C-terminal domain - Structural Biology

DNA topology Le DNA Topoisomerasi Modificano la topologia del DNA tagliando e risaldando i filamen8 del DNA ossia cambiando il numero di legame. Esistono due classi di DNA Topoisomerasi: Le DNA Topoisomerasi di 8po I: tagliano e saldano solo uno dei due filamen8 del DNA e cambiano il numero di legame di un’unità alla volta. Le DNA Topoisomerasi di 8po II: tagliano e saldano entrambi i filamen8 e cambiano il numero di legame di due unità alla volta. Inoltre: IA-­‐IIA: Quando la proteina si lega al 5’ del DNA tagliato. IB-­‐IIB: Quando la proteina si lega al 3’ del DNA tagliato. 1. Reazione di transesterificazione, dove l’idrossile della tirosina del sito
attivo compie un attacco nucleofilo sul legame fosfodiesterico del DNA.
2. Il passaggio del filamento
intatto intorno al filamento tagliato
con il cambiamento del numero di
legame del DNA.
3. Una seconda reazione di
transesterificazione condotta
dall’idrossile libero del filamento
tagliato ripristina la condizione
iniziale in cui viene saldato il
filamento tagliato e l’enzima viene
rilasciato.
Distribution of DNA topoisomerases
Family
Members
Organism
Structure
Topo IA
Topo I (ω-like protein)
Topo III
Reverse gyrase
Bacteria
Bacteria, Archaea, Eucarya
Bacteria, Archaea
Yes
Yes
Yes
Topo IB
Topo IB
Viruses, Bacteria, Eucarya
Yes
Topo IIA
Gyrase
Topo IV
Topo II
Bacteria, Archaea
Bacteria
Viruses, Eucarya
Yes
Yes
Yes
Topo IIB
Topo VI
Archaea, Bacteria, Eucarya
Yes
Le DNA topoisomerasi IA
1. Sono tutte monomeriche
2. L’enzima si lega sempre al 5’ del DNA tagliato
3. Richiedono tutte il magnesio per rilassare il DNA
4. Preferiscono un substrato superavvolto negativamente
5. Il rilassamento non va mai a completamento
6. Si legano ad un DNA a singolo filamento
7. Il linking number viene cambiato a step di uno
8. Sono capaci di legare o dividere due singoli filamenti circolari o legare
e dividere due duplex circolari a patto che un filamento sia niccato.
9. Si trovano in batteri, archeobatteri e eucarioti.
10. Le più note sono la proteina omega di E. coli, la Topo III e la reverse
girasi.
DNA Topoisomerasi IA Analisi di sequenza indicano che tuJe le topo IA sono composte da una parte centrale in cui sono presen8 gli aminoacidi responsabili della reazione di trans-­‐esterificazione e una porzione carbossi-­‐terminale altamente variabile in lunghezza e sequenza. I domini II, III, IV formano una cavità dove sono presen8 aminoacidi carichi posi8vamente che interagiscono con il DNA. Questa cavità può accogliere sia un DNA a singolo filamento che un DNA a doppio filamento. Dominio I è molto conservato tra tuJe le topoisomerasi di classe IA e presenta un cluster di 3 aminoacidi responsabile del legame del Mg, un ca8one fondamentale perché avvenga il rilassamento del DNA. Durante la reazione di transesterificazione il 5’ del DNA tagliato è legato covalentemente alla 8rosina presente nel dominio III ed il 3’ è tenuto saldo da interazioni non covalen8 dal dominio IV. Meccanismo d’azione della Topoisomerasi I di E.coli DNA topoisomerasi IB Sono presenti negli eucarioti, nei virus e nei batteri ma non negli archeobatteri
1. 
2. 
3. 
4. 
Si legano al 3’ del DNA tagliato
Possono rilassare sia DNA superavvolti negativi che positivi.
Rilassamento va a completamento
Il rilassamento del DNA non richiede ioni magnesio.
Quelle più conosciute sono: 1.  La DNA topoisomerasi I umana. 2. La Dna topoisomerasi I di vaccinia virus. La Dna topoisomerasi I umana.
  E’ composta da 765 residui, ha un peso molecolare di 91 kDa ed è monomerica   E’ suddivisibile in 4 domini dis8n8:  Esiste una forma nucleare ed una forma mitocondriale.   Il sito aYvo è composto da 4 residui presen8 nel dominio core, Arg488, Lys532, Arg590 e His632 e da una 8rosina catali8ca presente nel dominio C-­‐terminale, Tyr723.   Riconosce sia DNA superavvolto nega8vamente che posi8vamente.   Il legame al DNA non è sito specifico. Topoisomerase IB acts by resolving topological over wounding of the DNA through the cleavage
of one strand of the DNA.
Human Topoisomerase IB
  The protein is a monomer of 765 aa and
91 kDa.
 Divided in 4 domains:
- N-terminal domain (Met1-Lys214)
-core domain (Ile215-Ala635)
-linker domain (Pro636-Lys712) -C-terminal domain (Gln713-Phe765)
 There are two isoforms, nuclear and
mitochondrial.
  The active site is composed of four
residues of the core domain, Arg488,
Lys532, Arg590 e His632 and the catalytic
Tyr723 in the C-terminal domain.   Recognize both positive and negative
supercoils.
  The binding on the DNA is a-specific.
•  Core Subdomain I (215-232,320-433)
•  Core Subdomain II
(233-319)
•  Core Subdomain III
(434-635)
•  Linker domain
(636-712)
•  C-terminal domain
(713-765)
L. Stewart, M.R. Redinbo, X. Qiu, W.G.J. Hol, J.J. Champoux.
A Model for the Mechanism of Human Topoisomerase I. Science 279:1534-1541, 1998.
The protein has a bilobed shape and completly clamps around the DNA establishing contacts with
strands backbone. “Meccanismo di catalisi della Topoisomerasi IB umana”
Il rilassamento del DNA catalizzato dalla topoisomerasi I umana viene arbitrariamente suddiviso in cinque passaggi (Stewart et al., 1998): 1. legame non covalente al DNA 2. taglio e legame covalente dell’enzima all’estremità 3’ del filamento tagliato 3.  rotazione del filamento intero aJraverso il filamento tagliato – rotazione controllata 5.  risaldatura del DNA 5. rilascio dell’enzima The reaction is carried out by the
catalytic Tyr723, helped by four positive
residues: Arg488, Lys 532, Arg590 and
His632.
Human Topoisomerase IB is the unique target of the antitumor drug
camptothecin The anticancer drug camptothecin (CPT)
specifically binds to the covalent human
topoisomerase I–DNA complex stabilizing
it and then inducing cell death.
Derivatives in clinical use
Derivatives in clinical trials
the drug intercalates between the DNA base pairs interacting both with protein and the DNA.
Staker et al., 2005
The binding of the drug to the covalent complex is reversible, but it causes the collision with the
replication fork, so inducing an irreversible effect. The inhibition is S-phase specific.
Schneider, Hsiang & Liu, 1990
Cleavage/Religation equilibrium in absence and
presence of CPT using a 900 bp dsDNA as a
substrate.
Keq = kcl/kr
CPT RESISTANT MUTANTS THE CPT RESISTANT MUTANT A653P
A653P
A653P is a CPT-resistant mutant that retains catalytically activity .
The cleavage-religation equilibrium of the A653P mutant in presence of CPT is
similar to that of the wild type enzyme in absence of CPT.
Keq = kcl/kr
Religation Kinetics
The mutant A653P displays an increased religation rate
wild type
mutant
with CPT
with CPT
The mutation is far from
the active site
Linker domain
Wild type Mutant
Topo70 wild-­‐type A653P Mutant Fiorani et al., J. Biol. Chem.,2003, 278,43268