Strategie biotec per l’incremento di
resistenza alle malattie
Come si difendono le piante dai patogeni?
Difese costitutive:
-barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete
cellulare
-metaboliti secondari tossici
Difese indotte:
- risposta locale: induzione di una serie di reazioni
metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare
l’ingresso del patogeno
-risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR)
Strategie usate per produrre piante transgeniche
Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o inibizione della
fisiologia del patogeno
Strategia 1a – difesa costitutiva (inserire geni codificanti proteine
antimicrobiche)
Strategia 1b –difesa indotta (è una variante della strategia 1a dove
le proteine antimicrobiche sono controllate da un promotore
inducibile)
Strategia 2: regolazione della naturale risposta di difesa indotta
Strategia 2a: Modifica del sistema di riconoscimento del patogeno
(es. geni R)
Strategia 2b: Modifica delle vie di regolazione a valle (es. SAR)
e fattori di trascrizione
Strategia 3: “Pathogen mimicry” o vaccinazione genetica o resistenza
indotta. Consiste nella manipolazione della pianta per indurre il
riconoscimento di uno specifico patogeno attraverso sequenze
derivate dal patogeno.
Collinge et al. Eur J Plant Pathol (2008) 121:217–231
I geni più comuni inseriti in piante coltivate e di cui si
stanno effettuando prove di campo negli USA
Collinge et al. Annu. Rev. Phytopathol. 2010. 48:269–91
Per le strategie 1 e 2 i geni utilizzati sono:
1) Geni di pianta o esogeni che possiedono
attività antimicrobica o contrastano
fattori di virulenza del patogeno
2) Geni di pianta o del patogeno che
possono indurre o potenziare la
risposta di immunità della pianta
1) Geni di pianta o esogeni che possiedono
attività antimicrobica o contrastano
fattori di virulenza del patogeno
• Esempio: sovraespressione del gene della chitinasi
• Esempio: proteina antimicrobica KP4
• Esempio: sovraespressione del gene della chitinasi
Proteine PR
Families
PR-1
Type member
Tobacco PR-1a
Properties
antifungal
PR-2
Tobacco PR-2
b-1,3-glucanase
PR-3
Tobacco P, Q
chitinase type I,II, IV,V,VI,VII
PR-4
Tobacco 'R'
chitinase type I,II
PR-5
Tobacco S
thaumatin-like
PR-6
Tomato Inhibitor I
proteinase-inhibitor
PR-7
Tomato P69
endoproteinase
PR-8
Cucumber chitinase
chitinase type III
Tobacco 'lignin-forming
PR-9
peroxidase'
peroxidase
PR-10
Parsley 'PR1'
'ribonuclease-like'
PR-11
Tobacco 'class V' chitinase
chitinase, type I
PR-12
Radish Rs-AFP3
defensin
PR-13
Arabidopsis THI2.1
thionin
PR-14
Barley LTP4
lipid-transfer protein
PR-15
Barley OxOa (germin)
oxalate oxidase
PR-16
PR-17
Barley OxOLP
Tobacco PRp27
'oxalate oxidase-like'
unknown
Fusariosi della spiga: Fusarium head
Blight (FHB)
Malattia causata da Fusarium
graminearum e altre specie del genere
Fusarium spp.
Fusarium graminearum produce la micotossina Deossinivalenolo (DON)
Metodo biolistico – co-bombardamento
pAHCBarChit + pAHC25 in embrioni immaturi
pAHCBarChit: plasmide contenente un gene di chitinasi classe II (PR-3) di orzo
T nos: terminatore della nopalina sintasi di A. tumefaciens
uidA: gene per la β-glucuronidasi (GUS) di Escherichia coli
Bar: gene per la phosphinothricin acetyltransferase (PAT) di Streptomyces hygroscopicus
Selezione, rigenerazione e trasferimento in terreno delle piante T 0
Esperimenti di infezione
Frumento-Fusarium
graminearum
Esperimenti di infezione Frumento-Fusarium
graminearum
% infected spikelets
NS
T
Days post-infection
Cariossidi malate
Cariossidi sane
Conclusioni
Due delle 7 linee transgeniche che hanno mostrato una
aumentata resistenza alla fusariosi in serra, hanno
confermato questa capacità in esperimenti di campo.
Entrambe queste linee (C8 and C17) mostravano più elevati
livelli di espressione della chitinasi rispetto alle altre linee.
Per ragioni non chiarite, la linea C15 che esprime alti livelli
di chitinasi non mostra maggiore resistenza alla fusariosi in
campo.
• Esempio: proteina antimicrobica KP4
KP: ‘killer proteins’ (KP) isolata da un virus che infetta
il fungo patogeno Ustilago maydis
Le linee transgeniche mostrano una riduzione del
sintomo del 30%
L’attività antimicrobica è efficace su più specie fungine di patogeni
Plant Biotechnology Journal
Volume 4, Issue 1, pages 63-75, 8 SEP 2005 DOI: 10.1111/j.1467-7652.2005.00158.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1467-7652.2005.00158.x/full#f1
Biosafety studies
1) Geni di pianta o esogeni che possiedono
attività antimicrobica o contrastano
fattori di virulenza del patogeno
• Esempio: inibitore proteico della
poligalattoronasi (PGIP)
• Esempio: ossalato ossidasi
• Esempio: inibitore proteico della poligalattoronasi
(PGIP)
Progressione dei sintomi dopo 7
e 19 giorni post infezione con
F. graminearum
T
C
C
T
g/spike
Kernel yield per spike
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
*
*
C
C-I
T
T-I
Average values of 5 combined resistance tests
DON contamination of F. graminearum infected
control (NS) and Transgenic (T) plants
14
DON mg/g
12
*
10
8
6
*
4
2
0
C-I
T-I
More than 50% reduction in DON accumulation in
the transgenic infected plants
Total Starch
Total starch content (%)
66,00
64,00
62,00
*
60,00
*
58,00
56,00
54,00
52,00
50,00
NS
NS- I
T
T -I
Average values of 5 combined resistance tests
EXPERIMENTAL DESIGN
Control
Control inf
Comparison 1 (C1)
3
10
Comparison 2 (C2)
Comparison 3 (C3)
Master gel
1986 spots
Comparison 4 (C4)
Transgenic
Transgenic inf
• Esempio: ossalato ossidasi
Planta (2008) 228:331–340
2) Geni di pianta o del patogeno che
possono indurre o potenziare la
risposta di immunità della pianta
Esempio: utilizzo del gene di Resistenza Rpg1
Esempio: utilizzo del gene Npr1
• Esempio: utilizzo del gene di Resistenza Rpg1
364–369 PNAS January 7, 2003 vol. 100 no. 1
L’introduzione dei geni R nelle varietà coltivate conferiscono la
resistenza per un periodo di tempo limitato
Anni di picco
Anni di crollo
The stem rust resistance gene Rpg1 has protected North American
barley cultivars from significant yield losses for over 65 years
• Esempio: utilizzo del gene Npr1
Jaemyung Choi , Sung Un Huh , Mikiko Kojima , Hitoshi Sakakibara , Kyung-Hee Paek , Ildoo Hwang
The Cytokinin-Activated Transcription Factor ARR2 Promotes Plant Immunity via TGA3/NPR1-Dependent Salicylic Acid
Signaling in <ce:italic>Arabidopsis</ce:italic>
Developmental Cell Volume 19, Issue 2 2010 284 - 295
http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2010.07.011
Figure?7 Cytokinins Synergistically Interact with SA to Induce <ce:italic> Pr1</ce:italic> Expression through the TGA3-Interacting
ARR2 Transcription Factor In cytokinin-rich tissues, TGA3 interacts with and recruits activated ARR2 to the <ce:i...
Jaemyung Choi , Sung Un Huh , Mikiko Kojima , Hitoshi Sakakibara , Kyung-Hee Paek , Ildoo Hwang
The Cytokinin-Activated Transcription Factor ARR2 Promotes Plant Immunity via TGA3/NPR1-Dependent Salicylic Acid
Signaling in <ce:italic>Arabidopsis</ce:italic>
Developmental Cell Volume 19, Issue 2 2010 284 - 295
http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2010.07.011
Figure 4
The Arabidopsis NPR1 Protein Is a Receptor for the Plant Defense Hormone Salicylic Acid
Source: Cell Reports , Volume 1, Issue 6, Pages 639-647 (DOI:10.1016/j.celrep.2012.05.008)
Copyright © 2012 The Authors Terms and Conditions
Infezione su
spiga con F.
graminearum
Trattmento
sulla foglia
Trattmento
sulla foglia
NH1 (NPR1 di riso) sotto il controllo del promotore Ubi1 di mais induce
una espressione costitutiva dei geni PR
Altri esempi di strategie applicabili
Geni derivati dai patogeni: Uso degli elicitori
Prom PR1
Avr
Ter
Prom 35S min
Gene R
Ter
Utilizzo di un “recettore” ad ampio spettro e fattore
specifico (gene R)
PGIP
PG di funghi patogeni
Chimera PGIP/Xa21
Attivazione genica
Strategia 3: “Pathogen mimicry”
Resistenza ai virus
Virus del
mosaico del
tabacco
Il controllo delle malattie virali è difficile:
in genere si controllano gli organismi che ne
consentono la diffusione (es. afidi, ma l’uso
degli insetticidi ha un impatto limitato nel
controllo della diffusione della malattia)
o più efficacemente si attuano controlli
colturali (rimozione delle piante malate o uso
di varietà resistenti/tolleranti)
Protezione crociata
-1972: prima osservazione:
l’inoculo di una pianta con un ceppo virale non molto
virulento si otteneva la protezione contro una successiva
infezione con un ceppo virale molto virulento. Protezione
crociata
Quasi tutti i virus esprimono proteine dei seguenti tre tipi:
• Proteine di rivestimento (Coat proteins, CPs);
• Proteine di movimento (Movement proteins, MPs);
• Proteine per la replicazione
I meccanismi di difesa naturali delle piante sono
diretti verso questi target e verso il genoma virale.
Come funziona la resistenza indotta
nelle prime piante GM resistenti ai
virus?
Sovraesprimendo nella pianta una proteina del virus
(in genere la proteina del capside) si induce un
processo noto come cosoppressione genica
In caso di infezione la cellula vegetale transgenica
“percepisce” che un gene è sovraespresso e risponde
bloccando l’espressione del transgene e virale
Strategia nota anche come Resistenza virale mediata
dalla proteina del capside
Resistance to tomato spotted wilt virus in transgenic tomatoes
(left) due to the insertion of a viral gene. Control plants are on the
right. (Courtesy T. German)
T
C
Silenziamento genico nelle piante
“Cosoppressione” (RNAi di un gene endogeno indotta da una inserzione di
un transgene) originalmente descritta in una petunia transgenica in cui
desiderava sovraesprimere la calcone sintasi (CHS), un enzima per la
biosintesi delle antocianine (Jorgensen et al, Plant Cell 1990 2:279).
35S CHS cDNA
promotore
Processo che determina la downregulation di un gene
•a livello della trascrizione (TGS)(es.
trasposoni, geni retrovirali,
eterocromatica)
•o post-trascrizionale (PTGS)(dopo la
trascrizione di un gene)
Esistono due meccanismi correlati basati sull’RNA
che determinano il silenziamento genico nelle
piante :
1) RNA interference (RNAi): degradazione
dell’mRNA
2) Metilazione del DNA controllata dall’RNA (RNAdirected DNA Methylation, RdDM): soppressione
della trascrizione
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
RNA a doppia elica o siRNAs scatenano la metilazione del DNA (RdDM)
RNA aberrante
priming
RdRP, etc.
ds RNA
dicer ribonuclease
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
RNAi fornisce una difesa contro virus e sequenze trasponibili, ma si è
anche evoluto come meccanismo per produrre micro-RNAs (miRNAs) da
sequenze endogene che regolano l’espressione genica durante lo
sviluppo disturbando la stabilità o la traduzione dell’ mRNA target.
DICER
RISC
Ronald P. van Rij , Raul Andino
The silent treatment: RNAi as a defense against virus infection in mammals
Trends in Biotechnology Volume 24, Issue 4 2006 186 - 193
http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2006.02.006
Figure 1 RNA silencing pathways. The double-stranded RNA silencing pathway is involved in two different modes of posttranscriptional gene silencing <ce:cross-refs refid="bib1 bib58"> [1,58]</ce:cross-refs> . In the ?cleavage mode? of RNAi, doubl...
Fattori scatenanti l’RNAi nelle piante
1) Infezione con un virus a RNA che contiene un segmento della
sequenza genica target
replication
dicer
2) Integrazione di un transgene ripetuto invertito fortemente trascritto
transcription
dicer
3) Trascrizione elevata di transgeni ripetuti non-invertiti
transcription
?
dicer
Virus-induced gene silencing (VIGS).
Espressione transiente con sistemi virali
In piante di Nicotiana benthamiana come
sistema eterologo utilizzando il virus X
della patata (PVX)
166 kd
25kd
8kd
GDI
12kd
Purificazione delle proteine eterologhe
CP
VIGS della Fitoene desaturasi
La fitoene desaturasi è un enzima
chiave della biosintesi dei
carotenoidi, che sono pigmenti
fotoprotettivi.
La perdita di questi pigmenti
mediante VIGS causa il fotobleaching e il tessuto diventa bianco
VIGS di una pianta di
tabacco che esprime la GFP
Diffusione sistemica
della VIGS-GFP
Esteso VIGS della GFP
Il coloro rosso è dovuto alla
fluorescenza della clorofilla
illuminata con gli UV
VIGS di NbEDS1 compromette la resistenza al TMV
mediata dal gene di resistenza N
Programma del corso
•La risposta della pianta agli stress.
•Stress abiotici e biotici.
•Meccanismi di difesa delle piante.
•Attivazione delle risposte di difesa delle piante.
•Le risposte sistemiche di difesa delle piante.
•Trasformazione genetica: Agrobacterium, geni reporter e promotori costitutivi,
tessuto-specifici, inducibili e sintetici.
•Possibili strategie biotec per l’incremento della resistenza alla siccità.
•Possibili strategie per il controllo dei fitopatogeni mediante l'ingegneria genetica:
utilizzo di 1) Geni di pianta o esogeni che possiedono attività antimicrobica o
contrastano fattori di virulenza del patogeno; 2) Geni di pianta o del patogeno che
possono indurre o potenziare la risposta di immunità della pianta; Resistenza ai
virus; RNAi; VIGS.
•Esempi specifici.
•Studi di caso: piante transgeniche in commercio resistenti a virus e insetti.
•Cambiamenti climatici e malattie delle piante.
•Preoccupazioni sociali per l'applicazione delle Biotecnologie nel settore agrario
(particolare riferimento alle piante resistenti a malattie) e possibili approcci biotec
per superare le critiche
