DOTTORANDO: Ranchio Alessandro
SUPERVISORE PROPOSTO: Prof. Battistutta Roberto
TITOLO DEL PROGETTO DI RICERCA:
Studi strutturali della protein chinasi CK2: meccanismi di inibizione e relazioni struttura-attività
La protein chinasi CK2, casein kinase 2, è una serina/treonina chinasi acidofila ed è una delle
proteine più conservate nel mondo eucariote. I substrati fisiologici finora annotati (circa 300) sono
costituiti da enzimi e proteine non catalitiche che sono coinvolte in numerose funzioni cellulari.
L'implicazione di CK2 in numerosi processi cellulari, tra i quali la proliferazione cellulare e
l'apoptosi, fa sì che possa essere considerata un target farmacologico ideale per la terapia anticancro. Dal punto di vista strutturale CK2 si presenta sotto forma di tetramero composto da due
subunità catalitiche α e due subunità regolatorie β. Nell'uomo sono state isolate solo due isoforme
catalitiche (α e α') e una sola subunità regolatoria β. Una eccezione a questa struttura quaternaria è
stata trovata nelle specie vegetali Zea mays e Dictyostelium, dove non è presente la subunità β,
nonostante sia appurata l'esistenza della subunità catalitica α, che mostra tutte le sue proprietà
catalitiche. Le due subunità CK2α e CK2α' presentano una attività catalitica molto simile. CK2α
consiste di 391 residui per una massa molecolare di 45,114 kDa mentre CK2α', 350 residui per una
massa molecolare di 41,213 kDa. La differenza di lunghezza riguarda esclusivamente la parte Cterminale la quale sembra avere un ruolo biochimico specifico: proprio su questa coda al Cterminale, CK2α, viene fosforilata in maniera dipendente dalle fasi del ciclo cellulare, suggerendo
che le due subunità catalitiche siano regolate in maniera diversa durante il ciclo cellulare. Studi sui
substrati fosforilati da CK2, hanno portato alla identificazione del consensus minimo riconosciuto
dalla proteina: Ser/Thr-X-X-Asp/Glu dove X è un amminoacido qualsiasi non basico.
Il meccanismo di regolazione della maggior parte delle chinasi include solitamente interazioni con
subunità o domini proteici ed eventi di fosforilazione e defosforilazione. In CK2 nessuna di queste
interazioni è stata individuata e per questo il meccanismo di regolazione di CK2 non è ancora noto;
inoltre la subunità catalitica è intrinsecamente attiva anche in assenza della subunità regolatoria e
una volta formato il complesso tetramerico la sua attività viene sia aumentata che diminuita a
seconda del substrato preso in esame.
L'analisi cristallografica della protein chinasi CK2 si è focalizzata negli anni su 3 entità principali:
la subunità catalitica CK2α, la subunità regolatoria CK2β e il complesso tetramerico CK2
oloenzima. La maggior parte delle strutture depositate nel Protein Data Bank riguardano la subunità
catalitica CK2α della specie Homo Sapiens e Zea Mays, mentre è presente una sola struttura a bassa
risoluzione del complesso tetramerico di CK2.
CK2α è una delle chinasi con il più alto numero di strutture note in complesso con inibitori
competenti dell'ATP. Inizialmente per gli studi strutturali di inibizione si lavorava con la CK2 di
mais, di cui si riusciva con facilità ad ottenere cristalli che diffrangevano ad una buona risoluzione.
Ora sono presenti strutture di inibitori in complesso con CK2α umana, in una forma deleta di 55
amminoacidi al C-terminale (CK2αΔ). Le principali classi di questi inibitori competitivi ATP di cui è
nota la struttura in complesso con CK2αΔ sono gli antrachinoni, indolo-chinazoline, derivati del
tetrabromobenzimidazolo/triazolo e le pirazolo-triazine.
Vengono di seguito indicate le tematiche di ricerca principali che si intendono perseguire durante il
dottorato, che costituiscono lo sviluppo e l'approfondimento delle tematiche affrontate durante
l'internato di tesi della Laurea Magistrale.
Durante il periodo del dottorato intendo occuparmi della cristallizzazione di CK2αΔ umana in
complesso con inibitori competitivi per l'ATP, tra i quali ad esempio un nuovo inibitore specifico
(CX-4945 fornito da CylenePharma) già entrato nella fase 2 del trial clinico come farmaco per la
cura di tumori solidi in fase avanzata. Una volta ottenuto il cristallo si procederà con la risoluzione
dell'inedita struttura tridimensionale del complesso chinasi-inibitore.
Un altro settore interessante è lo sviluppo di inibitori non competitivi dell'ATP; in particolare alcuni
recenti sviluppi hanno dimostrato come un peptide derivante dal complesso proteico transmembrana
della fibrosi cistica (CFTR), corrispondente alla sequenza 500-518 del dominio NDB1, sia in grado
di inibire la proteina CK2 in maniera ATP-non competitive. Questo peptide include la delezione
della fenilanina 508 che causa la degradazione prematura della proteina nelle cellule e la
conseguente malattia. Questo studio si presenta molto interessante anche dal punto di vista
evolutivo, poiché potrebbe giustificare la permanenza della mutazione (ΔF508) nel genoma umano
come un meccanismo di difesa da parte delle cellule contro infezioni virali che "sfruttano" il
potenziale fosforilativo di CK2 per espandersi nell'organismo.
Parallelamente all'analisi strutturale di inibizione, il progetto di dottorato prevede una serie di studi
strutturali atti a chiarire i meccanismi di regolazione della proteina CK2. Di particolare interesse è
l'ottenimento della prima struttura della CK2α umana non deleta della coda C-terminale, la quale è
probabilmente coinvolta nei processi regolativi dell'attività proteica. Alcune fonti descrivono la
coda C-terminale disordinata e facilmente soggetta a degradazione; nell'eventualità di incontrare
difficoltà nella cristallizzazione, si procederà con la realizzazione di mutanti in cui i 4 siti di
fosforilazione al C-terminale (costituiti da serine e treonine), saranno mutati ad acidi glutammici per
stabilizzare la coda.
Il progetto si focalizzerà inoltre sull'analisi della forma tetramerica di CK2 con il fine di ottenere
nuove informazioni sulla regolazione della proteina. Per ottenere informazioni strutturali di CK2
oloenzima ci si concentrerà sulla espressione, purificazione e cristallizzazione di complessi
tetramerici con CK2α intera (al contrario della struttura pubblicata) e con CK2α mutata nei 4 siti di
fosforilazione. Ottenere questi dati potrebbe aprire nuovi orizzonti per quanto riguarda le
conoscenze sulla regolazione funzionale della proteina anche in prospettiva di progettare nuovi
inibitori sempre più specifici per CK2.
I dati strutturali saranno strettamente correlati con dati funzionali e di drug-design in collaborazione
con altri gruppi di ricerca dell'Università di Padova, con cui sono in atto fruttuose collaborazioni
scientifiche da lungo tempo.
