tecniche elettroforetiche - Progetto e

TECNICHE
ELETTROFORETICHE
L’elettroforesi e’ un metodo di separazione
che si basa sulla diversa mobilita’ degli ioni
(o di sostanze elettricamente cariche),
quando posti all’interno di un campo elettrico
generato fra due elettrodi; tale tecnica e’
largamente usata per la separazione di
molecole biologiche, quali
proteine,amminoacidi ed acidi nucleici.
All’interno di un campo elettrico (E), su ogni
ione di carica q viene applicata una forza (F)
espressa da:
F = qE
Tuttavia, esiste anche una resistenza frizionale,
che rallenta il movimento della particella carica;
tale resistenza e’ una misura delle dimensioni
idrodinamiche della molecola, della sua forma,
delle dimensioni del mezzo in cui avviene
l’elettroforesi e della viscosita’ del tampone;
quindi si ha:
Ffriz.= ƒ
Dove
e’ la velocita’ di migrazione dello ione ed ƒ
e’ il suo coefficiente frizionale.
In un campo elettrico costante le forze sullo ione
si bilanciano, quindi si ha:
qE = ƒ
ogni ione, dunque, si muove con una velocita’
costante caratteristica. Generalmente, viene
utilizzato il termine mobilita’ elettroforetica
( ), che rappresenta il rapporto tra la velocita’
dello ione e l’intensita’ del campo elettrico:
=
/E =q/f
SCHEMA DI UN APPARATO PER
ELETTROFORESI ZONALE
• Per prevenire fenomeni quali
il rimescolamento delle
molecole che stanno
migrando, fenomeni che
avvengono nell’ elettroforesi
in soluzione libera,
nell’ elettroforesi zonale e’
stato introdotto l’ausilio di un
supporto solido, inerte ed
omogeneo.
ELETTROFORESI SU GEL
Ha ampiamente sostitito i sistemi su carta e su
strato sottile per la separazione di proteine ed
acidi nucleici.
Vantaggi: offre un maggiore potere risolutivo.
Diversi tipi di gel: i gel d’AMIDO si preparano
scaldando e poi raffreddando una sospensione di
amido ed hanno una composizione variabile dall’1%
al 15%. Le catene ramificate dell’amilopectina si
intrecciano tra loro, formando un gel semirigido.
Gel di AGAR: miscela di due polimeri derivati
dal galattosio: l’agarosio e l’agaropectina. Ottimo
per immunoelettroforesi, questo tipo di gel e’
largamente usato per la separazione di acidi
nucleici e di frammenti di DNA di restrizione,
grazie all’assenza di elettro-osmosi e di
filtrazione molecolare.
Infine, la miglior risoluzione per quanto riguarda
la separazione di proteine si ottiene con i gel di
POLIACRILAMMIDE.
Questi ultimi possiedono una trascurabile
tendenza all’adsorbimento, l’assenza di elettroosmosi e la facilita’ di analisi quantitativa
dei risultati.
ANALISI DEL GEL
Al termine dell’elettroforesi su gel di
poliacrilammide (PAGE) il gel viene
analizzato mediante una delle seguenti
procedure:
colorazione,autoradiografia od analisi
densitometrica.
La procedura piu’ comune e’ la colorazione;
le proteine vengono generalmente
evidenziate mediante colorazione con
blue di Coomassie (sensibile fino ad 1 g di
proteina), o con nitrato d’argento (sensibile
fino a 10 ng di proteina).
Una volta colorato, il gel puo’ essere
fotografato e, mediante analisi
densitometrica (misura della densita’
ottica di ogni banda), si può stabilire
quantitativamente l’intensita’ di ogni
singola banda.
Gli acidi nucleici, invece, vengono
generalmente evidenziati mediante
colorazione con bromuro di etidio, un
intercalante fluorescente che diventa
arancione quando legato agli acidi
nucleici ed eccitato mediante luce UV
(sensibilita’ 10-15 ng di DNA).
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE
IN PRESENZA DI SDS
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide e’ uno dei metodi piu’
utilizzati per separare le diverse proteine di una miscela e
determinarne il peso molecolare.
Il dodecilsolfato di sodio (SDS) e’ un detergente anionico,
che si lega saldamente alle proteine provocandone la
denaturazione e fornendo loro una quantita’ di carica negativa
costante per unita’ di massa. Pertanto, durante l’elettroforesi
i complessi proteina –SDS si muoveranno tutti verso l’anodo.
La loro mobilita’ risultera’ inversamente proporzionale al loro
peso molecolare e risentira’ solo delle proprieta’ di setaccio
molecolare del gel.
Mediante SDS-PAGE e’ possibile determinare la
massa molecolare relativa (Mr) di una proteina,
confrontando la sua mobilita’ relativa (Rf) con
quella di una serie di proteine standard di Mr
nota, separate sullo stesso gel.
Rf = ds/do
ds = distanza percorsa dal campione
do =distanza percorsa dal blu di bromofenolo
La mobilita’ elettroforetica relativa delle proteine varia in
modo lineare con il logaritmo decimale (log) della loro Mr,
quindi riportando in grafico Rf in funzione del log della Mr
di ogni proteina standard, si ottiene una retta di taratura
dalla quale si puo’ risalire alla Mr della proteina incognita.
STANDARD PROTEICI
IMPIEGATI
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
L’isoelettrofocalizzazione (IEF) consiste nello studio della
mobilita’ elettroforetica delle proteine in funzione del pH.
Le proteine sono molecole anfotere, cioe’ contengono sia
residui acidi che basici. Il loro grado di ionizzazione dipende
dal pH del mezzo e dai valori dei pK di ciascun gruppo
amminoacidico ionizzabile. L’elettroforesi avviene su un
gradiente continuo e stabilizzato di pH (dall’anodo al catodo)
e, pertanto, ogni proteina tendera’ a migrare sino a
raggiungere la regione di pH corrispondente al proprio punto
isoelettrico (pI).
SCHEMA DELL’IEF
IEF SU GEL
WESTERN BLOTTING
Come detto, la tecnica PAGE effettua il
frazionamento di una miscela di proteine
durante il processo di elettroforesi.
E’ possibile sfruttare questo frazionamento,
per esaminare ulteriormente le singole
proteine. Il primo passaggio consiste nel
trasferimento delle proteine separate dal gel
su un foglio di nitrocellulosa
(protein blotting).
Il trasferimento delle proteine puo’
essere eseguito attraverso due diverse
modalita’:
• Capillary blotting
• Electroblotting
Capillary blotting
Il gel viene posto su strati di carta da filtro
bagnati, imbevuti nel tampone, mentre un foglio
di nitrocellulosa viene posto sopra il gel;
viene fatto passare del tampone attraverso il
gel, posizionando un altro blocco di materiale
assorbente asciutto ed applicando un peso
considerevole sul foglio di nitrocellulosa.
Il passaggio del tampone attraverso il gel,
per azione capillare, trasporta le proteine
separate dal gel al foglio di nitrocellulosa.
Electroblotting
Un sandwich di gel e nitrocellulosa viene compresso
tra due fogli di plastica rigidi ed immerso in un
tampone tra due elettrodi paralleli;
viene fatta passare corrente elettrica in direzione
perpendicolare al gel, provocando l’elettroforesi delle
proteine separate. Queste escono dal gel ed entrano
nel foglio di nitrocellulosa.
Una volta trasferite sulla nitrocellulosa,
le proteine separate possono essere
sottoposte ad ulteriore esame, cioe’
all’analisi del blot, che richiede
solitamente l’impiego di un anticorpo
specifico per una certa proteina.
Tipi di marcatori frequentemente
coniugati con l’anticorpo secondario
• Enzimi: in presenza dello specifico substrato
l’enzima converte quest’ultimo in prodotto colorato
insolubile, che precipita sulla nitrocellulosa; gli
enzimi solitamente impiegati sono la fosfatasi
alcalina e la perossidasi di rafano.
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•
I: il legame dell’anticorpo al blot viene misurato
quantitativamente mediante autoradiografia.
• Fluorofori: marcatori fluorescenti come la
fluoresceina isotiocianato.
• Proteina A marcata con
I : tale proteina viene
impiegata al posto dell’anticorpo secondario, in quanto
lega la porzione Fc di quello primario; il legame viene
rivelato mediante autoradiografia.
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• Particelle di oro: sono visualizzate direttamente, in
quanto danno una colorazione rossa quando si legano ad
un anticorpo primario sul blot.
• Anticorpi secondari biotinilati: la biotina e’ una
vitamina che si lega fortemente all’avidina; il blot viene
prima incubato con un anticorpo secondario biotinilato,
poi con avidina coniugata ad un enzima (fosfatasi
alcalina o perossidasi di rafano), che genera un
prodotto colorato insolubile.