La rabbia: epidemiologia e diagnosi di
laboratorio
Franco Mutinelli
Centro di referenza nazionale per la rabbia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
E-mail: [email protected]
Riccione, 23 maggio 2014
Cos’è la rabbia
La rabbia è una zoonosi, causata da un virus appartenente
alla famiglia Rhabdoviridae, genere Lyssavirus.
Colpisce animali selvatici e domestici e si può trasmettere
all’uomo e ad altri animali attraverso il infetti.
La malattia sviluppa una encefalite ed una volta che i
sintomi della malattia si manifestano, la rabbia ha ormai
già un decorso fatale sia per gli animali sia per l’uomo.
Il cane, per il ciclo urbano, e la volpe, per il ciclo silvestre,
sono attualmente gli animali maggiormente interessati
sotto il profilo epidemiologico.
Tassonomia del virus della rabbia
Virus species
Potential vector/reservoir
Distribution
Rabies virus (type
species)
Carnivores (worldwide); bats
(Americas)
Lagos bat virus
Mokola virus ?
Frugivorous bats
(Megachiroptera)
(isolated from Shrews)
Duvenhage virus
Insectivorous bats
European bat
lyssavirus 1
European bat
lyssavirus 2
Australian bat
lyssavirus
Aravan virus
Insectivorous bats
(Eptesicus serotinus)
Insectivorous bats (Myotis daubentonii, M.
dasycneme)
Frugivorous/insectivorous bats
(Megachiroptera/Microchiroptera)
Insectivorous bats
(Myotis blythi)
Insectivorous bats
(Myotis mystacinus)
Insectivorous bats
(Murina leucogaster)
Insectivorous bats
(Miniopterus schreibersi)
Hipposideros commersoni
Insectivorous bats
(Myotis nattereri)
(isolated from Civettictis
civetta)
Worldwide
(except
several
islands)
Sub-Saharan
Africa
Sub-Saharan
Africa
Sub-Saharan
Africa
Europe
Khujand virus
Irkut virus
West Caucasian bat
virus
Shimoni bat virus
Bokeloh bat lyssavirus*
Ikoma lyssavirus* ?
*not yet approved by ICTV
Europe
Australia
Central Asia
Central Asia
East Siberia
Caucasian
region
East Africa
Europe
Africa
Tassonomia
• Ordine: Mononegavirales
• Famiglia: Rhabdoviridae
• Genere: Lyssavirus
•
•
•
•
•
•
•
•
Genoma RNA a singola elica,
simmetria elicoidale con 30-35 spire,
non segmentato, 12 kb,
polarità negativa,
5 proteine (N, P, L, G, M)
P
dimensioni 75 X 180 nm
RNA associato ad una nucleoproteina N, resistente alla putrefazione
Presenza di envelope lipoproteico
Phylogenetic tree of Rhabdoviridae based on the alignment of
partial nucleoprotein (N) gene sequences (1027 nucleotides)
Unrooted phylogenetic trees based on the entire lyssavirus N gene nucleotide
sequences (a) and glycoprotein ectodomain amino acid sequences (b) (Kuzmin
et al., 2005).
Gruppo
filogenetico I
Gruppo
filogenetico II
Gruppo
filogenetico III
Cross-reattività antigenica del
nucleocapside
Elevata conservazione della proteina N
Identità aminoacidica dal 78% (MOKV e EBLV-2) al 93% (DUVV e EBLV-1)
Possibilità di utilizzare gli stessi reagenti per la diagnosi con FAT
Cross-reattività antigenica dell’ectodominio
della proteina G
Maggiore variabilità
Cross-reattività solo fra lyssavirus dello stesso gruppo filogenetico
(identità AA >74%)
Diverso gruppo filogenetico (identità AA <62%)
Ceppi vaccinali (tutti genotipo 1, gruppo filogenetico I) non protettivi
verso lyssavirus del gruppo filogenetico II
Rischio di trasmissione della rabbia
Situazione della rabbia
Rabbia silvestre e rabbia urbana
• Reservoir = animale selvatico
• In Europa è la volpe
Reservoir = cane
Europa 1977 - 2013
1977:
1984:
1989:
1994:
1999:
2001:
2002:
2003:
2004:
2005:
2006:
2007:
2008:
2009:
2010:
2011:
2012:
2013:
16821 casi
23625
24377
8820
6591
10435
10051
11085
5452
9830
9172
13293
9707
6708
7471
5803
5947
2820 (2 trimestre 2013)
www.who-rabies-bulletin.org
Diffusione dell’infezione rabida: 1938-1988
1989
2° trimestre 2013 (1143 casi)
1143
casi: selvatici
428; domestici
(694 domestici,
1038 =
selvatici,
0 pipistrelli,=2 705;
uomo)pipistrelli = 7; uomo = 3
Rabbia dei pipistrelli insettivori in Europa
Casi di rabbia di importazione (cane) in Europa
Year
Country of diagnosis
Country of origin
1979
1984
1984
The Netherlands
Portugal
Italy
India
Mozambique
Yugoslavia
1988
1989
1991
1992
1995
1997
1999
2001
2002
2004
2007
2007
2008
2008
2008
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Switzerland
Italy
France
Italy
France
Switzerland
Austria
France
Germany
France
Belgium
Finland
France
UK (under quarantine)
Belgium, France
Germany
==
==
France
The Netherlands
Spain
Zaire
Ivory Coast
Mexico
Hungary
Burkina Faso
Morocco
Turkey
Morocco
Azerbaijan
Morocco
Morocco
India
Morocco
Sri Lanka
Gambia
Croatia
==
==
Morocco
Morocco
Morocco
Rabbia in Italia
Bellani et al., 1976
Rabbia silvestre in Italia
Ultimo caso: dicembre 1995
Indenne da rabbia dal 1997
Nuovi casi di rabbia nella volpe-ottobre 2008
17 ottobre 2008
Comune: Resia (UD)
Località: Oseacco
1 volpe rabida (abbattuta)
27 ottobre 2008
Comune: Venzone (UD)
1 volpe rabida (trovata morta)
Slovenia: casi di rabbia nel 2008 = 55
(51 volpi, 2 tassi, 1 cane, 1 cavallo)
Slovenia: casi di rabbia nel 2009 = 34 (33 volpi, 1 bovino)
WE
Albero filogenetico del gene
della nucleoproteina del
virus della rabbia isolato da
volpe in Italia, ottobre 2008
CE
EE
NEE
VAC
(De Benedictis et al., 2008)
Sintesi dei casi di rabbia: 2008-2011
Nel 2011: una volpe trovata morta il 14 febbraio
Raccolta e invio dei campioni al laboratorio
Anamnesi
Storia
Comportamento
Aggressività
Contatto-morsicatura
Altre informazioni disponibili
Da dove si comincia ……….
Aspetti clinici
•
Sintomatologia nervosa
Fase prodromica:
•
•
dopo un periodo di incubazione segue la comparsa dei sintomi,
1-3 giorni: minimi cambiamenti comportamentali, aggressività in alcuni casi,
attività durante il giorno in animali crepuscolari, perdita di paura nei confronti
dell’uomo o disturbi dell’appetito
Fase eccitativa (furiosa):
•
•
fase di forte agitazione e aggressività.
Morsicatura di oggetti, modifica nel suono emesso abbaiando, morte dopo
convulsioni, anche senza la fase paralitica.
Fase paralitica: incapacità di deglutire con formazione di schiuma attorno alla
bocca. Paralisi del posteriore. Paralisi seguita da morte.
Strumenti
Apertura della scatola cranica
Apertura della scatola cranica
Campioni da prelevare
Corteccia cerebrale, corno d’Ammone, cervelletto, midollo allungato
ghiandole salivari
Campionamento da cervello mediante
pipetta
Foro occipitale (Foramen magnum)
Forame ottico
Distribution of rabies antigen in infected brain
material: determining the reliability of different
regions of the brain for the rabies fluorescent
antibody test
(Bingham & van der Merwe, 2002; Journal of Virological Methods 101, 85-94)
The antigen quantity scores for all specimens by different regions of the
brain, recorded as percentage of total samples tested
Conservazione dei campioni
Catena del freddo (4°C, -20°C)
Rapida consegna al laboratorio
50% glicerina e PBS: campione di cervello prelevato e conservato senza
refrigerazione è ancora analizzabile per l’RNA virale dopo 60 gg. (Aguyilar-Setién et
al., 2003)
Diagnosi di laboratorio
Metodiche ufficiali
Nucleoproteina
Immunofluorescenza diretta
Isolamento del virus su coltura cellulare di neuroblastoma di topo
Isolamento del virus da topo
Virus
Diagnosi di laboratorio
Metodiche ufficiali
Immunofluorescenza diretta (FAT)
Nucleoproteina
Rapid tissue culture inoculation test (RTCIT)
Caratteristiche del metodo:
• Cellule di neuroblastoma murino
• Risultati dopo 24-72 ore
• Sensibilità dipende dal ceppo in esame
• 0.5*10^2.5 TCID/ml calcolata su virus adattato a cellule
Limiti:
1. Anticorpo coniugato con FITC
2. Conservazione della carcassa e dei campioni
Positive 200x magnification
RTCIT mouse neuroblastoma cells
Negative 200x magnification
IZSVe
Rapid tissue culture inoculation test (RTCIT)
RTCIT vs Mice inoculation test
Etici
Tempi d risposta
Sensibilità
Istologia: corpi del Negri
L’OMS ne sconsiglia l’utilizzo
Immunoistochimica
direct Rapid Immunohistochemistry test – dRIT
A. Positive 200x magnification
IZSVe
B. Positive 200x magnification
A. direct rapid immunohistochemistry test (DRIT).
B. fluorescent antibody test (FAT).
IZSVe
Microscopia elettronica
Diagnosi di laboratorio
Altre metodiche
RNA virale
real time RT-PCR
one-step RT-PCR con primer specifici
sequenziamento
Sequencing of the gene coding for the
nucleoprotein, glicoprotein and G-L intergenic
portion
Virus typing
WE
Utile per:
• circolazione transfrontaliera degli
animali selvatici
CE
• importazione illegale
NE
• spill-over di lyssavirus dal reservoir
selvatico 2003, 2007)
NEE
VAC
Biomolecular methods for rabies diagnosis
Opinion of the international organizations
OIE Manual of Diagnostic Tests (2008):
“…The identification of the agent can be supplemented in specialised laboratories by
identifying any variant virus strains through the use of monoclonal antibodies, specific
nucleic acid probes, or the polymerase chain reaction followed by DNA sequencing of
genomic areas. Such techniques can distinguish between field and vaccine strains, and
possibly identify the geographical origin of the field strains…”
WHO Expert Consultation on rabies (2005): “ …The use of PCR and other amplification
techniques is not currently recommended for routine post-mortem diagnosis of rabies.
However, these molecular techniques can be applied for epidemiological surveys in
laboratory with strict quality control procedures in place and that have experience and
expertise with these techniques…”
5):
Tecniche di biologia molecolare
Utili per:
-
Tipizzazione virale
-
Effetti collaterali della vaccinazione orale delle volpi (ORV)
-
Test di conferma (in caso di FAT negativa) in campioni sospetti, animali
domestici, animali morsicatori, esposizione a rischio
-
Diagnosi intra-vitam
Diagnosi nell’uomo
• Post mortem
• Intra vitam:
• RT-PCR su sangue, saliva, liquor, biopsia nucale
Clinical Infectious Diseases 2008; 47: 14101417
Titolazione degli anticorpi (FAVN test)
Verifica della risposta immunitaria dopo la vaccinazione
Laboratorio riconosciuto dall’UE
Il test non ha valenza diagnostica
Laboratorio e campagna di
vaccinazione orale delle volpi
Monitoraggio
FAVN test su coagulo di volpi raccolte 30 gg. dopo la fine della
distribuzione delle esche (8 volpi/100 km2)
Ricerca della tetraciclina nell’osso (mandibola) come marker di assunzione
dell’esca
Informazione
•
RABIES BULLETTIN EUROPE, 1977-…. : www.who-rabies-bulletin.org
•
WHO Expert Consultation on Rabies, Second Report, 2013
WHO Technical Report Series 982
•
EFSA SCIENTIFIC REPORT Development of harmonised schemes for
monitoring and reporting of rabies in animals in the European Union:
www.ec.efsa.eu
•
•
RABNET, 1998: www.who.ch
WHO, Division for Emerging and other Communicable Diseases Surveillance
and Control, Zoonotic Disease Unit
•
Center for Disease Control and Prevention: www.cdc.gov
•
The World Rabies Day web site: www.worldrabiesday.org
www.izsvenezie.it
