rischio. Sono noti sintomi clinici ed indici di laboratorio che possono essere utilizzati per
verificare la gravità della polmonite in un singolo paziente, alcuni di questi, se presenti, sono
predittivi di un aumentato rischio ad evoluzione sfavorevole1.
L’eziologia della polmonite varia in funzione della sede d’acquisizione, comunitaria o nosocomiale,
e della presenza di fattori di rischio. Molti batteri riscontrati come colonizzanti delle vie aeree
superiori sono stati implicati nella polmonite. Il trattamento antibiotico e l’ospedalizzazione
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modificano il tipo di flora colonizzante, conducendo ad un aumento dei bacilli Gram negativi
aerobi2. Questi fattori modificano la sensibilità e la specificità della coltura dell’espettorato come
prova diagnostica ed i risultati devono sempre essere interpretati in funzione delle informazioni
cliniche3. I risultati delle colture dell’espettorato sono spesso non affidabili e la sensibilità
dell’esame colturale è scarsa per molti patogeni, sebbene la coltura e la sensibilità agli antibiotici
da campioni di escreato di pazienti affetti da gravi esacerbazioni di COPD possono fornire risultati
importanti4.
Polmonite comunitaria5
L’agente causale più frequente della polmonite acquisita in comunità è lo Streptococcus
pneumoniae, che rappresenta più del 60% dei casi comunitari rilevati dalle indagini e può essere
multiresistente. Si può manifestare in soggetti di tutte le età, inclusi quelli senza fattori di rischio
noti. Altri batteri patogeni tendono a causare polmonite in presenza di specifici fattori di rischio. I
pazienti con COPD e quelli con HIV sono maggiormente a rischio di polmonite da Haemophilus
influenzae e Moraxella catarrhalis. La polmonite da Staphylococcus aureus si manifesta sia nel
contesto di un’infezione influenzale recente o, meno frequentemente, come risultato di una
diffusione ematogena proveniente da una sede distante, COPD o da aspirazione. I bastoncini
Gram negativi aerobi sono raramente causa di polmonite comunitaria. Occasionalmente la
Klebsiella pneumoniae causa una grave polmonite necrotizzante, particolarmente in pazienti con
un’anamnesi d’abuso di alcool e nelle persone senza domicilio (polmonite di “Friedländer”).
Un certo numero di altri patogeni causa polmonite atipica nell’ambito della comunità6.
Il Mycoplasma pneumoniae causa fino al 20% delle polmoniti comunitarie, secondo solo allo S.
pneumoniae. L’infezione da Mycoplasma pneumoniae si manifesta tendenzialmente in forma
epidemica ogni 4-5 anni e colpisce i gruppi più giovani. La Chlamydophila pneumoniae è un
patogeno esclusivamente umano. La polmonite causata da Chlamydophila psittaci e Coxiella
burnetii, è limitata ad un gruppo ristretto e si manifesta in soggetti con anamnesi di esposizione
consistente (uccelli ed animali di fattoria). La Legionella pneumophila è una rara causa di epidemie
di polmonite comunitaria e di solito nell’anamnesi si dichiarano viaggi recenti. I virus respiratori,
quali VRS, influenza ed adenovirus possono causare occasionalmente la polmonite virale primitiva
(consultare G 8 - Respiratory viruses)7.
Polmonite nosocomiale8
Rappresenta la seconda fra le infezioni nosocomiali più frequenti. Il rischio aumenta in presenza di
malattie latenti e di vari interventi e procedure9. La ventilazione di tipo meccanico rappresenta il
maggior fattore di rischio. I pazienti con malattie critiche che richiedono una prolungata
ventilazione di tipo meccanico sono esposti a specie multi-resistenti di Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter (come Acinetobacter baumannii). I bacilli aerobi Gram negativi, inclusi gli
appartenenti alle Enterobacteriaceae (quali Klebsiella sp. ed Enterobacter sp.) e P. aeruginosa
sono implicate in più del 60% dei casi10. I cateteri intravascolari ed i portatori nasali rappresentano
fattori di rischio per polmoniti causate da S. aureus meticillino resistente (MRSA, methicillin
resistant S. aureus).Le specie Legionella sono pure causa occasionale di polmonite nosocomiale.
Polmonite da aspirazione
Si manifesta quando il contenuto orofaringeo raggiunge il tratto respiratorio inferiore. Costituiscono
fattori di rischio ridotti livelli di coscienza, come in caso di trauma cranico o d’abuso di droga, un
debole riflesso faringeo e della tosse, che possono seguire ad un ictus o altro tipo di malattia
neurologica.
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Ascesso Polmonare
Può essere secondario a polmonite da aspirazione; in questo caso è più frequentemente implicata
la zona polmonare media di destra. Altri microrganismi possono portare a formazione di focolai
multipli e la presenza di ascessi multipli di piccole dimensioni (<2cm di diametro) è talvolta
segnalata come polmonite necrotizzante. La polmonite causata da S. aureus e K. pneumoniae può
sviluppare questa forma clinica. La nocardiosi si manifesta spesso in un quadro di
immunosoppressione, può sviluppare ascessi polmonari. Ascessi conseguenti a diffusione
ematogena di un’infezione a sede distante si possono manifestare in condizioni infettive quali
l’endocardite infettiva.
Burkholderia pseudomallei può causare ascessi polmonari o polmonite necrotizzante in soggetti
che hanno visitato aree endemiche (principalmente il sud est Asiatico e l’Australia del nord),
specialmente in presenza di diabete mellito11.
La sindrome di Lemierre o necrobacillosi origina da un’infezione acuta orofaringea. La
tromboflebite infettiva della vena giugulare interna può sostenere la diffusione di emboli settici e
l’infezione metastatica. Il polmone è la sede più frequentemente coinvolta e si possono sviluppare
ascessi multifocali. Il Fusobacterium necrophorum è il patogeno più frequentemente isolato da
emocolture in pazienti affetti da questa sindrome12.
Fibrosi cistica (FC)13
La fibrosi cistica è causata da un difetto del gene FC che regola la conducibilità transmembrana
del trasporto degli ioni e dell’acqua attraverso l’epitelio14. Ciò conduce ad una malattia polmonare
progressiva associata ad infezioni, che è la principale causa di morbilità e di mortalità nei pazienti
con FC. I principali patogeni sono S. aureus, H. influenzae (di solito non capsulato nei pazienti con
FC ) S. pneumoniae, e pseudomonadi, in modo particolare i ceppi produttori di muco di P.
aeruginosa14,15. Da un singolo campione possono essere isolati ceppi di P. aeruginosa con spettri
diversi di sensibilità agli antibiotici. Possono essere presenti anaerobi, contemporaneamente ad
Aspergillus fumigatus e micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis (MOTT)16.
L’analisi delle sequenze nucleotidiche del gene recA suggerisce che Burkholderia cepacia complex
è rappresentato da 9 genomovar17. Si può verificare la trasmissione fra i pazienti del B. cepacia
complex ed alcuni di questi soccombono in breve tempo per la “sindrome da B. cepacia”
rappresentata da una polmonite fulminante accompagnata talvolta da setticemia18. Dopo le prime
segnalazioni più specie sono state inserite in questo gruppo e la prognosi dei pazienti è
infausta13,19,20.
I micobatteri non tubercolari sono un problema crescente per questo gruppo di pazienti;
M. abscessus lo è più degli altri21. La ricerca dovrebbe essere presa in considerazione nei pazienti
che manifestano deterioramento della funzione polmonare in cui nessun agente patogeno è stato
chiaramente identificato22-25.
La resistenza agli antibiotici, in particolare nelle specie Burkholderia, Stenotrophomonas
maltophilia e P. aeruginosa, limita le possibilità di trattamento26.
Microrganismi come Ralstonia, Achromobacter e Pandoraea sono agenti patogeni emergenti nelle
malattie strutturali croniche polmonari. Sono pure stati implicati i virus 27,28.
Per ulteriori informazioni su questo settore fare riferimento a “Laboratory standards for processing
Microbiological Sample from People with Cystic Fibrosis”29.
Malattia da Micobatteri
L’infezione polmonare primitiva da Mycobacterium tuberculosis può condurre alla formazione del
‘complesso primario’ specialmente nell’infanzia. La localizzazione polmonare può essere
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relativamente piccola, ma i linfonodi drenanti dell’ileo appaiono consistentemente ingrossati e
possono rompersi, diffondendo materiale infetto in altre sedi polmonari. E’ in questo stadio che si
manifesta la diffusione miliare ad altri organi per via ematogena e linfatica. Gli adolescenti e gli
adulti possono avere un’infezione primaria asintomatica, un tipico complesso primario o
un’infezione che progredisce in una tipica tubercolosi cronica cavitaria. La manifestazione cavitaria
cronica è di solito osservata in corso di riattivazione di un’infezione primaria e gli apici del polmone
sono le sedi più frequentemente interessate. La tosse che accompagna questo processo produce
aerosol di particelle infette ed in questo modo altre persone possono essere infettate. Micobatteri
diversi dai bacilli tubercolari sono stati riscontrati nell’uomo in corso di malattia, in modo particolare
in quelli con immunosoppressione o con malattie soggiacenti. Questi includono Mycobacterium
avium-intracellulare, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium kansasi, Mycobacterium
malmoense, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium fortuitum, e Mycobacterium haemophilum.
Questi sono sovente resistenti alla chemioterapia antitubercolare standard. Fare riferimento alla B
40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species.
Malattia da Legionella
La trasmissione avviene per inalazione di un aerosol dell'organismo, sia da una fonte ambientale o
occasionalmente iatrogena, a seguito di una manipolazione del tratto respiratorio, come
umidificazione o nebulizzazione di materiale infetto.
La polmonite è la manifestazione più comune delle infezioni da Legionella. La gravità varia da lieve
a malattia grave mortale. L'esordio è solitamente improvviso con febbre, mialgia, cefalea e tosse
non produttiva successiva, comunemente, a un periodo di incubazione 2-10 giorni. E’ stato
riscontrato che il tempo di incubazione può protrarsi fino a 20 giorni in alcuni casi che hanno
coinvolto vasche idromassaggio e stazioni termali30. Può essere presente diarrea liquida e
possono manifestarsi sintomi neurologici che vanno dalla lieve cefalea all’encefalopatia31. La
radiografia del torace mostra infiltrati polmonari in progressivo consolidamento spesso con
effusione pleurica32.
La febbre di Pontiac/malattia non-polmonare è una malattia febbrile acuta che si manifesta 24 - 48
ore dopo l'esposizione a qualsiasi specie, ma in modo particolare a L. pneumophila, Legionella
feeleii, Legionella micdadei e Legionella anisa33-36. All’apparenza, la malattia assomiglia
all’influenza e di solito è autolimitante, senza coinvolgimento polmonare. E 'stato riscontrato che i
bambini hanno un periodo d’incubazione più breve rispetto agli adulti e manifestano sintomi, come
otalgia ed eruzioni cutanee, mentre i sintomi più comuni negli adulti comprendono febbre, vertigini,
cefalea, affaticamento, artralgia e dolore addominale37.
Infezioni da Nocardia and actinomyces38,39
La nocardiosi e l’actinomicosi sono patologie rare che possono interessare oltre il polmone altri
sistemi.
Le specie Nocardia sono spesso presenti nel polmone dove causano una polmonite acuta, spesso
di tipo necrotizzante. Questa evenienza è di solito associata a formazione di cavità. Può inoltre
causare un nodulo polmonare a lenta espansione e polmonite, spesso associata ad empiema.
Disordini di tipo immunologico quali alcolismo, trapianto d’organo ed infezione da HIV sono
presenti nella maggior parte dei casi (oltre 60%) dei soggetti affetti da nocardiosi.
Le specie Actinomices causano infezione toracica che può coinvolgere polmoni, pleura, mediastino
o parete toracica. Spesso i casi evolvono non diagnosticati fino all’empiema o si sviluppa una
fistola della parete toracica. L’aspirazione di materiale orale rappresenta un fattore di rischio per lo
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sviluppo dell’actinomicosi toracica; le condizioni predisponesti includono alcolismo, infarto
cerebrale, overdose di droga, anestesia generale, crisi epilettica, coma diabetico o shock.
I campioni idonei per la ricerca di entrambi questi microrganismi sono pus, campioni di tessuto o
biopsia (consultare B 14 - Investigation of abscesses and post-operative wound and deep-seated
wound infections e B 17 - Investigation of tissues and biopsies).
Infezioni parassitarie40
Alcune infezioni da elminti possono provocare la sindrome Polmonare Tropicale Eosinofila,
caratterizzata da infiltrati polmonari irregolari ed eosinofilia associati a sintomi quali tosse, febbre e
perdita di peso. Questi segni e sintomi sono associati al passaggio delle forme larvali nei polmoni
ed includono Ascaris lumbricoides, vermi uncinati e Strongyloides stercoralis.
La distomatosi polmonare causata da Paragominus westermanii ha una diffusa distribuzione ed è
particolarmente presente in Estremo Oriente, subcontinente Indiano ed Africa Occidentale.
L’infezione è acquisita dall’uomo con consumo di granchi e gamberi d’acqua dolce non cotti,
colonizzati da metacercarie incistate. Sebbene l’infezione possa essere asintomatica, consistenti
infestazioni si manifestano con infiltrati polmonari che possono progredire in tosse produttiva
cronica con dolore toracico pleurico. Le uova di P. westermanii possono essere dimostrate
nell’escreato (Consultare B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites).
Infezioni fungine41
Le specie Candida sono raramente causa di LRTI. Occasionalmente l'infezione si manifesta per
diffusione ematogena. La diagnosi è difficile a causa della possibile colonizzazione delle vie aeree
in pazienti trattati con antibiotici.
L’aspergillosi invasiva rimane ancora un’infezione a rischio di mortalità nei pazienti gravemente
immunocompromessi e contribuisce alla morbilità nei pazienti con cancro42. I fattori di rischio
soggiacenti includono pazienti trattati con corticosteroidi, soggetti con tumori ematologici e quelli
con infezioni polmonari pregresse.
L’Aspergillus fumigatus complex è una delle specie più diffuse come causa di infezioni fungine e
un numero significativo di casi non vengono diagnosticati a causa della mancanza di sensibilità
degli accertamenti disponibili. Le diagnosi aumentano con la ricerca dell’antigene galattomannano,
su siero e BAL nei pazienti a rischio di infezioni fungine sottoposti a screening, associato a metodi
di rilevazione molecolare (ad esempio 18SrRNA, regione ITS)43,44. Tuttavia, il rilevamento del DNA
fungino non può differenziare la colonizzazione dall’infezione attiva45.
La polmonite da Pneumocystis e causata da Pneumocystis jiroveci. E’ la causa più frequente di
polmonite grave nei pazienti con infezione avanzata da HIV, ed è considerata come conferma della
malattia AIDS46. La polmonite da Pneumocystis si manifesta in numerose altre condizioni di
immunocompromissione in adulti e bambini. Si presenta in modo sub-acuto con tosse, febbre ed
ipossia come quadro dominante e spesso l’esordio è subdolo. I migliori campioni diagnostici sono il
BAL e le biopsie transbronchiali, ma il prelievo con quest’ultima tecnica comporta alcuni rischi. I
campioni di BAL, espettorati indotti e sciacqui del cavo orale sono utili per i metodi di rilevazione
molecolari47-49.
Alcuni rari agenti causali di LRTI di origine fungina sono endemici in aree geografiche ben definite.
Sebbene molte infezioni abbiano andamento subclinico, quelle clinicamente evidenti sono
occasionalmente importate nel Regno Unito. Si manifestano in persone con normale assetto
immunitario, ma tendono ad assumere un andamento più severo negli immunocompromessi. La
diagnosi dovrebbe essere presa in considerazione nei turisti che ritornano da zone endemiche che
presentano affezione respiratoria o polmonite, specialmente in quelli senza risposta alla terapia
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standard. Queste infezioni includono: istoplasmosi, causata da Histoplasma capsulatum (sud est
USA, America Centrale, Africa, Australia e Asia orientale); Coccidiomicosi, causata da Coccidiodes
immitis e C. posadasii (sud ovest USA, Centro e Sud America) e blastomicosi, causata da
Blastomyces dermatitidis (USA orientale, Centro e Sud America e Africa). Sebbene queste
infezioni abbiano caratteristiche specifiche, spesso è difficile differenziarle clinicamente dalle altre
cause di infezione polmonare, specialmente nelle fasi precoci. La paracoccidiomicosi causata dal
Paracoccidioides brasiliensis (America Centrale e Sud America) causa solitamente un’infezione
polmonare primitiva asintomatica. Talaromyces (già Penicillium) marneffei (Sud Est asiatico, Cina
meridionale), dovrebbe inoltre essere considerato quando l’anamnesi di viaggio ne sostiene la
possibilità. Le infezioni fungine si possono riattivare se si riduce la funzione immunitaria.
Cryptococcus neoformans è una agente eziologico non comune di polmonite, solitamente
riscontrato nell'ospite immunocompromesso e può essere associato a meningite, rappresenta una
patologia che definisce lo stato di AIDS conclamato. La polmonite può essere causata da
Cryptococcus neoformans. Questo patogeno ha una distribuzione ubiquitaria. La presenza
dell'antigene criptococcico circolante nel siero o nel BAL è coerente con la diagnosi di polmonite
criptococcica.
Tipi di Campione9
Campioni espettorato
I campioni di espettorato sono noti per avere problemi di contaminazione. Dovrebbero essere
ottenuti campioni di espettorato di primo mattino perché contengono le secrezioni prodotte durante
la notte in cui i batteri patogeni hanno maggiori probabilità di essere stati concentrati. La polmonite
associata a ventilazione comporta un alto tasso di mortalità, ma è clinicamente e
microbiologicamente difficile da diagnosticare. I criteri per la diagnosi rimangono controversi. La
scarsa sensibilità e specificità della cultura dell’espettorato nella diagnosi di polmonite nei pazienti
ospedalizzati ventilati ha portato allo sviluppo di varie tecniche per ottenere campioni dal tratto
respiratorio inferiore e alcune di loro prevedono l'uso di broncoscopi a fibre ottiche.
Lavaggio broncoalveolare (BAL - Bronchoalveolar lavage)
Dopo inserzione di un broncoscopio flessibile si ‘lava’ con soluzione fisiologica sterile un segmento
polmonare, ottenendo in tal modo componenti cellulari e non della superficie della mucosa del
tratto respiratorio inferiore50. E’ un metodo affidabile per una diagnosi eziologica definitiva di
polmonite o di altre infezioni polmonari51,52.
I risultati su campione da brushing e da lavaggio broncoalveolare sono considerati confrontabili da
alcuni ricercatori se si utilizza la soglia di 104 ufc/mL per il lavaggio broncoalveolare, ma questo
metodo non è raccomandato in questa SMI in quanto di valore controverso53.
Lavaggio broncoalveolare non diretto (NBL, non-directed bronchoalveolar lavage)
Il lavaggio broncoalveolare non diretto fornisce risultati comparabili agli altri metodi
broncoscopici53-55. Inserire un catetere da suzione, preferibilmente un catetere BAL protetto per
ridurre al minimo la contaminazione sotto il tubo endotracheale fino a che non incontra resistenza.
Iniettare e poi aspirare un’aliquota di soluzione fisiologica sterile. Questo metodo fornisce un
campione delle basse vie respiratorie senza l’utilizzo del broncoscopio e senza il possibile rischio
di aspirazione transtracheale.
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Aspirato bronchiale
Gli aspirati bronchiali rappresentano la raccolta di materiale dalle grandi vie del tratto respiratorio
per aspirazione diretta con broncoscopio flessibile.
Brushing bronchiale
La tecnica di brushing bronchiale utilizza un catetere protetto all’interno di un broncoscopio (una
spazzola all’interno di due cateteri chiusi nella parte terminale con un tappo di glicol di polietilene)
per prelevare materiale dalle vie aeree. Una carica batterica pura superiore a 103cfu/ml in un
campione ottenuto mediante brushing con broncoscopio correla con la diagnosi istologica di
polmonite52.
Lavaggi bronchiali
I lavaggi bronchiali sono raccolti in modo simile agli aspirati bronchiali, ma le procedure
interessano l’aspirazione di piccole quantità di soluzione fisiologica introdotta dalle principali vie
dell’albero respiratorio50.
Campione da catetere protetto
Il materiale è raccolto per via broncoscopia in modo simile al brushing bronchiale. Si utilizzano un
catetere interno ed uno esterno con un tappo di glicol di polietilene all’estremità per prevenire la
contaminazione nasofaringea. Quando si incontra resistenza all’introduzione, si espelle il tappo ed
il campione è prelevato tramite il catetere interno.
Aspirato transtoracico
I campioni sono ottenuti attraverso la parete toracica con un ago inserito fra le costole. Questa
procedura può essere intrapresa per campionare, ad esempio, un aspergilloma, un ascesso o
qualsiasi lesione polmonare localizzata accessibile.
Aspirazione transtracheale
L’aspirazione transtracheale rappresenta una procedura che comporta un rischio clinico e pertanto
e raramente eseguita nel RU.
Aspirato tracheale
Gli aspirati tracheali sono raccolti tramite un tubo endotracheale. Sono soggetti ad alcune
limitazioni come i campioni di escreato.
Microrganismi insoliti che possono essere coinvolti in un’infezione
volontaria o accidentale (bioterrorismo o guerra biologica)
In assenza di qualsiasi altro fattore di rischio (ad esempio, viaggi all'estero, laboratorio clinico o
lavoro veterinario che costituiscono un rischio di infezione) casi o gruppi di microrganismi segnalati
di seguito potrebbero suggerire la possibilità di un rilascio volontario o accidentale degli stessi.
Questi eventi richiedono una risposta rapida; il sospetto di rilascio volontario o accidentale di
microrganismi deve essere notificato con urgenza alla Public Health England 24hr Duty Doctor at
Microbiology Services Colindale. Sono vigenti altre disposizioni in Scotland56,57, Wales58 e
Northern Ireland59.
Se si sospettano i seguenti microrganismi, l’indagine dovrebbe essere effettuata a livello di
contenimento 3 se non diversamente indicato. Gli isolati sospetti devono essere inviati al
laboratorio di riferimento adeguato per la caratterizzazione:
• Bacillus anthracis (antrace)
• Specie Brucella (Brucella)
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• Francisella tularensis (Tularemia)
• Burkholderia mallei (Morva)
• Burkholderia pseudomallei (Melioidosi)
• Clostridium botulinum (botulismo) può essere indagato a Livello di Contenimento 2 in Cabina
Microbiologica di Sicurezza
Fare riferimento a ID 8 - Identification of Clostridium species
• Coxiella burnetii (febbre Q)
• Yersinia pestis (peste)
Nota: le specie Brucella, B. mallei, B. pseudomallei e Y. pestis sono elencate nelle banche dati di
un certo numero di sistemi di identificazione con disponibilità di kit commerciali; i risultati devono
comunque essere interpretati con cautela.
Nota: B. anthracis, specie Brucella, C. botulinum e Y. pestis causano tutte malattie oggetto di
notifica al Local Authority Proper Officer under the Health Protection (Notification) Regulations
2010 disponibile al: https://www.gov.uk/notifiable-diseases-and-causative-organisms-how-to-report
Nota: La brucellosi è oggetto di notifica ai sensi dell'Ordine Zoonosi 1989.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMi del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e
specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche
le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono
assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni Selettivi per Procedure di Screening
I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti possono
essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve pertanto essere
ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di una piastra di terreno.
Contenitori per Campioni60,61
Le SMI usano il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere
quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I
requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari
Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve
consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la
contaminazione e la perdita dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il
rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a
questi scopi''.
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Terreni di coltura
Per l’isolamento di H. influenzae e di S. pneumoniae l’agar sangue arricchito con NAD ha qualità
inferiore rispetto all’agar cioccolato62. Scarso miglioramento nella percentuale di isolamento è stato
ottenuto con l’incubazione prolungata (48 ore) delle colture.
Le valutazioni hanno dimostrato che l’agar cioccolato con bacitracina incorporata (o agar
cioccolato con disco di bacitracina) può essere utilizzato al posto dell’agar cioccolato. Le
percentuali di isolamento di H. influenzae non sono significativamente differenti quando si
utilizzano questi terreni. In ogni caso, la flora competitiva si riduce in modo significativo sull’agar
con bacitracina incorporata ed è superiore la quantità di crescita di H. influenzae, facilitando il
trasferimento delle colonie63.
Se viene utilizzato agar cioccolato con bacitracina incorporata va incluso anche agar sangue
incubato in CO2 al 5-10% per l’isolamento di M.catarrhalis e di S.pneumoniae. Può essere
difficoltoso distinguere le diverse morfologie di streptococchi su agar cioccolato ed in questi casi si
può prendere in considerazione l’utilizzo di agar sangue.
E’ raccomandato l’utilizzo dell’agar selettivo Burkholderia cepacia nell’esame colturale di campioni
da pazienti con fibrosi cistica. Il suo grado di selettività facilita la crescita di Burkholderia cepacia e
sotto questo aspetto è superiore al CLED agar. L’agar selettivo B. cepacia può consentire la
crescita di Burkholderia gladioli e di altre pseudomonadi.
BMPAα è consigliato per campioni clinici, anche se sono disponibili segnalazioni di effetto inibitorio
per alcune specie di Legionella64-66. Sono stati inoltre rilevati ceppi sensibili alla vancomicina.
L'incubazione con 2-5% di CO2 è in grado di favorire la crescita di alcune specie di Legionella,
come L. sainthelensi e L. oakridgensis. Questo basso livello di CO2 non influenzerà la crescita di L.
pneumophila, ma concentrazioni di CO2 superiori al 5% possono inibire la crescita64.
Tutti i terreni per i batteri hanno qualità notevolmente inferiori a quelli per la ricerca dei funghi, quali
agar Sabouraud destrosio. Tutti i materiali dei pazienti a rischio devono essere seminati di routine
su terreni per lo sviluppo dei funghi. La temperatura d’incubazione condiziona l’isolamento:
campioni ad elevata carica di specie Candida possono oscurare lo sviluppo di specie Aspergillus, e
le colture a 42-45°C inibiscono la crescita delle specie Candida, consentendo quello delle specie
Aspergillus. La refrigerazione riduce il riscontro dei muffe mucoraceae.
Interpretazione degli strisci colorati con Gram
La colorazione Gram su campioni di espettorato possono essere utilizzati per determinare la
qualità del campione e per prevedere possibili agenti patogeni in funzione della loro caratteristica
morfologia67,68. La determinazione della qualità del campione si basa sul numero di leucociti
polimorfonucleati e delle cellule epiteliali squamose (sec) presenti: i campioni purulenti possono
essere selezionati per la cultura e quelli non purulenti o contaminati con cellule epiteliali squamose
possono essere respinti.
Spesso i campioni di espettorato non sono valutati prima della coltura, e la loro preparazione per la
colorazione di Gram avviene contemporaneamente alla processazione dei campioni. Si deve porre
attenzione nell'interpretare uno striscio di espettorato colorato con Gram in quanto l'uso di
antimicrobici può evidenziare microrganismi non vitali presenti nello striscio68. Se è evidente
contaminazione grossolana con flora orofaringea sia nel BAL che dei campioni di espettorato
potrebbe non essere opportuno identificare i microrganismi. La sensibilità di colorazione del Gram
può variare, è generalmente ridotta e spesso dipende dalla revisione del vetrino da parte
dell’osservatore40,68,69. La colorazione di Gram può identificare lieviti o ife, ma è inferiore alle
preparazioni con idrossido di potassio (KOH) e agli agenti fluorescenti.
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Sono stati proposti vari metodi di interpretazione degli strisci colorati con Gram mediante la conta
dei leucociti ematici e dei microrganismi. Nei campioni BAL la colorazione di Gram può essere utile
per prevedere i risultati della coltura quantitativa69. In alcuni casi, la chemioterapia antimicrobica
può essere iniziata sulla base dei risultati dello striscio colorato con Gram prima che i risultati della
coltura siano disponibili.
Trattamento termico delle specie Legionella
Alcuni laboratori trattano termicamente i campioni quando ricercano le specie legionella. Anche se
il metodo funziona bene, in alcuni circostanze è stato dimostrato che aggiunge molto poco alla
situazione clinica e pertanto non è incluso in questo documento66,70,71.
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1
Considerazione sulla Sicurezza60,61,72-86
1.1 Prelievo, Trasporto e Conservazione del campione1,2,65-68
Usare tecnica asettica
Raccogliere i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli in
sacchetti di plastica sigillati.
E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.
1.2 Procedura sul Campione60,61,72-86
Condizioni di Contenimento di Livello 3.
Prima della colorazione per micobatteri, i materiali strisciati devono essere fissati ponendo il
vetrino su una piastra di riscaldamento (65 – 75°C), all’interno di una cabina di sicurezza, fino alla
disidratazione del materiale, poi posizionarli su un portavetrini o altro supporto idoneo.
Nota: La fissazione al calore può non uccidere tutte le specie di Mycobacterium87. I vetrini devono
essere manipolati con attenzione.
Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere
eseguite in cabina microbiologica di sicurezza78.
Tutte le muffe isolate da pazienti con anamnesi di viaggio in aree dove sono endemici funghi
dimorfi o altri funghi di Rischio 3 devono essere trattate a Livello di Categoria 3 fino a quando è
esclusa loro appartenenza a gruppo di rischio 3.
La centrifugazione deve essere eseguita in contenitori chiusi, aperti in seguito in una cabina
microbiologica di sicurezza
I contenitori dei campioni devono essere collocati su supporto idoneo.
Fare riferimento alle vigenti linee guida sulla sicurezza per la manipolazione di tutti i microrganismi
riportati in questa SMI.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio
2 Procedura sul Campione
2.1 Tipo di Campione
Aspirato bronchiale, aspirato transtoracico, lavaggio broncoalveolare, aspirato transtracheale,
spazzolamento bronchiale, campione da catetere protetto, lavaggio bronchiale, campione da tubo
endotracheale, sputo – espettorato.
2.2 Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo88
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1.
Tutti i campioni devono essere raccolti poco tempo e prelevati prima dell’esecuzione della coltura e
prelevati prima dell’inizio del trattamento antimicrobico, quando possibile88.
Si raccomanda espettorato di primo mattino per le specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of
Specimens for Mycobacterium species).
La coltura per le specie Legionella può essere ancora positiva dopo l’inizio della terapia
antimicrobica (ID 19 - Identification of Legionella species
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Ricerca su lavaggio broncoalveolare, espettorato e campioni associati
Per i campioni di escreato si richiede che il materiale sia di provenienza dalle vie respiratorie
inferiori ottenuto con colpi di tosse profondi. Quando la tosse è secca, possono essere utili la
fisioterapia, il drenaggio posturale o l’inalazione di un aerosol prima dell’espettorazione. Saliva e
secrezioni rinofaringee non sono idonee.
I campioni per la ricerca di specie Mycobacterium dovrebbero essere in teoria raccolti di primo
mattino per almeno 3 giorni consecutivi (consultare B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species). BAL e campioni associati richiedono un prelievo specialistico secondo i
protocolli locali.
Salvo diversa indicazione, i tamponi per la coltura batterica e fungina devono essere inseriti in
appositi terreni di trasporto89-93.
Raccogliere campioni diversi dai tamponi in appositi contenitori impermeabili con marchiatura CE
inseriti in sacchetti di plastica sigillati.
2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni88
Espettorato – in teoria, almeno un volume di 1 mL.
BAL – E’ difficile specificare il volume richiesto; in linea generale si preferisce il volume massimo
ottenibile.
Numero e frequenza della raccolta dei campioni dipendono dalle condizioni cliniche del paziente.
Nota: si dovrebbe considerare l’uso della tracciabilità in considerazione di una potenziale azione
legale in caso di infezione da specie Legionella94.
3
Trasporto e Conservazione del Campione60,61
3.1
Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
I campioni devono essere prelevati prima dell’inizio della terapia antimicrobica, quando possibile88.
BAL ed espettorato devono essere trattati prontamente per consentire la migliore opportunità di
crescita dei microrganismi patogeni e ridurre il rischio di proliferazione di contaminanti. Se la
procedura deve essere ritardata fino a 24 ore, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a
temperatura ambiente. Se i campioni non sono processati lo stesso giorno del prelievo, tale
condizione deve essere esplicitata nella refertazione e l'interpretazione dei risultati dovrebbe
essere fatta con attenzione88,95,96.
4
Procedura sul Campione60.61
4.1
Selezione della Prova
Selezionare una parte rappresentativa del campione per appropriate procedure, quali la coltura di
specie Legionella, Mycobacterium (B 40 - Investigation of Specimens for Mycobacterium species)
e ricerca di parassiti (B 31 - Investigation of Specimens other than Blood for Parasites), in funzione
delle specifiche cliniche.
Commenti addizionale per Espettorato
L’espettorato indotto può essere inviato per la ricerca di P. jiroveci
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Commenti addizionali per il BAL
Le colture per le specie di Mycobacterium dovrebbero essere eseguite su tutti i campioni BAL,
tranne particolari indicazioni locali che non richiedano questa procedura.
I campioni di BAL di pazienti a rischio di aspergillosi polmonare, nei quali è sospettata un’infezione
fungina, dovrebbero essere testati per l’antigene galattomannano.
4.2 Aspetto
Espettorato
I campioni non dovrebbero essere rifiutati solo per le caratteristiche macroscopiche. Possono
essere descritti utilizzando la seguente terminologia: salivare, mucoso, mucopurulento, purulento o
ematico.
BAL
N/D
4.3 Preparazione del Campione
Espettorato
Seguire le Istruzioni del produttore aggiungendo all’espettorato una soluzione allo 0,1% di
ditiotreitolo o N-acetil L-cisteina (NALC).
Diluire 10μL di espettorato omogeneizzato in 5 ml di acqua distillata sterile.
Nota: Per i Campioni mucoidi trattare come l’espettorato.
BAL40,97,98
Centrifugare il BAL 1200 xg per 10 minuti.
Eliminare tutto il sopranatante, tranne 0,5 ml di e risospendere il deposito del centrifugato nel
liquido rimanente.
4.4 Microscopia
4.4.1 Standard
BAL
Campioni mucosi
Utilizzare un’ansa sterile e selezionare il materiale più purulento o parti di campione a maggior
colorazione ematica e preparare uno striscio sottile su vetrino da microscopio pulito per la
colorazione Gram.
Campioni non mucosi
Utilizzare una pipetta sterile e deporre una goccia di materiale centrifugato (consultare la sezione
4.3) su un vetrino da microscopio pulito.
Diffondere questo materiale con un’ansa sterile per ottenere uno striscio sottile per la colorazione
di Gram.
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4.4.2 Prove Supplementari
Espettorato
Colorazione Gram
Fare riferimento a (TP 39 - Staining Procedures)
Utilizzando un’ansa sterile raccogliere il materiale omogeneizzato (consultare sezione 4.5.1) e
preparare uno striscio sottile su un vetrino da microscopio pulito per la colorazione Gram.
I campioni salivari possono essere rifiutati prima della omogeneizzazione o sulla base di un
rapporto <2:1 GB:SEC determinato con la colorazione Gram a basso ingrandimento (x100).
Se un campione è rifiutato sulla base dell’esame microscopico, informare immediatamente il
reparto, il clinico o il Medico curante..
Conservare i campioni a 4°C per non più di 48 ore.
Nota: I campioni da pazienti immunocompromessi, neutropenici o intubati o per le colture di
Legionella e specie Mycobacterium non possono essere rifiutati sulla base della qualità del
campione.
Microscopia per specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium
species), e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for parasites).
Preparazione KOH o Calcofluor per funghi.
BAL
Ricerca di P. jiroveci con prova di immunofluorescenza indiretta mediante l’utilizzo di confezione
commerciale.
Legionella
Tecnica di colorazione in fluorescenza.
Campioni omogeneizzati.
Utilizzando una pipetta sterile deporre una goccia di campione omogeneizzato (vedi Sezione 4.3)
su un vetrino pulito da microscopio PTFE.
Diffondere la goccia con un'ansa sterile per ottenere uno striscio sottile per la colorazione in
fluorescenza.
Seguire le istruzioni del produttore della confezione.
4.5 Coltura e ricerca
4.5.1 Standard
Espettorato
Inoculare con ansa 1µl della diluizione finale preparata in 4.3 per ogni tipo di terreno (consultare la
Sezione 4.5.2).
Per pazienti con FC o immunocompromessi inoculare 1μL della diluizione di sputasol/escreato
sulla stessa piastra. Queste diluizioni possono essere seminate su metà della piastra per facilitare
il confronto della crescita.
Per pazienti con fibrosi cistica che non hanno presentato una colonizzazione precedente da B.
cepacia, inoculare 100μL di espettorato liquefatto in una piastra di terreno per B. cepacia e
diffondere l’inoculo sull’intera superficie dell’agar99.
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BAL
Usando un’ansa sterile inoculare il campione in ciascuna piastra (consultare Q 5 – inoculation of
culture media).
Metodo semi – quantitativo
Il centrifugato del BAL è nuovamente sospeso nel liquido e si approntano tre diluizioni seriali (1/10,
1/1000 e 1/100.000. Di questi diluizioni 0,1 ml di ciascuna è seminata in piastra97
Volume seminato in agar
ciocccolato
Diluizione finale
Campione BAL passato su
vortex
0.1 mL
1:10
Diluire 0.1 mL in 9.9 mL di
soluzione fisiologica
0.1 mL
1:1000
Diluire 0.1 mL in 9.9 mL di
soluzione fisiologica
0.1 mL
1:100.000
Quantificare ogni morfotipo presente ed esprimere come unità formanti colonie.
In alternativa è utilizzata un'ansa calibrata. Per BAL di campioni fluidi sono utilizzate anse
quantitative calibrate progettate per distribuire 0.010 e 0.001 ml. Dopo incubazione, le colonie sono
contate sulle piastre e il numero di CFU per millilitro è determinato moltiplicando il numero di
colonie per il fattore di diluizione. Usando anse calibrate è importante verificare la loro calibrazione.
Le calibrazioni devono essere eseguite con BAL fluidi come soluzione di prova e risultati
quantitativi con valore soglia della coltura devono essere interpretati conoscendo i valori di
imprecisione dell’ansa100.
Nota: non frapporre ritardi tra la preparazione della diluizione e la semina delle piastre di agar.
Le soglie diagnostiche sono 105-106cfu / mL per aspirati broncoscopici, 103cfu / mL per campioni
da brushing protetto e 104cfu / mL per BAL40. La soglia diagnostica può non essere raggiunta se
l'infezione è appena iniziata o se è presente bronchiolite infettiva. I campioni da pazienti che hanno
ricevuto antibiotici possono anche fornire risultati falsi negativi.
4.5.2 Prove supplementari
Legionella
Espettorato
Inoculare le piastre direttamente con 0,1 ml di espettorato digerito (consultare sezione 4.3).
Lavaggi broncoalveolari
Centrifugare almeno a 2000 x g per 15 minuti. Utilizzare il sedimento come inoculo.
Per altri campioni del tratto respiratorio selezionare come inoculo qualsiasi parte lattiginosa o
ematica, se presente.
Campioni grossolanamente contaminati dovrebbero essere trattati termicamente e diluiti per
diminuire il numero di lieviti, pseudomonadi e specie Proteus e posti poi di nuovo in coltura.
Diluizione
Diluire il campione originale 1: 100 in acqua distillata e risemimare.
Nota: quando si deve eseguire la diagnosi di legionellosi l'uso del test dell'antigene urinario può
rivelarsi utile66,101.
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Nota: il trattamento termico non migliora la resa diagnostica e pertanto non è incluso nella
documento71.
Funghi
Pazienti senza FC quali immunocompromessi e altri:
Dopo il trattamento con agente mucolitico, se necessario, centrifugare tutto il campione. Esaminare
parte del sedimento residuo con KOH e calcofluor colorazione bianca e con il rimanente eseguire la
cultura.
Pazienti con FC
Dopo il trattamento con agente mucolitico seminare la piastra di coltura con volume di 10 μl e
un'aliquota di 100μL e diffondere in modo uniforme. Centrifugare il campione rimanente ed
esaminare parte del sedimento con KOH e colorazione calcofluor bianca ed eseguire la cultura col
materiale rimasto.
Altro
Specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) e parassiti
(B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites).
Ricerca con metodi molecolari
Numerosi agenti patogeni possono essere rilevati in campioni respiratori con amplificazione degli
acidi nucleici o metodi di reazione a catena della polimerasi (PCR)102. L'avvento della PCR real time
ha permesso di effettuare la diagnosi in poche ore. Molti test sono disponibili come confezioni
commerciali. I metodi PCR sono sempre più veloci rispetto ai metodi tradizionali e di solito sono più
sensibili, avendo potenzialmente un impatto significativo sulle decisioni di trattamento.
4.5.3 Terreni di coltura, condizione e microrganismi per campioni di BAL
Aspetti
clinici/
Campione
Terreni
standard
Incubazione
Temp
°C
Atmos
Tempo
Agar cioccolato*
35-37
5-10%
CO2
40-48
ore
condizioni
Bronchite
Infezione
torace
Malattia
ostruttiva
cronica
delle vie
aeree
Polmonite
comunitaria
Polmonite
nosocomial
e
BAL
+ Disco di
bacitracina o
incorporata nel
terreno
Lettura
colture
Giornaliera
Target
microrganismo(i)
H. influenzae
M. catarrhalis
S. aureus
S. pneumoniae
Possono essere
significativi altri
microrganismi in
coltura pura
Agar Sabouraud
(Dovrebbero
essere utilizzate
provette
standard con
tappo a vite se
si sospettano
fungi dimorfi)
Agar CLED o
MacConkey
35-37
aria
≥40 ore
Funghi
Giornaliera
Enterobatteriaceae
5g‡
42-44
35-37
5g‡
aria
40-48
ore
Pseudomonadi
Batteriologia | B 57 | Emissione no: 2.5 | Data di emissione: 02.06.14 I Pagina: 22 di 35
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Ricerca su lavaggio broncoalveolare, espettorato e campioni associati
Per queste condizioni aggiungere quanto segue
Aspetti
clinici/
Campione
Terreni
supplementari
Incubazione
Temp
°C
Atmos
Tempo
BAL
Agar Sale
Mannite/Cromo
geni
35-37
aria
BAL
Agar selettivo
B. cepacia
35-37
aria
condizioni
Bronchiecta
sie
Fibrosi
cistica
Fibrosi
cistica
Lettura
colture
Microrganismo (i)
ricercati
40-48
ore
Giornaliera
S. aureus
5 giorni
Giornaliera
per 5
giorni
B. cepacia complex
a 3, 5, 7 e
10 giorni
Ambiente
umido
Specie Legionella
Brodo o terreno
solido come per
B40
Polmonite o
sintomi tipo
influenzale
BAL
Agar selettivo
Legionella***
35-37
2.5 %
CO2
10 giorni
M. abscessus**
Altri Microrganismi da considerare –
Specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) e parassiti (B 31 - Investigation
of specimens other than blood for parasites).
* Se è utilizzato agar cioccolato con bacitracina incorporata nell’agar deve poi essere incluso un agar sangue
63
incubato in 5-10% di CO2 per l'isolamento di M. catarrhalis e S. pneumoniae . Può risultare difficile distinguere la
specifica morfologia degli Streptococchi su agar cioccolato e in questi casi può essere considerato un agar sangue.
** Accertamento per M. abscessus deve essere effettuato su richiesta o su un paziente in Controllo Annuale
Annuale21-24.
*** Terreno tamponato cefamandolo, polimixina, anisomycin, α-chetoglutarato (BMPA α o estratto di lievito carbone
tamponato, anisomycin agar (BCYEA)64-66.
‡ La coltura fungina potrebbe dover essere prolungata (fino a 6 settimane) se si sospettano patogeni fungini dimorfi;
in tali casi le provette bijoux con tappo a vite devono essere lette a 40 ore e poi lasciate in incubatore/cabina
termostatica.
4.5.4 Terreni ci coltura, condizioni e microrganismi per campioni di
espettorato
Aspetti
clinici/
Campione
Teerreno
Standard
condizioni
Bronchite
Infezione
torace
Malattia
ostruttiva
cronica
delle vie
aeree
espettorato
Agar cioccolato*
+ Disco di
bacitracina o
incorporata nel
terreno
Incubazione
Temp
°C
Atmos
Tempo
35-37
5-10%
CO2
40-48 ore
Lettura
colture
Microrganismo (i)
ricercati
Giornaliera
H. influenzae
M. catarrhalis
S. aureus
S. pneumoniae
Other organisms in
pure growth may be
significant
Polmonite
Per queste condizioni aggiungere quanto segue
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Ricerca su lavaggio broncoalveolare, espettorato e campioni associati
Aspetti
clinici/
Campione
Terreni
supplementari
Incubazione
Espettorato
Fibrosi
cistica
Immunoco
mpromessi/
IVU
Fibrosi
cistica29
Espettorato
Microrganismo (i)
ricercati
Giornaliera
Enterobatteriaceae
Temp
°C
Atmos
Tempo
Agar CLED o agar
MacConkey
35-37
aria
40-48 ore
Agar Sale Mannite
/Chromogeni
35-37
aria
40-48 ore
Giornaliera
S. aureus
Sabouraud agar
35-37
aria
40-48
ore†
≥40 ore
Funghi
Agar selettivo B.
cepacia
35-37
aria
5 giorni
Giornaliera
B. cepacia complex
condizioni
Bronchiecta
sie
Lettura
colture
Pseudomonadi
M. abscessus**
Brodo o terreno
solido come per
B40
Ricerche
micologiche
Espettorato
Sospetto di
Legionella
Espettorato
Sabouraud agar
35-37
aria
4048ore†
≥40hr
Funghi
35-37
2.5 %
CO2
10 giorni
a 3, 5, 7 e
10 giorni
Ambiente
umido
Specie Legionella
(Dopvrebbero
essere utilizzate
provette standard
con tappo a vite se
si sospettano
funghi dimorfi
Agar selettivo
Legionella***
Altri Microrganismi da considerare – specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium
species) e parassiti (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites).
* Se si utilizza agar cioccolato con bacitracina incorporata nell’agar deve poi essere seminato una piastra di agar sangue
incubato in 5-10% di CO2 per l'isolamento di M. catarrhalis e S. pneumoniae63. Su agar cioccolato può risultare difficile
distinguere la specifica morfologia degli Streptococchi e, in questi casi può essere considerato un agar sangue.
21-24
** Test per M. abscessus deve essere effettuato su richiesta o su un paziente per Controllo Annuale
.
*** Terreno tamponato cefamandolo, polimixina, anisomicina, α-chetoglutarato (BMPA α o estratto di lievito carbone
tamponato, anisomicin agar (BCYEA)64-66.
‡ La coltura fungina potrebbe dover essere prolungata (fino a 6 settimane) se si sospettano patogeni fungini dimorfi; in
tali casi le provette bijoux con tappo a vite devono essere lette a 40 ore e poi lasciate in incubatore/cabina termostatica.
4.6 Identificazione
Per l’identificazione fare riferimento alle singole SMI.
4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio
B. cepacia complex
Livello specie (cosultare ID 17 – Identification of Glucose
Non-Fermenting Gram Negative Rods
S. maltophilia
Livello specie
Enterobacteriaceae
Livello di coliformi per campioni comunitari
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Livello di specie per pazienti ricoverati
Klebsiella pneumoniae
Livello specie
Muffe
Livello genere
H. influenzae
Livello speciel
M. catarrhalis
Livello specie
N. meningitidis
Livello specie
Pasteurella
Livello specie
Pseudomonads
Livello "pseudomonadi"
P. aeruginosa
Livello specie mucoidi o non-mucoidi
S. aureus
Livello specie
S. pneumoniae
Livello specie
Lieviti
Livello “lieviti “
Legionella
Livello specie
Mycobacterium
Consultare B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species
Parassiti
Consultare B 31 - Investigation of specimens other than blood
for parasites
4.7 Prova di sensibilità agli antimicrobici
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o
EUCAST
4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico
N/D
4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento
Le Specie Legionella isolate da materiale clinico devono essere inviate per l'identificazione e la
sierotipizzazione.
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste
del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di
laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati
laboratori di riferimento.
Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili,
tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del campione:
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Batteriologia | B 57 | Emissione no: 2.5 | Data di emissione: 02.06.14 I Pagina: 25 di 35
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Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
5
Procedura di Refertazione
5.1 Microscopia
Se il paziente è immuno-competente, refertare i campioni di scarsa qualità o di tipo salivare come:
“Scarsa qualità, ricevuto campione/salivare. Per cortesia, se indicato clinicamente ripetere il
prelievo”.
Colorazione di Gram (se eseguita).
Segnalare il numero di cellule epiteliali, Globuli Bianchi e microrganismi riscontrati.
Segnalare funghi e ife osservate.
Legionella pneumophila detected by immunofluorescence or
Legionella pneumophila not detected by immunofluorescence.
P. jiroveci immunofluorescenza
Oocisti di P. jiroveci riscontrate con immunofluorescenza o
Oocisti di P. jiroveci NON riscontrate con immunofluorescenza.
Microscopia per Legionella, specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species) e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for
parasites).
5.1.1 Tempo per referto microscopico
Tutti i risultati dovrebbero essere inviati al medico richiedente non appena sono disponibili, tranne
nei casi in cui disposizioni alternative specifiche siano state concordate con i richiedenti.
I risultati urgenti devono essere comunicati per telefono o trasmessi per vi a informatica in
conformità con le disposizioni locali.
5.2 Coltura
Refertare i microrganismi isolati clinicamente significativi e la loro concentrazione se si sono
utilizzati il BAL e un metodo semi-quantitativo o
Refertare altri tipi di crescita, come: Flora mista delle vie aeree superiori o
Refertare assenza di crescita o
Refertare assenza di crescita di microrganismo specifico alla diluizione 10-6 del campione (per
pazienti con FC)
Refertare i risultati delle Indagini supplementari.
Batteriologia | B 57 | Emissione no: 2.5 | Data di emissione: 02.06.14 I Pagina: 26 di 35
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Ricerca su lavaggio broncoalveolare, espettorato e campioni associati
5.2.1 Tempo di refertazione della coltura
Dovrebbero essere rilasciati risultati provvisori o preliminari sulla rilevazione di isolati
potenzialmente significativi da un punto di vista clinico non appena si rileva la loro crescita, a meno
che con i richiedenti siano state concordatele disposizioni alternative specifiche.
Risultati urgenti devono essere comunicati per telefono o trasmessi per via informatica in
conformità con le disposizioni locali.
Ai rapporti preliminari e verbali dovrebbero seguire nel più breve tempo possibile le refertazioni
finale scritte o generate dal computer.
Indagini supplementari, specie Mycobacterium (BS40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species), e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for
parasites).
5.3 Prova di Sensibilità agli antibiotici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudenti gli antimicrobici
secondo i protocolli locali e nazionali raccomandati.
6 Notifica al PHE103,104o Equivalente56-59
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare
all’Health Protection Agency (HPA) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva’, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della HPA.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria all’’HPA. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente all’HPA gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni dell’HPA hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
Note: L’isolamento di N. meningitidis dovrebbe essere segnalato al CCDC
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#healthprotection-regulations-2010
Esistono accordi diversi in Scotland56,57, Wales58 e Northern Ireland59.
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Appendice 1: Campioni BAL per coltura
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Appendix 2: Campioni espettorato per coltura
Batteriologia | B 57 | Emissione no: 3 | Data emissione: 02.10.15 | Pagina: 29 di 35
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easy handling and, where necessary, reduce as far as possible contamination of, and leakage from,
the device during use and, in the case of specimen receptacles, the risk of contamination of the
specimen. The manufacturing processes must be appropriate for these purposes".
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