Topologia del DNA e topoisomerasi - e

La Topologia
La topologia è quella branca della matematica che studia le proprietà
delle strutture che non si modificano quando sono sottoposte a
deformazione.
Ι - SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA
La struttura circolare dei cromosomi procariotici e l'organizzazione in domini
del
DNA
eucariotico,
data
dall'ancoraggio
della
fibra
all'impalcatura
cromosomica o alla matrice nucleare, rendono il DNA in vivo, generalmente,
una molecola chiusa e priva di estremità libere.
Da questo, o meglio dall'impossibile libera rotazione delle estremità che ne
deriva, nasce la possibilità della formazione di superavvolgimenti. Si ha un
superavvolgimento ogni volta che la doppia elica ruotando nello spazio si
avvolge intorno al proprio asse.
Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso
opposto a quello di avvolgimento del DNA, come nel caso del DNA A e B;
positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del
duplex (figura 1).
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Fig.1
Nel caso di superavvolgimenti negativi il DNA si dice sottospiralizzato, mentre
è superspiralizzato quando il DNA è avvolto in superavvolgimenti positivi.
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Le proprietà topologiche della molecola sono quelle proprietà geometriche che
non variano in seguito a deformazione del DNA.
La topologia e il grado di superavvolgimento sono descritti mediante
l'equazione Lk = Tw + Wr (Fuller, 1978), dove Lk rappresenta il numero di
legame che è il numero totale di volte con cui un filamento si incrocia su un
altro in una molecola chiusa di DNA. Per convenzione il numero di legame
viene considerato positivo per ogni incrocio dei filamenti nella doppia elica
destrorsa; il suo valore è inoltre espresso da un numero intero (Bauer et al .,
1980).
Il numero di legame è composto da Tw (twist number) che è il numero di
avvolgimento ovvero il numero totale di giri d'elica del duplex (Tw = n / A, dove
n è il numero di nucleotidi delle molecole ed A il numero di nucleotidi per giro
d’elica), e da Wr (writhing number) o numero di superavvolgimento, che
esprime i ripiegamenti dell’asse su sé stesso.
Per una molecola rilassata il numero di legame corrisponde al numero di
avvolgimento (Lk = Tw).
Mediante il numero di legame o, meglio, la differenza del numero di legame
(∆Lk = ∆Wr + ∆Tw) è possibile descrivere i cambiamenti topologici del DNA. Il
numero di legame è proprietà intrinseca del duplex e non può cambiare a
meno che si verifichino rotture dei filamenti.
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Le interconversioni fra i vari topoisomeri, mediante reazioni di taglio,
svolgimento o avvolgimento della molecola e ricongiunzione delle estremità
tagliate, avvengono ad opera delle DNA topoisomerasi.
Molecole di DNA identiche a meno del numero di legame vengono dette
isomeri topologici o topoisomeri e sperimentalmente possono essere separate
ricorrendo a tecniche di elettroforesi: una molecola di DNA rilassata, infatti,
migra più lentamente della sua corrispondente superavvolta, a causa
del diverso comportamento idrodinamico.
CONSEGUENZE DEL SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA:
La molecola superavvolta è ad un livello energetico superiore rispetto a quella
rilassata, ed il superavvolgimento è considerabile come una riserva di energia.
Processi quali replicazione, trascrizione e ricombinazione, richiedono uno
svolgimento locale del DNA; qualsiasi forza torsionale che agevola lo
svolgimento faciliterà la realizzazione di questi processi.
L’energia in eccesso, posseduta dal DNA superavvolto negativamente, può
essere utilizzata per fornire l’energia necessaria a separare la molecola nei
due filamenti che la compongono o, almeno, per dare l’avvio a tale processo.
In altri termini, il superavvolgimento negativo, avendo verso opposto rispetto
all’avvolgimento del DNA destrorso, causa una diminuzione delle costrizioni
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topologiche permettendo al DNA di subire transizioni strutturali che non
potrebbe compiere se fosse rilassato.
Il grado medio di superavvolgimento, stimato intorno ad uno ogni 200 paia di
basi, fluttua lungo il genoma
(Sinden, 1980).
Una misura del grado di superavvolgimento è rappresentata dalla densità di
superelica σ = ∆ LK / Lk °, proporzionale alla variazione del numero di legame
rispetto a molecole rilassate, infatti Lk ° è il valore del numero di legame di u na
molecola di DNA rilassata.
In presenza di forti variazioni della densità di superelica è possibile prevedere
che localmente lungo il DNA si possano generare strutture diverse da quelle
del DNA B che richiedono una elevata energia di attivazione per formarsi. La
formazione di tali strutture è nella maggior parte dei casi associata a valori di
densità di superelica negativi ed avvengono a scapito della riduzione del
superavvolgimento globale del resto della molecola. I principali tipi di strutture
alternative osservate sono rappresentate dal DNA Z (Wang et al., 1979),
strutture a tripla elica, strutture a quadrupla elica (Zakian, 1989), strutture
cruciformi (Pearson et al., 1998), strutture di scivolamento (Sinden, 1984).
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LE DNA TOPOISOMERASI
Processi vitali quali la replicazione, la trascrizione, la ricombinazione,
l'associazione del duplex con gli istoni e con altre proteine portano il DNA a
superavvolgersi.
Se da un lato un eccesso di superavvolgimento è deleterio per la cellula
entro certi limiti esso favorisce lo svolgersi di alcuni processi, come l'inizio
della trascrizione a partire dai promotori batterici.
Le DNA
topoisomerasi svolgono il ruolo fondamentale di controllo fine dello
stato topologico del DNA consentendone il mantenimento della funzionalità,
questo compensa l‘impossibilità della libera rotazione della doppia elica nello
spazio ristretto della cellula e la sua organizzazione ad anse (Wang, 2002).
Le DNA topoisomerasi
si distinguono, sulla base del meccanismo catalitico,
in due classi: le DNA topoisomerasi I modificano la topologia del DNA
permettendo il passaggio di un filamento integro attraverso una momentanea
rottura generata sull'elica complementare (Champoux, 1977), variando il
numero di legame per multipli di uno; le DNA topoisomerasi II agiscono
consentendo il passaggio di un duplex intatto attraverso una momentanea
rottura a doppia elica generata su un altro duplex.
Le DNA topoisomerasi sono in grado di rilassare i superavvolgimenti positivi
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(DNA topoisomerasi I e II), negativi (DNA topoisomerasi I e II), introdurre
superavvolgimenti negativi (DNA girasi batterica) o positivi (DNA girasi
inversa).
Il trasferimento del
legame dall'acido nucleico alla proteina spiega come
l'enzima possa funzionare senza l'apporto di energia: i legami sono infatti
idrolizzati in maniera reversibile e la loro energia è conservata attraverso
reazioni di trasferimento (figura 2).
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Fig.2
L‘idrolisi di ATP è invece richiesta per promuovere catenazione e
decatenazione tra
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diverse molecole di DNA; l'energia fornita può essere
sfruttata, infatti, per introdurre nell'enzima cambiamenti conformazionali tali da
consentire il passaggio del duplex integro in quello in cui è presente la rottura
a doppio filamento.
I temi comuni a tutte le DNA topoisomerasi includono la struttura a pinza
(clamp) che si apre e chiude legando e tagliando il DNA, la presenza di una
cavità di legame per il temporaneo immagazzinamento del duplex e il
cambiamento conformazionale della proteina che consente la rotazione del
DNA (Champoux, 2001).
Questi enzimi hanno il ruolo di rilassare i superavvolgimenti prodotti durante la
trascrizione, ad opera della RNA polimerasi, e durante la replicazione, agendo
nelle fasi di inizio, allungamento, terminazione e segregazione dei cromosomi
replicati. Inoltre svolgono anche una funzione di primo piano nel processo di
condensazione dei cromosomi, costituendo, per altro, componenti rilevanti
dell'impalcatura dei cromosomi metafasici e della matrice nucleare.
Ceppi di lievito
mancanti di entrambe le DNA topoisomerasi (le DNA
topoisomerasi II presenti sono in forma termosensibile) presentano, poi, un
deciso incremento del tasso di ricombinazione. Si ritiene che questo sia
dovuto, direttamente, alla presenza di substrati ricombinogenici, come i
superavvolgimenti non risolti dagli enzimi, o, indirettamente, ad un'alterazione
nel movimento della forca di replicazione.
L'interesse rivolto alle DNA
topoisomerasi negli ultimi anni deriva non solo
dal loro ruolo cruciale nel mantenimento dello stato topologico, ma anche dal
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fatto che queste rappresentano il bersaglio cruciale di droghe che tramite
l’intrappolamento dell’enzima in un complesso covalente col DNA provocano
lesioni citotossiche.
La possibilità di sfruttare per fini terapeutici queste caratteristiche ha indotto lo
sviluppo di molti farmaci con questo meccanismo d’azione (Pommier et al .,
1998).
ΙΙ - 1 LE DNA TOPOISOMERASI DI TIPO I :
Le DNA topoisomerasi di tipo I sono in grado di modificare il numero di legame
di una molecola di DNA mediante un taglio della doppia elica agendo sul
singolo filamento, provocando ad ogni ciclo la variazione del numero di legame
di una unità; la reazione non richiede energia.
La DNA topoisomerasi I batterica è in grado di svolgere la sua funzione solo
su molecole di DNA superavvolte negativamente (Wang, 1971), mentre quella
eucariotica rimuove sia superavvolgimenti negativi che positivi.
Il gene che codifica per la DNA topoisomerasi I eucariotica non è essenziale
in lievito (Yanagida e Sternglanz, 1985) ma lo è nel moscerino della frutta (Lee
et al ., 1993) e nel topo (Morham et al ., 1996), dimostrando che in organismi
pluricellulari la DNA topoisomerasi II non può efficacemente sostituire la DNA
topoisomerasi I.
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DNA topoisomerasi di tipo I A
: le DNA topoisomerasi appartenenti a questa
famiglia presentano caratteri comuni: sono tutti enzimi monomerici a meno
delle girasi inverse di Methanopyrus kandleri
(Krah et al .,1996); il taglio su
singolo filamento è accompagnato dalla formazione di un legame covalente tra
il sito attivo della tirosina e il 5' fosfato del filamento interrotto; tutte richiedono
per svolgere l’attività di rilassamento del DNA la presenza di ioni Mg++; DNA
circolari
contenenti
superavvolgimento
negativo,
rappresentano il substrato di questa sottofamiglia di
ma
non
positivo,
DNA topoisomerasi che
rilassano solo il DNA superavvolto negativamente e da regioni a singolo
filamento (Kim e Wang, 1992; Wang, 1996); l’attività catalitica provoca il
rilassamento attraverso la variazione del numero di legame di una unità.
L'enzima dopo aver
prodotto il taglio sul singolo filamento, rimane legato
all'estremità 5' fosfato mediante un legame covalente fosfotirosinico; resta
comunque anche in contatto con l'altra estremità del filamento tagliato;
successivamente l’enzima subisce una modifica conformazionale tale da
consentire il passaggio del filamento integro attraverso la momentanea
interruzione prodotta sull'altro filamento. L'ultimo passaggio della reazione
consiste in una nuova reazione di transesterificazione che consente di
risaldare le due estremità del filamento tagliato (Wang et al ., 1996).
Esempi di DNA topoisomerasi I A sono rappresentati da quella di Escherichia
coli , storicamente la prima DNA topoisomerasi isolata (Wang, 1971) ed in
grado di catalizzare le seguenti reazioni:
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Ι-
il parziale rilassamento di DNA superavvolti negativamente, parziale
perchè l'attività dell'enzima decresce quando il DNA tende allo stato rilassato
(Kirkeegard e Wang, 1985);
ΙΙ- la formazione e lo scioglimento di un nodo in anelli di DNA a singolo
filamento (Liu et al ., 1976)
ΙΙΙ- l'unione di due cerchi complementari a singolo filamento per formare un
DNA circolare a doppia elica (Champoux et al ., 1977; Kirkeegard e Wang,
1978);
ΙV- la catenazione di molecole di DNA circolari a doppia elica quando una
delle due molecole in gioco presenta dei tagli o è interrotta (Tse et al ., 1980;
Brown et al ., 1981);
V- il rilassamento di DNA superavvolti positivamente solo se contengono una
regione a singolo filamento (Kirkeegard e Wang, 1985).
Mediante cristallografia a raggi X
(Lima et al ., 1994) e risonanza magnetica
nucleare è stato possibile delineare la struttura di questa proteina.
Il polipeptide si ripiega in quattro domini a formare una struttura toroidale la cui
plasticità conferisce la capacità di legare e rilassare il DNA. Una cavità
centrale caratterizza , dunque, la DNA topoisomerasi I A di Escherichia coli ,
sufficientemente grande da accogliere il DNA (figura 3A).
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Il meccanismo catalitico proposto (Brawn e Cozzarelli, 1981; Champoux,
1990)
per questa DNA topoisomerasi I prevede la formazione di almeno
quattro differenti legami tra DNA ed enzima (figura 3B).
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Fig.3
Nella prima fase la DNA topoisomerasi I A si lega al DNA attraverso i due
domini che delimitano la cavità centrale. Nella seconda fase il dominio ΙΙΙ, che
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contiene la tirosina catalitica, è in grado di tagliare il singolo filamento di DNA;
la tirosina catalitica si lega all'estremità 5' del filamento tagliato mentre
l'estremità 3' rimane legata non covalentemente all'altra parte del ponte
proteico. Dopo l'entrata nella cavità del secondo filamento di DNA, attraverso il
filamento entrato
precedentemente, si ha, nella terza fase, l'intrappolamento
di questo per consentire la reazione di richiusura. La quarta ed ultima fase
consiste nell'apertura della proteina e nella fuoriuscita del DNA.
Alle DNA topoisomerasi di classe I A appartengono anche la DNA
topoisomerasi III di E. coli, che differisce dalla DNA topoisomerasi I nell'attività
catalitica incentrata soprattutto nella decatenazione di molecole di DNA a
singolo filamento, la DNA topoisomerasi III di S. cerevisiae, le DNA
topoisomerasi IIIα e IIIβ di mammifero e la DNA topoisomerasi I A isolata in
archeobatteri.
DNA topoisomerasi di tipo I
B :
rilassano il DNA superavvolto sia
negativamente che positivamente, senza l'apporto di energia dall'esterno. Il
substrato della reazione catalizzata da questa classe di
enzimi è
rappresentato dal DNA a doppio filamento; l'enzima produce un taglio solo sul
singolo filamento (nick) formando un intermedio covalente DNA - enzima
rispettivamente tra l'estremità 3' fosfato e il residuo della tirosina catalitica.
Il fatto che questa classe di enzimi possa rilassare sia il DNA avvolto
negativamente che positivamente e che durante la reazione di taglio l'enzima
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rimanga legato covalentemente all'estremità 3' fosfato del filamento, fa
supporre
per questa famiglia di enzimi l'esistenza di un meccanismo “a
perno” per il passaggio del filamento integro attraverso quello tagliato. In
questo modello l'estremità 5' del filamento tagliato viene lasciata libera dal sito
catalitico dell'enzima: in questo modo si ottiene la libera rotazione della doppia
elica intorno al legame fosfodiesterico del filamento integro.
Le DNA topoisomerasi I B sono proteine monomeriche le cui dimensioni
oscillano tra gli 80 ed i 135 Kda.
Vi appartengono la DNA topoisomerasi I umana e quella di Vaccinia Virus la
cui presenza è indispensabile affinché il virus possa intraprendere il suo ciclo
replicativo e che presenta alta omologia di sequenza amminoacidica con
quella umana e proprietà enzimatiche molto simili.
Altro membro della sottofamiglia è la DNA topoisomerasi V isolata da
archeobatteri ipertermofili, che ha attività catalitica simile a quella della DNA
topoisomerasi I eucariotica e di Vaccinia ma scarsa omologia di sequenza con
queste.
ΙΙ - 3
LE DNA TOPOISOMERASI DI TIPO II :
Le DNA topoisomerasi II
divisibili sulla base di considerazioni strutturali
nelle sottofamiglie A e B, rilassano sia superavvolgimeti positivi che negativi; la
reazione è mediata da una rottura a doppio filamento in uno dei duplex e dal
passaggio attraverso di essa di un altra regione duplex.
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Ad ogni ciclo la variazione del numero di legame è di due unità.
Le DNA topoisomerasi II sono enzimi dimerici, costituiti negli eucarioti da due
monomeri identici; durante la reazione, in seguito al legame dell'enzima al suo
substrato, due tirosine danno luogo ad un attacco nucleofilo sui due filamenti
di una molecola di DNA e le due tirosine rimangono legate covalentemente
alle due estremità 5' fosfato.
Quindi, grazie all'idrolisi dell'ATP che induce nell'enzima cambiamenti
conformazionali, il duplex integro viene accompagnato dall'enzima attraverso
la fessura introdotta.
La girasi batterica appartiene alla classe delle DNA topoisomerasi II; è capace
di introdurre, tramite il meccanismo dell'inversione di segno, superavvolgimenti
negativi mediante un'azione catalitica processiva.
In assenza di ATP l'enzima può risolvere superavvolgimenti negativi ma non
positivi. L'idrolisi di ATP, inoltre, non serve per lo svolgimento della reazione
ma piuttosto per un processo chiamato riciclo dell'enzima che consente l'avvio
di un nuovo ciclo catalitico.
ΙΙΙ -
INIBITORI DELLE
DNA TOPOISOMERASI :
Gli inibitori delle DNA topoisomerasi possono essere divisi in due classi:
veleni e soppressori.
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Benchè entrambi inibiscano l'attività catalitica delle DNA topoisomerasi, i
veleni sono in grado di portare alla morte cellulare mediante l'intrappolamento
del “cleavage
complex” costituito dal legame enzima / DNA, mentre i
soppressori agiscono impedendo il legame dell'enzima al DNA.
La sensibilità delle cellule ai veleni aumenta con un sovraespressione delle
DNA topoisomerasi, mentre la riduzione della loro espressione è la principale
causa di resistenza; un comportamento diametralmente opposto è quello che
riguarda i soppressori.
La scoperta della camptotecina come antitumorale risale a circa 30 anni fa
quando fu isolata dalla pianta Camptotheca acuminata, tuttavia è molto piu'
recente (Liu, 1989)
l'individuazione della DNA topoisomerasi I quale
bersaglio di questa. Esperimenti di delezione del gene per la DNA
topoisomerasi I in lievito e successiva complementazione con wild type, hanno
inoltre rivelato questo enzima come unico bersaglio del veleno, data la
completa resistenza conferita dalla sua assenza.
La camptotecina (CPT) è una molecola planare con struttura ad arco (Fig.4).
Esiste sotto due forme: come lattone, la forma attiva, e come sale di sodio.
Essa si converte a pH fisiologico nell'altra forma che è molto più solubile ma
quasi del tutto inattiva. La differenza nelle due strutture consiste nella
differente struttura dell'anello E che risulta chiuso nella forma lattonica e
aperto in quella solubile.
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Mutazioni del gene per la DNA topoisomerasi I che conferiscono resistenza
alla camptotecina hanno contribuito alla comprensione delle interazioni
veleno-enzima. E' così emersa la capacità della CPT di legare la regione
dell'enzima che contiene la tirosina catalitica. Questo legame consente alla
CPT di formare un complesso ternario DNA / DNA topoisomerasi
I / camptotecina (figura 4), in grado di inibire specificatamente la reazione di
risaldatura del DNA inducendo così l'accumulo di “cleavage complex“.
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Fig.4
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ΙΙΙ - 1 DNA TOPOISOMERASI,CAMPTOTECINA E CANCRO:
I successi clinici ottenuti nel trattamento di malattie tumorali con camptotecina
hanno suggerito nuove strategie per la terapia del cancro.
Un rinnovato interesse per la camptotecina, ha portato alla sintesi e allo
sviluppo di numerosi derivati idrosolubili con minori effetti di tossicità, come la
CPT-11, usato per il trattamento del cancro al colon, e il topotecano, per quello
del cancro ovarico.
L'effetto citotossico della CPT non è legato alla mera inibizione catalitica della
DNA topoisomerasi I, ma alla interferenza che questa, mediante il blocco del
“cleavage complex“ e la fomazione del complesso ternario, viene ad esercitare
sulle funzioni della topoisomerasi stessa.
Durante la replicazione la regione del duplex a valle della forca di replicazione
viene ad assumere un grado di superavvolgimento positivo tale da impedire
l'avanzamento delle forca stessa qualora sia assente l'intervento della DNA
topoisomerasi I. La camptotecina separa l'azione concertata della forca di
replicazione e della DNA topoisomerasi I; inducendo il blocco del “cleavage
complex“, provoca inoltre la collisione di questo con la forca, fenomeno che
porta alla formazione di rotture doppio filamento e a morte cellulare.
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