Document ID: FP09 I87 R01 IT B.2 Update: 22/01/2016
Reagente 4 (60ml): tampone per arresto reazione (0.02M
NaOH)
Reagente 5 (1ml): soluzione standard (5mM PNP)
Reagente 6 (60ml): tampone standard (0.02M NaOH + 0.1%
SDS)
I certificati analisi e gli MSDS sono disponibili su richiesta o possono
essere scaricati dal nostro sito (www.fertipro.com).
ABBREVIAZIONI
MATERIALE NON INCLUSO NEL KIT
CLSI
CV
IVD
LOD
LOQ
OD
PNP
PNPG
SDS
WHO
Lettore di piastre, fotometro (filtro 405nm), agitatore termostato o
bagnomaria, pipetta, provette Eppendorf da 1.5ml, piastre da microlitri.
EPISCREEN PLUS™
TEST IN VITRO PER LA DETERMINAZIONE DI ALFA GLUCOSSIDASI (25
TESTS) NEL LIQUIDO SEMINALE UMANO (PLASMA)
Clinical and Laboratory Standards Institute
Coefficient of Variation
In Vitro Diagnostic Device
Limit Of Detection
Limit Of Quantification
Optical Density
Para (4)-Nitrophenol
Para (4)-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside
Sodium dodecyl sulfate
World Health Organization
STOCCAGGIO, TRASPORTO E STABILITA’
Adatto a trasporto o stoccaggio a breve terme ad alte temperature (fino a
5 giorni a 37°C) ed a basse temperature (fino a 2 giorni a -18°C).
L’EpiScreen PlusTM deve essere stoccato a 2-8°C, protetto da luce
solare ed è stabile per 24 mesi. Non utilizzare dopo la data di scadenza.
Flaconi aperti rimangono stabili per 13 mesi.
PRESTAZIONI DEL TEST
USO
EpiScreen PlusTM è un test diagnostico in vitro per la determinazione
quantitativa dell’alfa-glucossidasi nel liquido seminale umano (plasma).
L’attività enzimatica di almeno 25 campioni può essere determinata con
un kit di EpiScreen PlusTM. Solo per uso professionale.
INFORMAZIONI GENERALI
L’attività di alfa-glucossidasi nel liquido seminale, e particolarmente,
l’isoenzima neutro, dipende dalla secrezione dell’epididimo1.
In pazienti con azoospermia e livelli androgeni normali nel sangue,
l’attività di alfa-glucossidasi neutro nel plasma del seme è un marcatore
sicuro dell’apporto dell’epididimo nell’eiaculato.
Maschi azospermici con ostruzioni bilaterali tra l’epididimo ed il condotto
eiaculatorio hanno una accentuata bassa attività di alfa-glucossidasi nel
plasma seminale2. Al contrario, se l’azospermia è dovuta ad un arresto
della maturazione dello sperma, o ad ostruzione tra l’epididimo ed i
testicoli, o nei testicoli stessi, l’alfa-glucossidasi è normale.
Quindi, la determinazione di alfa-glucossidasi neutrale nel plasma
seminale di uomini virili ma con azoospermia può indicare le cause di
queste condizioni3,4.
Attività basse di alfa-glucossidasi neutro nel plasma seminale di un
paziente con oligospermia può indicare ostruzione parziale
dell’epididimo, associato ad infezioni od infiammazioni2,5. L’attività
enzimatica nei pazienti con concentrazioni normali di sperma è correlata
al risultato del test di Shorr sulla coda e nucleo della cellula spermatica.
Questo riflette cambiamenti della membrana spermatica, provocati da
secrezioni dell’epididimo5.
Il test EpiScreen PlusTM può aiutare nella diagnosi e trattamento
dell’infertilità maschile.
PRINCIPIO DEL TEST
Il principio del test si basa sulla seguente reazione:
PNPG + alfa-glucossidasi --> alfa-D-glucopiranossidasi + PNP
(giallo)
Con condizioni particolari (pH = 6,8; T = 37°C), 1 UI di alfa-glucossidasi
libererà ogni minuto 1µM di PMP dal substrato PNPG7. Il colore giallo di
PNP può essere letto con spettrofotometro a 405 nm. L’attività dell’alfaglucossidasi è espressa in UI/Litro (o mIU/mL).
Il tampone di reazione contiene SDS, che inibisce selezionando l’acido
di alfa-glucossidasi proveniente dalla prostata. Questo facilita la
determinazione precisa dell’attività dell’enzima neutro6.
Inibizione: Il glucosio inibisce l’alfa-glucossidasi nel legarsi al
monosaccaride dell’alfa-glucossidasi8. Questo processo di inibizione è
un fenomeno che dipende dal pH e dalla quantità, ed è il principio sul
quale si basa il controllo dei campioni di seme (plasma).
I parametri di convalida sono stati calcolati basandosi sulle linee guida
dell’ultimo CLSI9,10.
Intervalli di misura : 2.32 – 144 mlU/ml
Intra–assay CV : 3.08%
Sensibilità : 96.0%*
Inter–assay CV : 10.52%
Specificità : 93.6%*
Precisione entro campioni : Pool basso: 0.96 mlU/ml; Pool alto: 3.70
mlU/ml
Cutoff : 6.35 mlU/ml
20 mlU/eiaculato (se corretto con il volume dell’eiaculato).
* Vasectomizzato/normozospermico
VERIFICHE PRIMA DELL’USO
Non utilizzare il prodotto se il tappo del flacone è aperto o danneggiato al
momento della consegna. Se conservato a 2-8°C può verificarsi un
precipitato nel reagente 1 ma questo sparisce con il riscaldamento 37°C.
METODICA
Prima dell’uso, scaldare i reagenti 1, 2 e 3 a 37°C per 30 minuti. Si
consiglia un bagnomaria o un agitatore termostatato per assicurare un
riscaldamento dei campioni. NON incubare in un incubatore perché
questo potrebbe influire sul risultato della reazione.
Nota: Il WHO consiglia di eseguire due controlli interni di qualità per una
correzione. Siccome le variabili di campioni di seme sono abbastanza
ampi (± 20%), si consiglia di preparare un pool di negativi come controllo
da confrontare con ciascun campione (plasma), in modo da applicare
una correzione corretta e riproducibile.
I seguenti passaggi sono da fare :
1. Per ogni campione (plasma) da analizzare:
a.
Preparare una soluzione reazione: 3 µl di soluzione substrato
(Reagente 2) in 147µl di tampone (Reagente 1)
b.
Fare una soluzione di inibizione (= per controllo negativo): 3µl
di soluzione substrato (Reagente 2) in 147 µl di soluzione di
inibizione (Reagente 3)
2. Pipettare 20µl di ciascun campione (plasma) o seme in una provetta
Eppendorf da 1.5 ml
3. Aggiungere 130µl di soluzione di reazione in una provetta e 130 µl di
soluzione inibitore in un’altra
4. Agitare ed incubare per esattamente 2 ore a 37°C
5. Durante l’incubazione del liquido seminale (plasma), preparare la
curva standard di PNP come segue:
Preparare lo standard alto (200µM) sciogliendo 100 µl di soluzione
standard (Reagente 5) in 2400µl di tampone soluzione standard
(Reagente 6). Utilizzare questa soluzione per preparare gli altri
standard come indicato nella tabella 1. Il Reagente 6 serve come
standard 0 (bianco).
Tavolo 1: Curva standard di PNP
200 µM Standard (µl)
Reagente 6 (µl)
Concentrazione finale
(µM)
375
125
150
250
250
100
125
25
375
475
50
10
0
500
0
TIPO DI CAMPIONI
Il test può essere eseguito su campioni freschi o congelati e scongelati e
campioni di plasma spermatico.
MATERIALI INCLUSI NEL KIT
L’attività enzimatica di almeno 25 campioni (incluso campioni ripetuti),
possono essere eseguiti con un kit EpiScreen PlusTM.
Reagente 1 (5 ml): tampone (pH 6.8) con aggiunta di 1% SDS
Reagente 2 (0.25 ml): 50X soluzione substrato (PNPG in
DMSO)
Reagente 3 (5 ml): soluzione di inibizione (tampone con
glucosio)
6. Dopo 2 ore di incubazione dei campioni (controllo della reazione e
dell’inibitore negativo), arrestare la reazione aggiungendo 1 ml di
tampone (Reagente 4) ed agitare.
7. Pipettare 200µl di tutti i campioni e degli standard (preparati nel
passaggio 5) in una micropiastra
8. Leggere l’assorbanza a 405nm
INTERPRETAZIONE
BIBLIOGRAFIA
CURVA STANDARD
1. Cooper TG, Yeung CH, Nashan D, Jöckenhovel F, and Nieschlag E. (1990)
Improvement in the assessment of human epididymal function by the use of
inhibitors in the assay of alpha-glucosidase in seminal plasma. Int. J. Androl., 13:
297-305
1. Calcolare Δ valori OD (valore OD standard – valore OD bianco (0standard)
2. Preparare il valore Δ OD (Ύ-asse) in relazione alla concentrazione
standard (X – asse) e riportare su una curva lineare per calcolare il
pendenza. Il coefficiente (R²) dovrebbe essere ≥ 0.99.
2. Guerin JF, Ben Ali H, Rollet J, Souchier C, and Czyba JC. (1986) Alphaglucosidase as a specific epididymal enzyme marker. Its validity for the etiologic
diagnosis of azoospermia. J. Androl., 7: 156-162
3. Casano R, Orlando C, Caldini AL, Barni T, Natali A, and Serio M. (1987)
Simultaneous measurement of seminal L-carnitine, alpha 1-4-glucosidase and
glycerylphosphorylcholine in azoospermic and oligospermic patients. Fertil. Steril.,
47: 324-328
Il grafico riporta un esempio:
4. Cooper TG, Yeung CH, Nashan D, and Nieschlag E. (1988) Epididymal markers
in human infertility. J. Androl., 9: 91-101
Standard curve PNP
y = 0.0097x
R² = 0.9999
2.500
OD 405 nm
2.000
6. Paquin R, Chapdelaine P, Dubé JY, Tremblay RR (1984) Similar biochemical
properties of human seminal plasma and epididymal alpha-1,4-glucosidase. J.
Androl., 5: 227-282
1.500
1.000
0.500
0.000
0
50
100
150
200
250
PNP Concentration (µM)
ATTIVITA’ ENZIMATICA SCONOSCIUTA
1.
2.
3.
4.
5. Haidl G, Badura B, Hinsch KD, Ghyczy M, Gareiss J, Schill WB. (1993)
Disturbances of sperm flagelle due to failure of epididymal maturation and their
possible relationship to phospholipids. Hum. Reprod., 7: 1070-1073
Calcolare il valore Δ OD per tutti i campioni ed inibitori (controllo
negativo): (valore OD dei campioni di seme - bianco OD (0standard))
Calcolare il valore di background OD corretto del liquido seminale
(plasma): Sottrarre il valore Δ di OD dal controllo inibitore negativo
dal corrispondente valore Δ di OD di reazione del campione.
Calcolare la concentrazione di PNP corrispondente dividendo il
valore OD di background sul dato della curva standard.
Per ultimo, l’attività enzimatica (mlU/ml) è calcolata moltiplicando il
valore di PNP con 0.479 (Vedi più avanti la sezione del fattore di
correzione).
Esempio
Risultati analisi
OD bianco (0-standard) = 0.045;
ODcampione = 0.845;
ODdell’inibitore (controllo negativo) = 0.060;
Pendenza della curva standard = 0.0097
1. Δ OD campione = 0.845 – 0.045 = 0.800
Δ OD campione inibitore (controllo negativo) = 0.06 - 0.045 =
0.015
2. Valore OD del campione corretto con il background = 0.800 –
0.015 = 0.785
3. Concentrazione PNP = 0.785 / 0.0097 = 80.93 µM
4. Attività enzimatica = 80.93 x 0.479 = 38.76 mlU/ml
Il calcolo dell’attività enzimatica può essere moltiplicato per il volume
dell’eiaculato per valutare l’attività enzimatica in tutto l’eiaculato.
Nota: La curva standard consiste in punti tra loro di 0-200 µM, perché la
maggioranza dei campioni avrà dei valori tra questo intervallo. La
linearità della curva è stata dimostrata fino a 300 µM. Comunque, se si
desidera, l’operatore può cambiare la curva iniziando da 300 µM,
corrispondente ad una attività enzimatica di 144 mlU/ml. Se campioni
sconosciuti hanno valori alti di attività si consiglia di diluirli ed eseguire
nuovamente il test per confermare il dato.
FATTORE DI CORREZIONE
Il fattore è ottenuto considerando la diluizione del campione ed il tempo
di incubazione (120 min).
Il test utilizza 20µ di campione spermatico che è diluito in 1150µl (20µl di
campione spermatico + 130 µl di tampone di reazione + 1000µl di
tampone di arresto reazione), portando ad fattore di diluizione di 57.5.
Una unità enzimatica è definita come la formazione di PNP per minuto.
Quindi, il fattore di diluizione deve essere diviso in 120 per calcolare
l’attività per minuto. Questo corrisponde in fattore di diluizione di 0.479.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Questo test è un aiuto per la diagnosi e come per altri tast diagnostici;
l’interpretazione dei risultati deve essere fatta entro certi parametri di
indagini cliniche e tenendo presente i dati storici. Altre cause di
insufficienza di secrezione epidimale devono essere accertate ed
escluse, come ipo androgenesi o atrofia grave testicolare.
Tutti i componenti devono essere utilizzati in un modo sicuro e secondo
le norme locali e/o nazionali.
7. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen,
th
5 edition. Measurement of neutral alpha-glucosidase in seminal plasma. pp. 134136
8. Yao X, Mauldin R, Byers L. (2003) Multiple sugar binding sites in α-glucosidase.
Biochim. Biophys. Acta, 1645: 22-29
9. Shrivastava A, Vipin B, Gupta VB (2011) Methods for the determination of limit of
detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chron. Young Sci. 2:
21-25
10. Chesher D. (2008) Evaluating Assay Precision. Clin Biochem. Rev., 29: S23-S
11. Eertmans F, Bogaert V, Van Poecke T, and Puype B. (2014) An Improved
Neutral a-Glucosidase Assay for Assessment of Epididymal Function - Validation
and Comparison to the WHO Method. Diagnostics. 4: 1-11
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