Ricerca di antigeni virali

Diagnosi di laboratorio
delle infezioni virali
CL Medicina e Chirurgia
CI MEDICINA DI LABORATORIO
Anno Accademico 2012-2013
G. Di Bonaventura, PhD
Università “G. D’Annunzio”, Chieti-Pescara
[email protected]
Tel 0871 3554812
Diagnosi di laboratorio delle
infezioni virali
Presuppone un’adeguata diagnosi clinica:
corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere
lo spettro delle indagini da eseguire
Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette
corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico
Diagnosi di laboratorio indispensabile quando:
sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico
il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati
(forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie)
sia necessario seguire “particolari” categorie di pazienti (ad esempio,
immunodepressi)
si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati
si ricerchi l’agente eziologico di nuove o gravi patologie
si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata
popolazione
Diagnosi di laboratorio delle infezioni virali
La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può
essere eseguita seguendo due approcci differenti:
approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo
virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus
direttamente nel campione clinico:
Isolamento virale (coltivazione)
ricerca di particelle virali (microscopia)
ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica, IF)
ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare)
approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo
sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei
pazienti la presenza di anticorpi contro specifici antigeni virali:
ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici
Isolamento e crescita virale
Coltivazione dei virus
E’ il GOLD STANDARD delle metodiche di diagnosi virologica.
I virus sono patogeni “intracellulari obbligati”,
quindi:
richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati
(cioè: sensibili e permissivi)
Fagi (batteriofagi o virus batterici)
Batteri
Virus animali
Animale
Uova embrionate
Coltura cellulare animale
Virus vegetali
Pianta
Coltura cellulare vegetale
Isolamento virale: pro e contro
Permette di isolare, tipizzare e conservare il virus
Consente di isolare anche virus non sospettabili o non conosciuti al
momento dell’isolamento
Importante per HIV (diagnosi precoce in bambini nati da madri sieropositive)
e CMV (diagnosi in bambini da madri con infezione in atto od
immunodeficienti)
Altamente sensibile e specifica, se associata ad ID sierologica
TUTTAVIA:
Richiede lunghi tempi di esecuzione, strumentazione dedicata, “know-how”
Si basa sulla presenza del virus vitale nel campione (la refrigerazione
inattiva i virus enveloped ed i virus “labili” come BRSV)
Non è applicabile a tutti i virus (HPV, EBV, HBV, HCV, rotavirus)
Poco sensibile (in caso di infezioni paucivirali) e specifico, se non associata
ad altri tests (sierologici)
Coltivazione di batteriofagi
Batteri seminati su agar
colture, in brodo o agar, di batteri in fase esponenziale
Aggiunta di batteriofagi
l’infezione (litica) si manifesterà attraverso la:
formazione di “placche” (zone chiare sulla piastra), in colture su agar
riduzione della torbidità, in colture in brodo
Coltivazione di virus animali
Colture cellulari
Monostrati di cellule animali
Tecnica maggiormente usata per la coltivazione virale
formazione di placche (aree localizzate di lisi/distruzione cellulare)
comparsa di caratteristici “effetti citopatici” (CPE)
Animale
Topo, coniglio, maiale
Embrione di pollo (uova embrionate)
Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)
Coltivazione di virus animali
Colture cellulari
Colture cellulari “primarie”
digestione enzimatica (tripsina, collagenasi) di organi/tessuti
crescono in monostrato (cellule epiteliali) o in sospensione
(linfociti)
vita limitata (colture “a termine”)
esempi: cellule di rene di scimmia (paramyxovirus, enterovirus,
adenovirus)
Linee cellulari diploidi o semicontinue
colture di singolo tipo cellulare
derivano dall’embrione umano
stabili (non si differenziano) fino a 100 generazioni
esempi: fibroblasti fetali umani (HSV, VZV, CMV, adenovirus)
Linee cellulari “continue” (a vita illimitata)
cellule “trasformate” (cellule tumorali aneuploidi)
possono essere mantenute indefinitamente
esempi: cellule HeLa
○
Henrietta Lax, 1951 (cancro cervice uterina)
Tecnica di isolamento virale
Effetto citopatico
(CPE o placca)
Esposizione del monostrato cellulare
al campione (agente virale)
Rilevazione di antigeni virali
(virus a crescita lenta, virus CPE-negativi)
CPE in vitro ed in vivo: sincizio
Sincizi: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, indotta
dal virus, di singole cellule
Prodotti da: Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV
Sincizio prodotto in vitro dal
virus del morbillo su carcinoma
gastrico umano (A549).
Sincizio prodotto in vivo dal virus del morbillo.
Cellula gigante multinucleata in sezione
istologica di campione bioptico di polmone
prelevato da paziente immunocompromesso
con polmonite.
CPE: corpi di inclusione
Corpi di inclusione: cambiamenti
istopatologici delle cellule infettate
causati direttamente all’azione di
componenti virali o modificazioni
delle strutture cellulari a seguito
della infezione:
Corpi del Negri (rhabdovirus)
Inclusioni di Cowdry di tipo A
(herpesvirus, varicella-zoster)
Inclusioni ad “occhio di gufo”
(CMV)
CMV: inclusioni ad “occhio di gufo”
Colture cellulari
Effetto citopatico: formazione di placca litica
Colture cellulari
CPE in vitro (placca): vaiolo su rene di scimmia (BSC40)
Bassa molteplicità di infezione
(Molteplicity of Infection, MOI)
Placca singola, 48 h
Elevata MOI, 48 h
Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
La ricerca e l’identificazione diretta del virus direttamente nel campione
clinico prevede l’utilizzo di metodiche rapide, in grado di fornire una
risposta al quesito diagnostico in poche ore o, al più, in giornata.
Microscopia elettronica
La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente
utilizzata:
adsorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale metallico
pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido fosfotungstico)
colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto negativo)
diagnosi rapida (15 min) e specifica sulla base di caratteri morfologici
(forma, dimensioni, organizzazione)
scarsa sensibilità: 106-107 virioni/ml; necessità di arricchire il
campione prima di osservarlo (tranne che per campioni fecali o lesioni
da HSV, in cui si hanno 1011 virioni/ml)
aumentata sensibilità mediante utilizzo di anticorpi (immunoelettronmicroscopia)
elevati costi di gestione, richiesta di elevato expertise e scarsa
sensibilità ne limitano l’impiego routinario
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: microscopia elettronica
HIV
Ebola virus
SARS
HBV
Conteggio diretto delle particelle virali mediante
microscopia elettronica
La sospensione virale è posta su un retino per ME e colorato.
L’inclusione di una quantità conosciuta di sfere di latex
permette una stima quantitativa del virus
Non è una tecnica standardizzata e di uso
frequente
Richiede un sufficiente numero di particelle
virali. Adatto per diagnosi di infezioni con
massiva eliminazione virale (Rotavirus)
Aggiunta di anticorpi specifici per
aumentare la sensibilità
(immunoelettromicroscopia)
Sovrastima del titolo
Microfotografia di una goccia contenente 15 microsfere in
lattice e 14 unità di virus vaccinico (Poxvirus)
(leggermente più piccoli, forma a “mattone”).
(da: Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, 2001)
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
Ricerca di antigeni virali
E’ necessario disporre di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici
A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare (cellule,
feci, sangue-siero) possono essere applicate le seguenti tecniche:
Immunofluorescenza (IF): rivelazione “fluorescente” del complesso Ag-Ab
Diretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo coniugato con
isotiocianato di fluorescina (o rodamina)
Indiretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo 1ario che, a sua
volta, viene legato da un anticorpo 2ario coniugato (diretto verso Fc delle Ig
della specie in cui è stato prodotto l’anticorpo 1ario)
Immunoperossidasi (IP): rivelazione “colorimetrica” del complesso Ag-Ab
similare alla IF, sebbene l’anticorpo sia marcato con perossidasi di rafano
che, in presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione colorimetrica
molto utile se effettuata su preparati colorati per l’istochimica
Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione “colorimetrica” complex Ag-Ab
“sandwich test”: anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad
una superficie plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione
direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo
anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig
utilizzabile anche per antigeni “solubili”
non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione
Immunofluorescenza (IF):
diretta vs indiretta
IF: Coronavirus in
cellule epiteliali di
sfaldamento
IF: CMV in
leucociti
IF impiegata per la ricerca di:
-antigeni virali presenti nelle cellule epiteliali di
sfaldamento delle vie respiratorie (adenovirus,
coronavirus) o di occhio e cute (HSV, VZV);
-antigene precoce pp65 di CMV nei leucociti
infetti.
Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni virali. Nel test diretto, l’anticorpo
marcato con colorante fluorescente è applicato al campione contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in
eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza.
Nel test indiretto, l’antigene è rilevato mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con
un anti-anticorpo marcato con una sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è
umano, il secondo anticorpo sarà un anticorpo contro le Ig umane).
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: ricerca antigenica mediante IP
Particolarmente utile se applicata a tessuti integri contromarcati con
coloranti istochimici (definizione delle relazioni spaziali tra antigene
virale e strutture cellulari)
Ricerca di antigeni specifici
mediante ELISA
Ricerca immunoistochimica
antigenica del West Nile virus nel
cervello di hamsters infetti
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: ricerca antigenica per ELISA
- E’ la metodica più frequentemente impiegata nei laboratori di virologia.
- Adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida
(sangue, liquor, siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle co-colture
infette.
- Impiegata nella diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici
(rotavirus), epatitici (HBV) e HIV.
Ricerca di antigeni specifici
mediante ELISA
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
Ricerca di acidi nucleici
Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali
Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione)
Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus:
difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus)
a lenta crescita (CMV, VZV)
ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica
Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità
Differenti tipologie di saggi molecolari:
Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA)
Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e rivelazione
elettroforetica
Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che
impiega una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di
amplificazione vs PCR)
Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bDNA, HC):
bDNA: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi alcalina
complementari alla molecola di bDNA)
Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato con
sonda a RNA specifica per la sequenza in esame
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: PCR
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: Hybrid capture (HC)
Misurazione della carica virale
Misurazione della concentrazione
delle unità (virali) infettanti
Titolo virale (ufp/ml)
Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la
formazione di placche (ufp) in cellule animali in coltura
Dose di coltura tessutale (TVD)
Numero di virioni che causa effetto citopatico in coltura cellulare
Dose letale 50 (LD50)
Numero di virioni che uccide il 50% di un gruppo di cavie
Dose infettante (ID50)
Numero di virioni che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta
anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento
Misurazione delle unità infettanti
Metodo diretto: Plaque assay
1:100
1:10
1:10
1:10
1:10
1:10
virus
serial dilution
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
100.000
10.000
1.000
100
10
1
plate 1 ml
plaques (n)
Titolo = 1 x 107 ufp (unità formanti placca) / ml
Plaque assay
da: Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-5
Misurazione delle unità infettanti
Metodo indiretto: inoculazione di uova embrionate
da: Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg “Microbiology” 4th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig. 48-1
Misurazione delle unità infettanti
Metodo indiretto: inoculazione di uova embrionate
Formazione di “pock” indotte da cowpox
virus sulla membrana corion-allantoidea
(CAM) di embrioni di pollo.
CAM di embrioni sani di pollo (11 giorni)
vengono inoculate con cowpox e le uova
incubate per 3 gg a 37.5°C. La CAM viene
quindi rimossa dall’uovo e fotografata.
Le immagini evidenziano la formazione di
pocks emorragici.
(da: Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott
Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-1)
Misurazione della concentrazione
delle unità infettanti (virali)
Titolo virale (ufp/ml)
Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la
formazione di placche in cellule animali in coltura
Dose letale 50 (LD50)
Numero (titolo) di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie
infettate sperimentalmente
Dose di coltura tessutale (TVD)
Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare
Dose infettante (ID50)
Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta
anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento
Calcolo di LD50
Conteggio indiretto di particelle virali:
Emoagglutinazione (HA)
virus
No virus
Test di emoagglutinazione
1.
2.
3.
1:8
1:2
1:2
Allestire diluizioni seriali “2-fold” del campione (1:2,
1:4, 1:8, 1:16, …)
Aggiungere 1% RBC animali (maiale, pollo)
Incubare a +4°C per 1-2 h
1:2
1:2
1:2
virus
serial dilution
8
16
32
64
128
256
mix with red
blood cells
side view
top view
Titolo = 32 unità HA/ml (reciproco della max diluizione virale che causa emoagglutinazione)
Test di Emoagglutinazione: virus influenzale
Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti campioni contenenti tipi di influenzavirus, numerati da 1 a 7,
sono stati diluiti serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo (RBC), ed incubati
in ghiaccio per 1-2 h. I pozzetti dell’ultima riga non contengono virus (ctrl negativo). Il Titolo (indicato
nell’ultima colonna) è l’ultima diluizione in grado di causare emoagglutinazione completa.
(da: Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)
Diagnosi infezione virale
sensibilità
Comparazione della sensibilità delle metodiche quantitative
Tecnica
Quantità (per ml)
Conta al microscopio elettronico
1010 particelle EM
Saggio in uova embrionate
109 egg ID50
Saggio di formazione di placca
108 ufp
Saggio di emoagglutinazione
103 unità HA
Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4
Diagnosi sierologica delle
infezioni virali
Meccanismi di difesa immunitari
Risposta umorale (produzione anticorpale)
Tutte le proteine virali sono immunogene. Nel corso dell’infezione
virale vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali:
IgM, che si manifestano precocemente (indice di infezione in
atto/recente) e solo nella “prima infezione” di soggetto non
immune
IgG, che si presentano più tardivamente e sono prontamente
mobilizzate a seguito dei possibili successivi contatti con
l’antigene. “Controllo” virale a livello sierico. Più efficaci delle IgM
IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante ruolo di
“barriera” alla penetrazione virale delle mucose
Non tutti gli anticorpi hanno una funzione protettiva:
la migliore risposta anticorpale è quella sviluppata nei confronti
degli antirecettori (capsidici o di peplos)
Diagnosi sierologica
La prevalente componente proteica della struttura virale
rende il virione altamente immunogeno
La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla
ricerca di IgM (indice di infezione in atto o recente)
Alternativamente:
sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione
(primaria) in atto
aumento (≥ 4-fold) del titolo anticorpale (2 campioni: fase acuta
vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o
reinfezione) in atto
Diagnosi sierologica
Tecniche sierologiche
SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche
attività derivanti dalla formazione dell’immunocomplex
○ Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un
caratteristico effetto citopatico. Rappresenta il “gold standard”,
sebbene richieda elevati costi e tempi di esecuzione
○ Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione: Abs specifici
in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus
(influenza, parainfluenza, morbillo)
○ Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs
specifici si forma un immunocomplesso che lega il
Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può
lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione
dell’immunocomplesso: Ag + eritrociti)
Titolo anticorpale: reciproco della più alta diluizione in grado di neutralizzare/inibire …
Diagnosi sierologica
saggi di neutralizzazione CPE
saggi di inibizione emoagglutinazione
Saggio di inibizione della emoagglutinazione
Virus
HA
Serum
8 wks
1 wk
dilution
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
-ve control
Diagnosi sierologica
Tecniche sierologiche
SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot):
identificazione di Abs diretti verso singole e
specifiche proteine virali
○ separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante
○
○
○
○
○
elettroforesi
trasferimento Ags su membrana
esposizione al siero in esame
sistema di rilevazione colorimetrica dell’immunocomplex:
Abs anti-Ig umane marcati con enzima
aggiunta del substrato per l’enzima
rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)
Diagnosi sierologica
Western blot
Diagnosi sierologica
Tecniche sierologiche
SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e
radiometrico):
○ adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o biglie di
polistirene)
○ aggiunta del siero in esame
○ rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2ario
anti-IgG umane marcato con:
EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire
con idonei substrati (reazione colorimetrica, misurata allo
spettrotometro)
RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo (125I),
segnale misurato con un contatore di raggi gamma
Il saggio EIA viene comunemente preferito perchè
automatizzabile, versatile, standardizzabile