Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

Ricerche Microbiologiche Standard del
Regno Unito
Ricerca su Lavaggio Broncoalveolare, Espettorato e
Campioni Associati
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Batteriologia I B 57 I Emissione no: 2.5 I Data emissione: 02.06.14 I Pagina 1 di 33
© Crown copyright 2014
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Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul
sito web http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e
controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i
laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo
documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
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Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO ................................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................8
SCOPO .......................................................................................................................................8
INTRODUZIONE .........................................................................................................................8
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................14
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................18
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE ..........................................................................................18
3
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ..................................................19
4
PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE ................................................................19
5
PROCEDURA DI REFERTAZIONE ..............................................................................26
6
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................27
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................28
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
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Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail:
[email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con
il sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
7/02.06.14
Emissione eliminata. no
2.41
Emissione inserita no.
2.5
Sezione(i) interessate
Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato che
evidenzia il passaggio della Health Protection Agency
alla Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Documento intero .
Rinominata la pagina di “Stato come Scopo” e
Obiettivo ed aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
La bibliografia degli standard di sicurezza e notifica è
stata revisionata ed aggiornata.
Il contenuto scientifico rimane invariato.
Modifica No/Data.
6/02.08.12
Emissione eliminata. no
2.3
Emissione inserita no.
2.4
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Documento presentato in nuovo formato.
Documento intero.
Il termine '' contenitore a tenuta ermetica con
marchiatura CE si riferisce al testo specifico nell’ambito
della Direttiva UE per Dispositivi Medico-Diagnostici in
vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) e alla direttiva stessa
EC1,2.
Edito per chiarezza
Riorganizzazione di parte del testo.
Piccole modifiche. .
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Sezione su raccolta, trasporto,
conservazione e procedura sul
campione
Bibliografia
Riorganizzata con cambio numerazione
Bibliografia in parte aggiornata
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SMI del RU#: Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti
che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono
ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la
diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano
la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche
microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte
delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti
del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche
(prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli
algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la
diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note
orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad
esempio la validazione della prova, la garanzia della qualità, la definizione dell'incertezza della
determinazione.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo. Nel Regno Unito le SMI rappresentano strategie omogenee per
le prove diagnostiche e la programmazione degli interventi di sanità pubblica
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE,
NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.L'elenco delle
organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di una organizzazione in una
SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I
rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi
di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere
rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a
quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento
bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un
processo di consultazione.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata
dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida
prodotte dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO
9001:2008 .Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si
devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC
(General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
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pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard
minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel
Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i
requisiti ell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono
essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.Le prestazioni della SMI
dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature
utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli
messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono
partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del
controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il
coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di
operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà
strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di
partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al
nostro sito web.
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e
di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313. I Gruppi di Lavoro SMI
sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli
appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano
modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali
modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate
nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere
sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da
parte dell’ente accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Investigation of Bronchoalveolar Lavage, Sputum and
Associated Specimens. UK Standards for Microbiology Investigations. B 57 Emissione 2.5.
http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf
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Scopo del Documento
Tipo di Campione
Aspirato bronchiale, lavaggio bronco alveolare, aspirato trans toracico, aspirato trans tracheale,
spazzolamento bronchiale, campione da catetere protetto, lavaggio bronchiale, campione da tubo
endotracheale, sputo – espettorato, tamponi da colpi di tosse/piastre
Scopo
Questa SMI descrive l’isolamento di microrganismi noti che causano infezioni respiratorie
da espettorato, lavaggio broncoalveolare e campioni associati (consultare G 8 Respiratory viruses e V 22 - Immunofluorescence and isolation of viruses from respiratory
samples).
Questa SMI deve essere usata congiuntamente ad altre SMI
Introduzione
La ricerca e l’isolamento di microrganismi responsabili di polmonite dipendono da:
•
•
•
•
Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie
Assenza di contaminazione della flora del tratto respiratorio superiore
Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali.
Trattamenti antimicrobici recenti in corso
La differenziazione fra colonizzazione tracheobronchiale e vera infezione polmonare può risultare
difficile.
La definizione dell’Infezione polmonare del tratto respiratorio (LRTI - Lower Respiratory Tract
Infection) include la polmonite, nella quale si sviluppa un’infiammazione del parenchima
polmonare, ed infezioni quali la bronchiolite che interessa le vie aeree di piccolo calibro. L’ascesso
polmonare, nel quale il parenchima è sostituito da cavità ripiene di pus, e l’empiema, in cui il pus
occupa la cavità pleurica, sono le manifestazioni meno frequenti delle patologie delle LRTI.
Polmonite
La polmonite può essere classificata in funzione della sede di acquisizione, in comunitaria o
nosocomiale (spesso definita come acquisita più di 48 ore dopo l’ospedalizzazione). Può essere
primaria, manifestandosi in persona senza precedenti fattori di rischio noti, o secondaria. Molte
condizioni sono associate ad aumentare il rischio di polmonite. I comuni fattori di rischio includono
malattie croniche del polmone, quali una malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD, Chronic
Obstructive Polmunary Disease), diabete mellito, insufficienza cardiaca o renale ed
immunosoppressione (congenita o acquisita). I ridotti livelli di coscienza e un debole riflesso
faringeo e della tosse rappresentano i fattori di rischio per la polmonite da aspirazione. Le infezioni
recenti da virus respiratori, in modo particolare da virus influenzale, rappresentano un altro fattore
di rischio. Sono noti sintomi clinici ed indici di laboratorio che possono essere utilizzati per
verificare la gravità della polmonite in un singolo paziente, alcuni di questi, se presenti, sono
predittivi di un aumentato rischio ad evoluzione sfavorevole3.
L’eziologia della polmonite varia in funzione della sede d’acquisizione, comunitaria o nosocomiale,
e della presenza di fattori di rischio. Molti batteri riscontrati come colonizzanti delle vie aeree
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congiuntam
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superiori sono stati implicati nella polmonite. Il trattamento antibiotico e l’ospedalizzazione
modificano il tipo di flora colonizzante, conducendo ad un aumento dei bacilli Gram negativi
aerobi4. Questi fattori modificano la sensibilità e la specificità della coltura dell’espettorato come
prova diagnostica ed i risultati devono sempre essere interpretati in funzione delle informazioni
cliniche5. I risultati delle colture dell’espettorato sono spesso non affidabili e la sensibilità
dell’esame colturale è scarsa per molti patogeni, sebbene la coltura e la sensibilità agli antibiotici
da campioni di escreato di pazienti affetti da gravi esacerbazioni di COPD possono fornire risultati
importanti6.
Polmonite comunitaria
L’agente causale più frequente è lo Streptococcus pneumoniae, che rappresenta più del 60% dei
casi comunitari rilevati dalle indagini e può essere multiresistente. Si può manifestare in soggetti di
tutte le età, inclusi quelli senza fattori di rischio noti. Altri batteri patogeni tendono a causare
polmonite in presenza di specifici fattori di rischio. I pazienti con COPD sono maggiormente a
rischio di polmonite da Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis, come pure i pazienti affetti
da HIV La polmonite da Staphylococcus aureus si manifesta sia nel contesto di un’infezione
nfluenzale recente o, meno frequentemente, come risultato di una diffusione ematogena
proveniente da una sede distante, COPD o da aspirazione. I bastoncini Gram negativi aerobi sono
raramente causa di polmonite comunitaria. Occasionalmente la Klebsiella pneumoniae causa una
grave polmonite necrotizzante, particolarmente in pazienti con un’anamnesi d’abuso di alcool e
nelle persone senza domicilio (polmonite dei “Friedlandars”).
Il Mycoplasma pneumoniae causa fino al 20% delle polmoniti comunitarie, secondo solo allo S.
pneumoniae. Si manifesta tendenzialmente in forma epidemica ogni 4-5 anni e colpisce i gruppi
più giovani. La Chlamydia pneumoniae è un patogeno esclusivamente umano, ma la polmonite da
Chlamydia psittaci e Coxiella burnetti, si manifesta in soggetti con anamnesi di consistente
esposizione (uccelli ed animali di fattoria).7 Questi agenti eziologici sono responsabili di uno scarso
numerosi di casi. La Legionella pneumophila è una rara causa di epidemie di polmonite
comunitaria acquisita e circa il 50% dei casi osservati nel Regno Unito dichiara nell’’anamnesi
viaggi recenti. I virus respiratori, quali VRS, influenza ed adenovirus possono causare
occasionalmente la polmonite virale primitiva. Altre rare cause di polmonite comunitaria
comprendono le specie Pasteurella e Neisseria meningitidis8.
Polmonite nosocomiale
Rappresenta la seconda fra le infezioni nosocomiali più frequenti. Il rischio aumenta in presenza di
malattie latenti e di vari interventi e procedure. La ventilazione di tipo meccanico rappresenta il
maggior fattore di rischio. I pazienti con malattie critiche che richiedono una prolungata
ventilazione di tipo meccanico sono esposti a specie Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
(come A. baumannii). I bacilli aerobi Gram negativi, inclusi gli appartenenti alle Enterobacteriaceae
(quali Klebsiellla e specie Enterobacter e P. aeruginosa sono implicate in più del 60% dei casi9. I
cateteri intravascolari ed i portatori nasali rappresentano fattori di rischio per polmoniti causate da
S. aureus meticillino resistente (MRSA, methicillin resistant S. aureus).
Polmonite da aspirazione
Si manifesta quando il contenuto orofaringeo raggiunge il tratto respiratorio inferiore. Costituiscono
fattori di rischio ridotti livelli di coscienza, come in caso di trauma cranico o d’abuso di droga, un
debole riflesso faringeo e della tosse, che possono seguire ad un ictus o altro tipo di malattia
neurologica.
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Ascesso Polmonare
Può essere secondario a polmonite da aspirazione; in questo caso è più frequentemente implicata
la zona polmonare media di destra. Altri microrganismi possono portare a formazione di focolai
multipli e la presenza di ascessi multipli di piccole dimensioni (<2cm di diametro) è talvolta
segnalata come polmonite necrotizzante. La polmonite causata da S. aureus e K. pneumoniae può
sviluppare questa forma clinica. La nocardiosi si manifesta spesso in un quadro di
immunosoppressione, può sviluppare ascessi polmonari. Ascessi conseguenti a diffusione
ematogena di un’infezione a sede distante si possono manifestare in condizioni infettive quali
l’endocardite infettiva. Il gruppo S. anginosus, (S. anginosus, S. constellatus e S. intermedius ) è
stato isolato in casi di ascessi polmonari da infezioni polimicrobiche associato ad anaerobi orali.
Burkholderia pseudomallei può causare ascessi polmonari o polmonite necrotizzante in soggetti
che hanno visitato aree endemiche (principalmente il sud est Asiatico e l’Australia del nord),
specialmente in presenza di diabete mellito10.
La sindrome di Lemierre o necrobacillosi origina da un’infezione acuta orofaringea. La
tromboflebite infettiva della vena giugulare interna sostiene la diffusione di emboli e l’infezione
metastatica. Il polmone è la sede più frequentemente coinvolta e si possono sviluppare ascessi
multifocali. Il Fusobacterium necrophorum, è il patogeno più frequentemente isolato da emocolture
in pazienti affetti da questa sindrome11.
Fibrosi cistica (FC)
La fibrosi cistica è causata da un difetto del gene FC che regola la conducibilità transmembrana
del trasporto degli ioni e dell’acqua attraverso l’epitelio12. Ciò conduce ad una malattia polmonare
progressiva associata ad infezioni, che è la principale causa di morbilità e di mortalità nei pazienti
con FC. I principali patogeni sono S. aureus, H. influenzae (di solito non capsulato nei pazienti con
FC ) S. pneumoniae, e pseudomonadi, in modo particolare i ceppi produttori di muco di P.
aeruginosa12,13. Da un singolo campione possono essere isolati ceppi di P. aeruginosa con spettri
diversi di sensibilità agli antibiotici. Possono essere presenti anaerobi, contemporaneamente ad
Aspergillus fumigatus e micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis (MOTT)12-14.
La resistenza agli antibiotici, in modo particolare di Burkholderia cepacia complex,
Stenotrophomonas maltophilia (prima comprese entrambe nel genere Pseudomonas) e di P.
aeruginosa, limita le possibilità di trattamento15,16. Per Stenotrophomonas maltophilia è indicato il
trattamento con co-trimossazolo in funzione della sensibilità in vitro17. L’analisi delle sequenze
nucleotidiche del gene recA suggerisce che Burkholderia cepacia complex è rappresentato da 9
genomovar. La maggior parte di queste è stata classificata come specie singola (B. cepacia, B.
multivorans, B. stabilis, B. vietnamensis, B. ambifaria, B. athina, B. pyrrocinia). Si può verificare la
trasmissione fra i pazienti del B. cepacia complex ed alcuni di questi soccombono in breve tempo
per la “sindrome da B. cepacia” rappresentata da una polmonite fulminante accompagnata talvolta
da setticemia18,19. E’ stata anche segnalata la trasmissione nosocomiale di Burkholderia gladioli20.
I funghi, in modo particolare le specie Aspergillus, sono implicate nelle infezioni di pazienti affetti
da fibrosi cistica e non sempre rispondono alla terapia antibiotica21. L’Aspergillus fumigatus è la
specie di Aspergillus che più frequentemente infetta l’uomo. Le manifestazioni polmonari
nell’ospite che non presenta insufficienze gravi dell’immunità cellulare ed umorale comprendono
l’aspergillosi broncopolmonare allergica in pazienti da asma o da fibrosi cistica.
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Malattia da Micobatteri
L’infezione polmonare primitiva da Mycobacterium tuberculosis può condurre alla formazione del
‘complesso primario’ specialmente nell’infanzia. La localizzazione polmonare può essere
relativamente piccola, ma i linfonodi drenanti dell’ileo appaiono consistentemente ingrossati e
possono rompersi, diffondendo materiale infetto in altre sedi polmonari. E’ in questo stadio che si
manifesta la diffusione miliare ad altri organi per via ematogena e linfatica. Gli adolescenti e gli
adulti possono avere un’infezione primaria asintomatica, un tipico complesso primario o
un’infezione che progredisce in una tipica tubercolosi cronica cavitaria. La manifestazione cavitaria
cronica è di solito osservata in corso di riattivazione di un’infezione primaria e gli apici del polmone
sono le sedi più frequentemente interessate. La tosse che accompagna questo processo produce
aerosol di particelle infette ed in questo modo altre persone possono essere infettate. Micobatteri
diversi dai bacilli tubercolari sono stati riscontrati nell’uomo in corso di malattia, in modo particolare
in quelli con immunosoppressione o malattie soggiacenti. Questi includono Mycobacterium aviumintracellulare, M. kansasi, M. malmoense, M. xenopi, M. fortuitum, e M. haemophilum. Questi sono
sovente resistenti alla chemioterapia antitubercolare standard22. La malattia da Micobatteri può
associarsi all’aspergillosi polmonare cronica.
Fare riferimento alla B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species.
Infezioni da Nocardia e Actynomyces23-25
La nocardiosi e l’actinomicosi sono patologie rare che possono interessare oltre il polmone altri
sistemi.
Le specie Nocardia e quella actinomyces sono rare cause spesso riscontrate in sedi diverse da
quella polmonare.
Le specie Nocardia sono spesso presenti nel polmone dove causano una polmonite acuta, spesso
di tipo necrotizzante. Questa evenienza è di solito associata a formazione di cavità. Può inoltre
causare un nodulo polmonare a lenta espansione e polmonite, spesso associata ad empiema.
Disordini di tipo immunologico quali alcolismo, trapianto d’organo ed infezione da HIV sono
presenti nella maggior parte dei casi (oltre 60%) nei soggetti affetti da nocardiosi.
Le specie Actinomices causano infezione toracica che può coinvolgere ii polmoni, pleura,
mediastino o parete toracica. Spesso i casi evolvono non diagnosticati fino all’empiema o si
sviluppa una fistola della parete toracica. L’aspirazione di materiale orale rappresenta un fattore di
rischio per lo sviluppo dell’actinomicosi toracica; le condizioni predisponesti includono alcolismo,
infarto cerebrale, overdose di droga, anestesia generale, crisi epilettica, coma diabetico o shock.
I campioni idonei per la ricerca di entrambi questi microrganismi sono pus, campione di tessuto o
biopsia (consultare B 14 - Investigation of abscesses and post-operative wound and deep-seated
wound infections e B 17 - Investigation of tissues and biopsies).
Infezioni parassitarie
Alcune infezioni da elminti possono provocare la sindrome Polmonare Tropicale Eosinofila,
caratterizzata da infiltrati polmonari irregolari ed eosinofilia associati a sintomi quali tosse, febbre e
perdita di peso. Questi segni e sintomi sono associati al passaggio delle forme larvali nei polmoni
ed includono Ascaris lumbricoides, vermi uncinati e Strongyloides stercoralis. Il distosoma
polmonare, Paragominus westermanii ha una diffusa distribuzione ed è particolarmente presente
in Estremo Oriente, subcontinente Indiano ed Africa Occidentale. L’infezione è acquisita dall’uomo
con consumo di granchi e gamberi d’acqua dolce non cotti, colonizzati da metacercarie incistate.
Sebbene l’infezione possa essere asintomatica, consistenti infestazioni si manifestano con infiltrati
polmonari che possono progredire in tosse produttiva cronica con dolore toracico pleurico. Le uova
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di P. westermanii possono essere dimostrate nell’escreato (consultare B 31 - Investigation of
specimens other than blood for parasites) 26.
Infezioni fungine
L’aspergillosi polmonare invasiva è un problema comune in aumento nei pazienti ospedalizzati che
ricevono corticosteroidi, specialmente negli immunodepressi o in quelli con precedente malattia
polmonare. Valutazioni particolareggiate valutano che si manifestano ogni anno nel Regno Unito ∼
4000 – 5000 casi. La maggior parte di loro non è mai stata diagnosticata per scarsa sensibilità
degli accertamenti, o riscontrata positiva in fase troppo avanzata di malattia. L’Aspergillus
fumigatus è la specie di Aspergillus che più frequente infetta l’uomo27. La determinazione del
galattomannano serico e il BAL aumentano le possibilità diagnostiche , come pure le ricerche con
metodi molecolari 28. La sintomatologia polmonare in soggetti non affetti da riduzione dell’immunità
cellulare od umorale comprende aspergillosi broncopolmonare allergica nei pazienti con asma o
fibrosi cistica, aspergillosi polmonare cavitaria cronica ed aspergilloma singolo. Si calcola che nel
Regno Unito sono presenti ∼ 40.000 casi di ABPA e centinaia di casi di aspergillosi polmonare
cronica.
La polmonite da Pneumocistis e causata da Pneumocystis jiroveci (in precedenza carinii). E’ la
causa più frequente di polmonite grave nei pazienti con infezione avanzata da HIV, e conferma la
malattia AIDS29. Si manifesta in numerosi altri adulti e bambini in condizione di
immunocompromissione, sebbene il cotrimossazolo sia efficace nella maggior parte dei casi. Si
presenta in modo sub-acuto con tosse, febbre ed ipossia come quadro dominante, spesso
l’esordio è subdolo. I migliori campioni diagnostici sono il BAL e le biopsie transbronchiali, ma il
prelievo con quest’ultima tecnica comporta alcuni rischi. Sono utili l’espettorazione indotta e gli
sciacqui, ma richiedono metodi di ricerca molecolari.
Alcuni casi insoliti di LRTI di origine fungina sono endemici in aree geografiche ben definite.
Sebbene molte infezioni abbiano andamento subclinico, quelle clinicamente evidenti sono
occasionalmente importate nel Regno Unito. Si manifestano in persone con normale assetto
immunitario, ma tendono ad assumere un andamento più severo negli immunocompromessi. La
diagnosi dovrebbe essere presa in considerazione nei turisti che ritornano da zone endemiche che
presentano affezione respiratoria o polmonite, specialmente in quelli senza risposta alla terapia
standard. Queste infezioni includono: istoplasmosi, causata da Histoplasma capsulatum (sud est
USA, America Centrale); coccidiomicosi, causata da Coccidiodes immitis (sud ovest USA, Sud e
Centro America) e blastomicosi, causata da Blastomyces dermatitidis (USA orientale, Africa).
Sebbene queste infezioni abbiano caratteristiche specifiche, spesso è difficile differenziarle
clinicamente dalle altre cause di infezione polmonare, specialmente nelle fasi precoci. La
paracoccidiomicosi causata dal Paracoccidioides brasiliensis (America Centrale e del Sud) causa
solitamente un’infezione polmonare primitiva asintomatica che si può riattivare se si riduce la
difesa immunitaria.
Cryptococcus neoformans è una agente eziologico non comune di polmonite nei soggetti normali,
può essere associato a meningite. Ha distribuzione ubiquitaria.
Le specie Candida sono molto rare nei casi di LRTI. Occasionalmente l’infezione si manifesta
come risultato di una diffusione ematogena. La diagnosi è difficile perché nei pazienti
immunocompromessi trattati con antibiotici le vie aeree possono essere colonizzate.
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Tipi di Campione30
Lavaggio broncoalveolare (BAL - Bronchoalveolar lavage)
I campioni che si possono ricevere includono il lavaggio broncoalveolare e campioni prelevati
tramite broncoscopio con spazzolamento protetto, campioni da spazzolamento bronchiale ‘cieco’ e
lavaggio broncoalveolare non diretto.
Dopo inserzione di un broncoscopio flessibile si ‘lava’ con soluzione fisiologica sterile un segmento
polmonare, ottenendo in tal modo componenti cellulari e non della superficie della mucosa del
tratto respiratorio inferiore. E’ un metodo affidabile per una diagnosi eziologica definitiva di
polmonite o di altre infezioni polmonari19,31,32.
La polmonite associata a respiratore comporta elevata mortalità, ma è difficile da diagnosticare
con criteri clinici e microbiologici. Questi criteri dovrebbero essere utilizzati se permane una
diagnosi controversa. La scarsa sensibilità della coltura dell’escreato nella diagnosi di polmonite
nei pazienti ospedalieri sottoposti a ventilazione ha portato allo sviluppo di numerose tecniche per
la raccolta dei campioni del tratto respiratorio inferiore, alcune con l’ausilio di broncoscopi a fibre
ottiche. Il conteggio di un solo tipo batterico superiore a 103 ufc/mL in un campione ottenuto
broncoscopicamente con spazzolamento correla con la diagnosi istologica di polmonite32. I risultati
su campione da spazzolamento e da lavaggio broncoalveolare sono fra loro confrontabili se si
utilizza la soglia di 104 ufc/mL per il lavaggio broncoalveolare, sebbene questo non sia
raccomandato in questa MSI perché l’aspetto metodologico ottimale, l’interpretazione ed il
significato clinico permangono controversi33. Le tecniche non-dirette hanno fornito risultati
confrontabili con i metodi broncoscopici33,34.
Lavaggio broncoalveolare non diretto (NBL, non-directed bronchoalveolar lavage)
Inserire un catetere da suzione, preferibilmente un catetere BAL protetto per ridurre al minimo la
contaminazione sotto il tubo endotracheale fino a che non incontra resistenza. Iniettare e poi
aspirare un’aliquota di soluzione fisiologica sterile. Questo metodo fornisce un campione delle
basse vie respiratorie senza l’utilizzo del broncoscopio e senza il possibile rischio di aspirazione
transtracheale.
Campioni da BAL e NBL
Nei campioni BAL è possibile riscontrare batteri, virus, protozoi e funghi responsabili dell’infezione
polmonare35-39. Sebbene l’isolamento dal BAL di specie di Aspergillus sia di un certo valore
diagnostico, nei pazienti con malattia invasiva, la tecnica scarsamente sensibile, e l’avvento della
PCR ha consentito lo sviluppo di un metodo che supera questo problema40,41. I campioni da BAL
sono particolarmente utili nella diagnosi di polmonite da Pneumocistis jiroveci42 (prima nota come
Pneumocistis carinii43-45), nella polmonite da Legionella pneumophila46 (consultare ID 18 Identification of Legionella species) e per la ricerca di Mycobacterium tuberculosis con
manifestazione tipo polmonite (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species)42,47.
Aspirato bronchiale
Raccolta di materiale dalle grandi vie del tratto respiratorio per aspirazione diretta con
broncoscopio flessibile.
Spazzolamento bronchiale
Utilizzo di un catetere protetto all’interno di un broncoscopio (una spazzola all’interno di due
cateteri chiusi nella parte terminale con un tappo di glicol di polietilene) per prelevare materiale
dalle vie aeree.
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Lavaggi bronchiali
I lavaggi bronchiali sono raccolti in modo simile agli aspirati bronchiali, ma le procedure
interessano l’aspirazione di piccole quantità di soluzione fisiologica introdotta dalle principali vie
dell’albero respiratorio48.
Campione da catetere protetto
Il materiale è raccolto per via broncoscopia in modo simile allo spazzolamento bronchiale. Si
utilizzano un catetere interno ed uno esterno con un tappo di glicol di polietilene all’estremità per
prevenire la contaminazione nasofaringea. Quando si incontra resistenza all’introduzione, si
espelle il tappo ed il campione è prelevato tramite il catetere interno.
Aspirato transtoracico
I campioni sono ottenuti attraverso la parete toracica con un ago inserito fra le costole. Questa
procedura può essere intrapresa per campionare, ad esempio, un aspergilloma, un ascesso o
qualsiasi lesione polmonare localizzata accessibile.
Aspirato transtracheale
L’aspirazione transtracheale rappresenta anch’essa una procedura che comporta rischi clinici e
pertanto nel Regno Unito è raramente utilizzata nel RU. E’ stata descritta l’importanza clinica della
definizione eziologia della polmonite acuta batterica49. La tecnica prevede l’inserzione di un grosso
ago contenente un catetere attraverso lo spazio cricoideo all’interno della trachea. Si rimuove in
seguito l’ago lasciando il loco il catetere. Si utilizza una siringa connessa al catetere per aspirare le
secrezioni. Se non si ottiene materiale, si iniettano 2-3 mL di soluzione fisiologica (priva di additivi
antimicrobici) e si ripete l’aspirazione.
Aspirato tracheale
Gli aspirati tracheali sono raccolti tramite un tubo endotracheale. Sono soggetti ad alcune
limitazioni come i campioni di escreato.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMi del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e
specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche
le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono
assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni Selettivi per Procedure di Screening
I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti possono
essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve pertanto essere
ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di una piastra di terreno.
Contenitori per Campioni1,2
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere
quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I
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requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari
Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve
consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la
contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il
rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a
questi scopi''.
Colorazione Gram
La colorazione Gram su campioni di escreato possono essere utilizzate per verificare la qualità del
campione e per definire in via presuntiva i probabili patogeni. La determinazione della qualità del
campione si avvale del numero di leucociti polimorfonucleati e delle cellule epiteliali squamose
(SEC, squamous epithelial cells) presenti: per le colture devono selezionati campioni purulenti,
quelli non purulenti o contaminati con cellule squamose devono essere rifiutati. Un certo numero di
autori ha giustificato il rifiuto dell’escreato avvalendosi del conteggio del numero di SEC e/o di
leucociti per campo50. Altri giustificano i criteri di rifiuto sul rapporto leucociti/SEC51. Il vantaggio
dell’utilizzo del rapporto è quello di compensare la possibilità di una distribuzione cellulare non
uniforme nello striscio. Gli escreati dei pazienti immunodepressi od ove sussistano difficoltà per la
ripetizione del campione non dovrebbero essere rifiutati52.
La colorazione di Gram può anche essere utile per predire la probabilità di riscontro dei patogeni in
funzione delle loro caratteristiche morfologiche51,53. I campioni di escreato spesso non sono
valutati prima della coltura del campione e la loro preparazione per la colorazione Gram avviene
contemporaneamente alla procedura sul campione. Si deve porre attenzione all’interpretazione del
campione di escreato valutato con colorazione Gram, poiché l’uso di antimicrobici può rendere non
vitali i microrganismi osservati sul vetrino54. Può essere inappropriato identificare i microrganismi
in caso di grossolana contaminazione da flora orofaringea. La sensibilità del Gram può variare e
spesso dipende da un nuovo controllo del vetrino da parte dell’operatore54. Devono essere
considerate tutte le caratteristiche del campione, quali la colorazione Gram, l’esame colturale e la
situazione clinica del paziente55.La colorazione Gram consente l’identificazione di ife di lieviti, ma è
di qualità inferiore rispetto all’idrato di potassio ( KOH) ed ai coloranti fluorescenti.
Interpretazione degli strisci colorati con Gram
Sono stati proposti numerosi metodi per l’interpretazione degli strisci colorati con Gram con i
conteggi dei microrganismi e globuli bianchi49,56. Nei campioni di BAL la colorazione Gram può
essere utile nel predire il risultato quantitativo della coltura57. In alcuni casi, la chemioterapia
antimicrobica può essere iniziata in funzione dei risultati dello striscio colorato con Gram prima
della disponibilità dei risultati dell’esame colturale.
Coloranti fluorescenti
Nella ricerca dei bacilli acido-alcool resistenti sono preferiti coloranti quali auramina-fenolo perché
più rapidi e sensibili rispetto alla colorazione di Ziehl Neelsen (Z-N)58. Gli strisci auramina positivi
possono essere confermati con una sovra-colorazione di Z-N.
Calcofluor bianco, blankophor ed altri coloranti fluorescenti sono particolarmente idonei per
visualizzare le ife fungine. Sono lievemente più sensibili delle colorazioni con KOH, e la lettura è
più rapida. Forniscono inoltre informazioni morfologiche più dettagliate rispetto ai coloranti KOH,
sufficienti a riconoscere i Mucorales (grandi ife non settate) da quelle simil Aspergillus (ife sottili,
settate, con ramificazioni a 45°).
I coloranti per Pneumocystis jiroveci, agente causale della polmonite pneumocistica, sono per lo
più fluorescenti.
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Può essere richiesta la microscopia in fluorescenza per le specie Legionella.
Terreni di coltura
Per l’isolamento di H. influenzae e di S. pneumoniae l’agar sangue arricchito con NAD ha qualità
inferiore rispetto all’agar cioccolato59. Scarso miglioramento nella percentuale di isolamento è stato
ottenuto con l’incubazione prolungata (48 ore) delle colture.
Le valutazioni hanno dimostrato che l’agar cioccolato con bacitracina incorporata (o agar
cioccolato con disco di bacitracina) può essere utilizzato al posto dell’agar cioccolato. Le
percentuali di isolamento di H. influenzae non sono significativamente differenti quando si
utilizzano questi terreni. In ogni caso, la flora competitiva si riduce in modo significativo sull’agar
con bacitracina incorporata ed è superiore la quantità di crescita di H. influenzae, facilitando il
trasferimento delle colonie60.
E’ raccomandato l’utilizzo dell’agar selettivo Burkholderia cepacia nell’esame colturale di campioni
da pazienti con fibrosi cistica. Il suo grado di selettività facilita la crescita di Burkholderia cepacia e
sotto questo aspetto è superiore al CLED agar61. L’agar selettivo B. cepacia può consentire la
crescita di Burkholderia gladioli e di altre pseudomonadi.
Per la ricerca dei funghi tutti i terreni per i batteri hanno qualità notevolmente inferiori a quelli tipo
agar Sabouraud destrosio. Tutti i materiali dei pazienti a rischio devono essere seminati di routine
su terreni per lo sviluppo dei funghi. La temperatura d’incubazione condiziona l’isolamento:
campioni ad elevata carica di specie Candida possono oscurare lo sviluppo di specie Aspergillus, e
le colture a 42-45°C inibiscono la crescita delle specie Candida, consentendo quello delle specie
Aspergillus. La refrigerazione riduce il riscontro dei Mucorales.
Tecniche colturali semi-quantitative
Le tecniche colturali semi-quantitative per l’escreato sono rapide e semplici e forniscono risultati
attendibili. Un microrganismo che determina un’infiammazione dei polmoni è di solito presente
nell’escreato in numero superiore a quelli che colonizzano la faringe e contaminano il campione
durante l’espettorazione. I microrganismi sono distribuiti in modo irregolare nell’escreato e ciò può
condurre a risultati inaccurati. La liquefazione ed una vigorosa miscelazione consentono un
campionamento uniforme. L’omogeneizzazione e la diluizione riducono la viscosità del campione
senza danneggiare alcun microrganismo presente62. Risultati selettivi possono essere ottenuti
eseguendo l’esame colturale d’appropriate diluizioni dell’escreato63.
Ricerca dell’antigene su BAL
Nei pazienti con possibile aspergillosi invasiva, la ricerca dell’antigene è considerata un mezzo
utile per definire la diagnosi, se eseguita prima della somministrazione al paziente di terapia
antifungina. I risultati di numerose ricerche in pazienti neutropenici dimostrano la elevata
sensibilità, ma questa non è ancora stata studiata nei trapiantati di organi solidi e nei pazienti con
AIDS.
La ricerca dell’antigene criptococcico nel materiali liquidi del BAL è opportuna per definire la
diagnosi di polmonite criptococcica.
Metodi Molecolari di Ricerca
Con l’amplificazione dell'acido nucleico o metodi della polimerasi a catena (PCR
nei campioni respiratori si possono rilevare numerosi agenti patogeni)64. L'avvento della PCR realtime ha permesso di effettuare la diagnosi in poche ore. Sono disponibili molti saggi commerciali. I
sistemi di estrazione impiegati sono specifici per l'organismo bersaglio, inoltre è importante
garantire l'assenza di contaminazione del campione con il DNA fungino prima dell’effettuazione
della PCR. Si deve considerare che i metodi PCR sono più veloci rispetto a quelli tradizionali, di
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solito sono più sensibili e, potenzialmente sono in grado di avere un impatto significativo sulle
decisioni concernenti il trattamento
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1
Considerazione sulla Sicurezza1,2,65-79
1.1 Prelievo, T rasporto e Conservazione del campione1,2,65-68
Usare tecnica asettica
Raccogliere i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli in
sacchetti di plastica sigillati.
E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.
1.2 Procedura sul Campione1,2,65-79
Condizioni di Contenimento di Livello 3.
Prima della colorazione per micobatteri, i materiali strisciati devono essere fissati ponendo il
vetrino su una piastra di riscaldamento (65 – 75°C), all’interno di una cabina di sicurezza, fino alla
disidratazione del materiale, poi posizionarli su un portavetrini o altro supporto idoneo.
Nota: La fissazione al calore può non uccidere tutte le specie di Mycobacterium80. I vetrini devono
essere manipolati con attenzione.
Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere
eseguite in cabina microbiologica di sicurezza71.
La centrifugazione deve essere eseguita in contenitori chiusi, aperti in seguito in una cabina
microbiologica di sicurezza
I contenitori dei campioni devono essere collocati su supporto idoneo.
Fare riferimento alle vigenti linee guida sulla sicurezza per la manipolazione di tutti i microrganismi
riportati in questa SMI.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio
2 Procedura sul Campione
2.1 Tipo di Campione
Aspirato bronchiale, lavaggio bronco alveolare, aspirato trans toracico, aspirato trans tracheale,
spazzolamento bronchiale, campione da catetere protetto, lavaggio bronchiale, campione da tubo
endotracheale, sputo – espettorato, tamponi da colpi di tosse/piastre
2.2 Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo81
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1.
Tutti i campioni devono essere prelevati prima dell’inizio del trattamento antimicrobico, quando
possibile81.
Se non altrimenti definito, i tamponi per l’esame colturale batterico e fungino devono essere inseriti
nel terreno di trasporto82,86.
Prelevare i campioni diversi dai tamponi in contenitori impermeabili con marchiatura CE e inserirli
in sacchetti di plastica sigillati.
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Si raccomanda espettorato di primo mattino per le specie Mycobacterium e dovrebbe essere
raccolto per almeno tre giorni consecutivi87,88. (B 40 - Investigation of Specimens for
Mycobacterium species).
La coltura per le specie Legionella può essere ancora positiva dopo l’inizio della terapia
antimicrobico(ID 19 - Identification of Legionella species
L’escreato può essere refrigerato per 2-3 ore senza una perdita apprezzabile di patogeni.
Qualsiasi ritardo oltre questo limite può consentire la sovracrescita di bacilli Gram negativi, e le
specie Haemophilus e S. pneumoniae possono essere rese non vitali89,90.
Qualora il trasporto sia difficoltoso, i campioni possono essere seminati fino a 48 ore dopo il
prelievo. Se i campioni non sono processati lo stesso giorno della loro prelievo, l’interpretazione
dei risultati deve essere eseguita con attenzione.
Per i campioni di escreato si richiede che il materiale sia di provenienza dalle vie respiratorie
inferiori ottenuto con colpi di tosse profondi. Quando la tosse è secca, possono essere utili la
fisioterapia, il drenaggio posturale o l’inalazione di un aerosol prima dell’espettorazione. Saliva e
secrezioni pernasali non sono idonee.
Il BAL e i campioni associati richiedono per il prelievo l’intervento di uno specialista, secondo i
protocolli locali.
2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni81
Espettorato – in teoria, almeno un volume di 1 mL.
BAL – E’ difficile specificare il volume richiesto; in linea generale si preferisce il volume massimo
ottenibile.
Numero e frequenza della raccolta del campione dipendono dalle condizioni cliniche del paziente.
3
Trasporto e Conservazione del Campione1,2
3.1
Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile81.
Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura
ambiente81.
4
Procedura sul Campione1,2
4.1
Selezione della Prova
Selezionare una parte rappresentativa del campione per appropriate procedure, quail la coltura di
specie Legionella, Mycobacterium (B 40 - Investigation of Specimens for Mycobacterium species)
e ricerca di parassiti (B 31 - Investigation of Specimens other than Blood for Parasites), in funzione
delle specifiche cliniche.
Commenti addizionale per Espettorato
L’espettorato indotto può essere inviato per la ricerca di P. jiroveci - (B 31- Investigation of
pecimens other than blood for parasites).
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Commenti addizionali per il BAL
Le colture per le specie di Mycobacterium dovrebbero essere eseguite su tutti i campioni BAL,
tranne particolari indicazioni locali non richiedano questa procedura.
Sui campioni di BAL non sono necessarie di routine le colture anaerobiche perché i batteri
anaerobi sono rari nella polmonite da ventilazione e da aspirazione91.
4.2 Aspetto
Espettorato
I campioni non dovrebbero essere rifiutati anche solo per le caratteristiche macroscopicche.
Possono essere descritti utilizzando la seguente terminologia: salivare, mucoso,
mucomucopurulento, purulento o colorazione ematica.
BAL
N/D
4.3 Preparazione del Campione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.2
4.4 Microscopia
4.4.1 Standard
BAL
Campioni mucosi
Utilizzare un’ansa sterile e selezionare il materiale più purulento o parti di campione a maggior
colorazione ematica e preparare uno striscio sottile su vetrino da microscopio pulito per la
colorazione Gram.
Campioni non mucosi
Utilizzare una pipetta sterile e deporre una goccia di materiale centrifugato (consultare la sezione
4.5.1) su un vetrino da microscopio pulito.
Diffondere questo materiale con un’ansa sterile per ottenere uno striscio sottile per la colorazione
di Gram.
4 .4.2 Prove Supplementari
Espettorato
Colorazione Gram
(TP 39 - Staining Procedures)
La colorazione Gram può essere utilizzata per commentare la qualità del campione. Può essere
usata per rifiutare il campione di escreato e per refertare i GB ed i microrganismi.
Utilizzando un’ansa sterile raccogliere il materiale omogeneizzato (consultare sezione 4.5.1) e
preparare uno striscio sottile su un vetrino da microscopio pulito per la colorazione Gram.
I campioni salivari possono essere rifiutati prima della omogeneizzazione o sulla base di un
rapporto <2:1 GB:SEC determinato con la colorazione Gram a basso ingrandimento (x100)92.
Se un campione è rifiutato sulla base dell’esame microscopico, informare immediatamente il
reparto, il clinico o il Medico curante..
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Conservare i campioni a 4°C per non più di 48 ore.
Nota: I campioni da pazienti immunocompromessi, neutropenici o intubati o per le colture di
Legionella e specie Mycobacterium non possono essere rifiutati sulla base della qualità del
campione.
Microscopia per specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium
species), e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for parasites).
Preparazione KOH o Calcofluor per funghi.
BAL
Ricerca di P. jiroveci con prova di immunofluorescenza indiretta.
4.5 Coltura e ricerca
4.5.1 Pre-trattamento e Procedura
Espettorato
Aggiungere all’espettorato un uguale volume di soluzione 0.1% di ditiotreitolo o N-acetil L-cisteina
(NALC)
Agitare gentilmente per circa 10 secondi
Incubare a 35-37°C per 15 minuti con successiva lieve agitazione per circa 15 secondi per
facilitare l’omogeneizzazione
Diluire 10 μL di espettorato omogeneizzato in 5 mL di acqua distillata sterile
Seminare nella piastra di coltura questa diluizione con ansa da 1μL (consultare 4.5.2)
Per pazienti con FC o immunocompromessi inoculare 1μL della diluizione di sputasol/escreato
sull’altra metà delle piastre
Per pazienti con fibrosi cistica che non hanno presentato una colonizzazione precedente da B.
cepacia, inoculare 100μL nel B. cepacia medium e diffondere l’inoculo sull’intera superficie della
piastra di agar18.
BAL
Centrifugare il BAL a 1200 x g per 10 minuti
Allontanare tutto il sopranatante tranne 0.5 mL e risospendere il deposito del centrifugato nel
liquido residuo.
Seminare con ansa sterile il campione in ciascuna piastra (consultare Q 5 – inoculation of culture
media).
Metodo semi – quantitativo
Tutto il materiale è risospeso nel liquido e si preparano poi tre diluizioni seriali (1/10, 1/1000 e
1/100.000. Di ciascuna di loro seminare 0,1 mL.
In alternativa, usare un’ansa calibrata per la semina di 0.01 mL di sospensione. Se sono presenti
meno di 10 colonie sulla piastra, queste equivalgono a <103 ufc/mL, fra 10-100 colonie; 103-104
ufc/mL, e 100–1000 colonie; 104-105 ufc/mL. Le soglie diagnostiche sono di 105-106 ufc/mL per
aspirati broncoscopici, 103 ufc/mL per campioni da raschiamento bronchiale protetto e 104 ufc/mL
per i BAL.93.
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Nota: Non frapporre ritardi fra la diluizione del campione e la semina delle piastre.
Numero di colonie
Unità formanti colonia/mL
<10 colonie su piastra
<103 colonie
10 –100 colonie
103-104 colonie
>100 colonie
104<105
La soglia di diagnosi può non essere di aiuto se l’infezione è appena iniziata o è presente una
bronchiolite. Campioni da pazienti trattati con antibiotici possono essere falsamente negativi94.
Le provette devono essere chiuse in modo appropriato e poste su vortex al di fuori della cabina
microbiologica in quanto il movimento prodotto dall’agitatore infrange lo spazio aereo di protezione.
Le provette devono essere aperte e chiuse in una cabina di sicurezza.
Prove supplementari
Funghi, specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species), e
parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for parasites).
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4.5.3 Terreni di coltura, condizione e microrganismi per campioni di
espettorato
Incubazione
Aspetti Clinici/
Condizioni
Terreni standard
Agar cioccolato*
Bronchite
+ Disco di
bacitracina o
incorporata nel
terreno
Temp C°
Atmosfera
Tempo
35 - 37
5 – 10%
CO2
40 – 48 ore
Lettura
colture
Microrganismo(i)
ricercati
giornaliera
H. influenzae
M. catarrhalis
S. aureus
S. pneumoniae
Possono essere
significativi altri
microrganismi da
crescite pure
Infezione torace
Malattia ostruttiva
cronica delle vie
aeree
Polmonite
comunitaria
Polmonite
ospedaliera
Agar Sabouraud
30 e
35 – 37
aria
40 – 48 ore‡
40 ore
Funghi
35 - 37
aria
40 – 48 ore
giornaliera
Enterobacteriaceae
(Devono essere
utilizzate provette
standard di piccole
dimensioni con
tappo a vite se si
sospettano fungi
dimorfi)
Agar CLED o
MacConkey agar
Pseudomonadi
Per queste condizioni, aggiungere i seguenti terreni:6
Aspetti clinici/
condizioni
Bronchiettasie
Fibrosi cistica
Fibrosi cistica
Terreni
Supplementari
Agar sale mannite
Agar selettivo per
B. cepacia
Incubazione
Lettura
colture
Microrganismo(i)
ricercati
Temp C°
Atmosfera
Tempo
35 - 37
aria
40 – 48 ore
giornaliere
S. aureus
35 - 37
aria
40 – 48 ore
=/>40 ore
B. cepacia
5 giorni
A 5 giorni
Incubare successivamente:
30
aria
Altri microrganismi da considerare – Legionella e specie Mycobacterium (B40 - Investigation of specimens for Mycobacterium
species),e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for parasites)
*Se si usa agar cioccolato con bacitracina incorporata invece di agar sangue incubato in 5 – 10% CO2 devono essere inclusi
nell’isolamento M. catarrhalis e S. pneumoniae60
‡ Le colture fungine possono richiedere incubazione prolungata (fino a 6 settimane per P. brasiliensis) se sussiste
l’indicazione clinica; in questi casi le piccole provette dotate di tappo a vite dovrebbero essere lette a 40 ore e poi lasciate
nell’incubatore/termostato per il tempo richiesto.
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2.5.3 Terreni di coltura, condizione e microrganismi per campioni di
espettorato
Aspetti clinici/
condizioni
Terreni standard
Bronchite
Infezione torace
Malattia ostruttiva
cronica delle vie
aeree
Incubazione
Temp C°
Atmosfera
Tempo
35 -37
5 – 10%
CO2
40 – 48 ore
Agar cioccolato*
Lettura
colture
Microrganismo(i)
ricercati
giornaliera
H. influenzae
M. catarrhalis
S. aureus
+ Disco di
bacitracina o
incorporata nel
terreno
S. pneumoniae
Possono essere
significativi altri
microrganismi da
crescite pure
Polmonite
Per queste condizioni, aggiungere i seguenti terreni:
Aspetti clinici/
condizioni
Bronchiettasie
Terreni
Supplementari
Incubazione
Temp C°
Atmosfera
Tempo
35 -37
aria
40 – 48 ore
Lettura
colture
Microrganismo(i)
ricercati
giornaliera
Enterobacteriaceae
Fibrosi cistica
CLED agar o
MacConkey agar
Immuno
compromessi/
Agar sale mannite 35 -37
aria
40 – 48 ore
Sabouraud agar
35 -37
aria
40 – 48 ore † ≥40 ore
Funghi
Agar selettivo
B. cepacia
35 -37
aria
40 – 48 ore
B. cepacia complex
ITU
Fibrosi cistica
giornaliera
≥40 ore
S. aureus
Incubare successivamente:
Agar Sabouraud
Ricerche
micologiche
Pseudomonadi
30
aria
5 giorni
a 5 giorni
35 -37
aria
40 – 48 ore †
≥ 40 ore
Funghi
(Devono essere
utilizzate provette
di piccole
dimensioni con
tappo a vite)
Altri microrganismi da considerare – Legionella (B 47 - Investigation of specimens for Legionella
species) e specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species),
e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for parasites)
* Se si usa agar cioccolato con bacitracina incorporata invece di agar sangue incubato in 5 – 10% CO2 devono essere
incluse nell’isolamento M. catarrhalis e S. pneumoniae60
† Le colture fungine possono richiedere incubazione prolungata (fino a 6 settimane per P. brasiliensis) se sussiste
l’indicazione clinica; in questi casi le piccole provette dotate di tappo a vite dovrebbero essere lette a ≥40 ore e poi lasciate
nell’incubatore/termostato per il tempo richiesto.
4.6 Identificazione
Per l’identificazione fare riferimento alle singole SMI
B. cepacia complex
Livello specie (cosultare ID 17 – Identification of Glucose
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Non-Fermenting Gram Negative Rods
S. maltophilia
Livello specie
Enterobatteriaceae
Livello specie
Klebsiella pneumoniae
Livello specie
Fungi
Livello genere
H. influenzae
Livello speciel
M. catarrhalis
Livello specie
N. meningitidis
Livello specie
Pasteurella
Livello specie
Pseudomonads
Livello "pseudomonadi"
P. aeruginosa
mucoidi o non-mucoidi livello specie
S. aureus
Livello specie
S. pneumoniae
Livello specie
Lieviti
Livello “lieviti “yeasts" l
Legionella
Livello specie
Mycobacterium
Consultare B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species
Parassiti
Consultare B 31 - Investigation of specimens other than blood
for parasites
4.7 Prova di sensibilità agli antimicrobici
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o
.EUCAST
4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico
N/D
4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste
del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di
laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati
laboratori di riferimento.
Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili,
tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del campione:
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Inghilterra e Galles
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=11
58313434370
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
5
Procedura di Refertazione
5.1 Microscopia
Se il paziente è immuno-competente, refertare i campioni di scarsa qualità o di tipo salivare come:
“Scarsa qualità, ricevuto campione/salivare. Per cortesia, se indicato clinicamente ripetere”.
Colorazione di Gram (se eseguita).
Segnalare il numero di cellule epiteliali, Globuli Bianchi e microrganismi riscontrati.
Segnalare funghi e ife osservate.
P. jiroveci immunofluorescenza
Oocisti di P. jiroveci riscontrate con immunofluorescenza o
Oocisti di P. jiroveci NON riscontrate con immunofluorescenza.
Microscopia per Legionella (B 47 - Investigation of specimens for Legionella species) e specie
Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species), e parassiti (B 31Investigation of specimens other than blood for parasites).
5.1.1 Tempo per referto microscopico
I risultati microscopici urgenti devono essere comunicati per telefono od inviati per via elettronica.
Referto scritto, 16 – 72 ore.
5.2 Coltura
Refertare i microrganismi isolati clinicamente significativi e la loro concentrazione se si sono
utilizzati il BAL e un metodo semi-quantitativo o
Refertare altri tipi di crescita, come: Flora mista delle vie aeree superiori o
Refertare assenza di crescita o
Refertare assenza di crescita di microrganismo specifico alla diluizione 10-6 del campione (per
pazienti con FC
Refertare i risultati delle Indagini supplementari.
5.2.1 Tempo di refertazione della coltura
Risultati colturali urgenti possono essere trasmessi per via telefonica o elettronica.
Referto scritto, 16 –72 ore, segnalando, se appropriato, che sarà inviato un referto successivo.
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Indagini supplementari, specie Mycobacterium (BS40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species), e parassiti (B 31- Investigation of specimens other than blood for
parasites).
5.3 Prova di Sensibilità agli antibiotici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudenti gli antimicrobici
secondo i protocolli locali e nazionali raccomandati.
6 Notifica al PHE95,96 o Equivalente97-100
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare
all’Health Protection Agency (HPA) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva’, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della HPA.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria all’’HPA. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente all’HPA gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni dell’HPA hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
(Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per HIV & STIs, HCAIs e CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical
Practitioners’, e non nel ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.
http://www.hpa.org.uk/Topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/HealthProtectionRegulations/
In Scozia97,98 e Galles99 e nell’Irlanda del Nord100 sono vigenti altre disposizioni.
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