Aneuploidie Molecolari - 13-18-21-XY

QF-PCR su cellule di liquido amniotico
La diagnosi prenatale delle anomalie cromosomiche può essere eseguita su diversi tessuti fetali,
in epoche diverse di gestazione e con metodiche di vario tipo.
Alcune tecniche di biologia molecolare cominciano ad affiancarsi a quelle citogenetiche
tradizionali come ausilio diagnostico rapido e mirato ad alcune aneuploidie.
La QF-PCR è un esame che, come la tecnica di citogenetica molecolare conosciuta come FISH
(Fluorescent In Situ Hybridization) sui nuclei in interfase, permette l’esclusione rapida nel feto delle
aneuploidie cromosomiche più frequenti (aneuploidie dei cromosomi 21, 13, 18, X e Y). E’ stata
proposta di recente come ulteriore tecnica in grado di rivelare la presenza di aneuploidie
cromosomiche in tempi estremamente rapidi (entro 24-48h dal prelievo) partendo da DNA estratto
da materiale cellulare non coltivato. Questa tecnica di biologia molecolare risulta essere, rispetto
alla FISH, più affidabile, meno costosa, automatizzabile e di più facile standardizzazione.
La metodica è basata sull’amplificazione quantitativa fluorescente (QF-PCR) di sequenze di DNA
ripetute altamente polimorfiche (STR) localizzate sui cromosomi oggetto di studio e successiva
elettroforesi capillare.
I marcatori genetici investigati sono i seguenti
D13S634, D13S325, D13S305, D13S628, D13S252, D18S535, D18S978, D18S386, D18S391,
D18S390, D18S819, D21S1435, D21S11, D21S1437, D21S1411, D21S1409, DXS981, DXS6807,
DXS1187, XHPRT, DXS7423, AMEL, SRY ,DXS1283E, DXY5267, DYS448.
L’elettroforesi capillare viene eseguita mediante sequenziatore automatico a tecnologia
fluorescente; per ciascun prodotto di PCR vengono calcolate le dimensioni, l’altezza e l’area di
ciascun picco fluorescente.
In caso di feto di sesso femminile il locus non polimorfico Amelogenina (AMEL) è rappresentato
da un solo picco, relativo al cromosoma X, in caso di feto di sesso maschile sono presenti due
picchi (uno relativo al cromosoma X e l’altro all’Y). Sia il locus SRY, che altri marcatori
polimorfici Y-specifici ed X-specifici sono stati inclusi per una più accurata determinazione del
sesso fetale. Il marcatore X-linked HPRT è stato incluso al fine di determinare in tutti i campioni
l’esatto numero di copie del cromosoma X.
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La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali mediante
QF-PCR e corsa elettroforetica fluorescente dei prodotti di amplificazione permette di poter
evidenziare nel feto la presenta di eventuali trisomie. I risultati ottenibili sono i seguenti:
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i soggetti normali eterozigoti presenteranno per ogni locus autosomico analizzato due picchi
fluorescenti equivalenti che presentano cioè un’area ed un’altezza di picco sovrapponibile
(rapporto tra i picchi 1:1);
i soggetti con trisomia presenteranno invece tre picchi fluorescenti equivalenti che
presentano un’area ed un’altezza di picco sovrapponibile (rapporto tra i picchi 1:1:1);
oppure due picchi fluorescenti di area ed altezza differente corrispondenti rispettivamente al
prodotto di amplificazione di due alleli uguali ed uno diverso (rapporto tra i picchi 2:1;
picchi sbilanciati i valori di uno dei quali circa il doppio dell’altro);
presenza di un solo picco fluorescente per uno o più loci polimorfici testati (marcatore/i non
informativo/i). L’impiego di più marcatori con un alto indice di eterozigosità per ciascun
cromosoma rende molto bassa la probabilità di avere marcatori non informativi (unico
picco) tra i loci investigati.
Diversi studi (Donaughue et al.,2005;Brown et al.,2006; Cirigliano et al.,2004) hanno comparato
la QF-PCR con l’analisi citogenetica convenzionale dimostrando che questa tecnica è in grado di
evidenziare il 100% delle trisomie autosomiche osservate all’analisi del cariotipo fetale, con 0% di
falsi positivi. Le aneuploidie che interessano i cromosomi del sesso sono state per la quasi totalità
svelate (0,3% di falsi negativi). Questa tecnica inoltre è in grado di evidenziare buona parte dei casi
di mosaicismo cromosomico, e la quasi totalità di quelli dove la linea cellulare anormale dà un
contributo superiore al 15%. Questa tecnica inoltre è in grado di svelare la eventuale
contaminazione del campione di liquido amniotico con cellule materne.
Materiale richiesto: per effettuare l’esame è necessario prelevare non meno di 3ml di liquido
amniotico in Falcon sterile da 15ml. E’ necessario quindi che vengano prelevati almeno 22ml di
liquido amniotico quando la QF-PCR è richiesta unitamente all’esame del cariotipo fetale.
Risposta telefonica e referto: la risposta preliminare sarà comunicata per via telefonica entro circa
24-48 h dal prelievo e fornisce informazioni sul sesso e sulla eventuale presenza di aneuploidie dei
cromosomi del sesso e dei cromosomi 21,13,18. Tale esame ha valore solo indicativo in quanto
l’interpretazione clinica del risultato del test deve essere sempre eseguita unitamente all’analisi
citogenetica standard: questo esame infatti non esclude in modo definitivo altre possibili anomalie
cromosomiche per le quali è necessario effettuare l’analisi del cariotipo con le tecniche tradizionali
e/o molecolari. Il referto di QF-PCR verrà allegato a quello dell’analisi citogenetica standard.
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