Citogenetica Molecolare

CORSO INTEGRATO DI GENETICA
E BIOLOGIA MOLECOLARE
GENETICA
A.A.2016/207
Prof Alberto Turco
[email protected]
12.10.16
Lez.9 e 10
CITOGENETICA e CITOGENOMICA
Candy Chromosomes……
Un po’ di storia………….
1956: IDENTIFICAZIONE DEL NUMERO CORRETTO DI CROMOSOMI
NELL’UOMO (46 non 48)
PS Nel 1953 (tre anni prima) identificata la struttura
molecolare a doppia elica del DNA….
Avvolgimento e condensazione cromatina
50:1
5000:1
PREPARAZIONE CARIOTIPO STANDARD
(Citogenetica convenzionale)
-Cc somatiche nucleate (es.linfociti sangue periferico, fibroblasti)
-Mitogeno (PHA fitoemoagglutinina)
-Colchicina (blocco in metafase - inibizione del fuso)
-Soluzione ipotonica
-Fissazione
-Colorazione (bandeggio)
Anatomia di un cromosoma umano
Regione
subtelomerica
Regione
subtelomerica
Cariotipo umano
“COLORAZIONI” E BANDEGGIO CROMOSOMICO
REGIONI SUBTELOMERICHE = RICCHE DI GENI. ANOMALIE DI QUESTE REGIONI
(DELEZIONI, RIARRANGIAMENTI) SONO ASSOCIATE A
FENOTIPI PATOLOGICI (ES.RITARDO MENTALE)
Cariotipo:esempi di colorazione G (Giemsa) a 550 bande
Esempio di referto di analisi citogenetica
standard per infertilità
(Thompson & Thompson, 2016)
«Bandeggio
Cromosomico»
(standard)
Braccio
Regione
Banda
Sottobanda
Sotto-sottobanda
Es 12q24.32
Morfologia/anatomia dei cromosomi umani
(dimensioni e posizione centromero)
CARIOTIPO STANDARD UMANO
(G-banding pattern)
CROMOSOMI ACROCENTRICI
Satelliti = geni in tandem per rRNA
Cariotipo (assetto cromosomico) FEMMINILE normale
13
Cariotipo (assetto cromosomico) MASCHILE normale
14
ALTA RISOLUZIONE CROMOSOMICA
(CROMOSOMI “ALLUNGATI” – PROMETAPHASE BANDING)
Genoma paradossale - la complessità biologica non correla
con il numero di cromosomi….
Chi offre di più?....
Cane 78. Germano reale 80. Pesce rosso 94. Equiseto (coda
di cavallo) 216. Lysandra atlantica (farfalla) 250.
Ophioglossum (felce) anche >1400! Il più elevato numero conosciuto in natura….
EVOLUZIONE DELLA CITOGENETICA
La Citogenetica Classica
(convenzionale, standard)
permette di identificare riarrangiamenti
cromosomici fino a circa 5-10 Mb
La Citogenetica Molecolare
(Citogenomica)
permette di identificare
riarrangiamenti fino a poche Kb
Livelli di risoluzione delle analisi cromosomiche e genomiche
(Thompson & Thompson, Genetics in Medicine, 8th Ed, 2016)
CITOGENETICA MOLECOLARE
(Citogenomica, «chromonomics»)
Livello di risoluzione< 4-5Mb (4-5 milioni di basi)
F.I.S.H.
(Fluorescent In Situ Hybridization)
Array – CGH (aCGH)
(array-based Comparative Genomic Hybridization)
FISH
Anni 90, nasce la citogenetica molecolare
Marcatura fluorescente (sonde centromeriche
locus-specifiche, painting)
Elevata risoluzione rispetto a citogen.tradizionale
Rapidità
Nuclei in interfase
Marcature multiple
Elaborazione computerizzata immagini
F.I.S.H.
Multicolor FISH (Painting)
Cariotipo di una cellula
tumorale
S.da microdelezione: es. S.Wolf - Hirschhorn
NB In alcuni casi la delezione nella s.di Wolf in 4p è
talmente estesa da essere visibile al cariotipo standard……
Microarray CGH (vd oltre)
(WHS = Wolf Hirnschorn Syndrome)
Williams syndrome
1/10.000, ipercalcemia infantile, facies caratteristica (ponte nasale, narici anteverse,
guance paffute, bocca larga, labbra carnose. Anomalie dentali.) Vomito frequente. Insonnia.
“Cocktail party manner” (bambini): socialità, logorrea, amicalità, iperattività….. Iperacusia.
Ritardo mentale e disabilità intellettiva che impedisce indipendenza.
SVAS (stenosi sopravalvolare aortica). Stenosi periferiche polmonari. Bassa statura…
La microdelezione in 7q coinvolge circa 20 geni (CGS =Contiguous Gene Syndrome)
compreso, sempre, iI gene per l’elastina (espressione nella parete aortica)………
Sindromi da microdelezione (CGS*)
* = Contiguous Gene Syndrome
(Jorde et al., 2010)
FISH interfasica multicolor
in DIAGNOSI GENETICA
PREIMPIANTO (PGD)
P.G.D.
Ibridazione Genomica Comparativa (convenzionale)
Ricerca di (micromicro) delezioni
e/o duplicazioni…..
CGH convenzionale e
microarray (arrayCGH: aCGH)
Screening dell’intero genoma
Cianine, sostanze
fluorescenti
aCGH: UTILITA’ E INDICAZIONI
Identificazione di “copy number differences”
tra un DNA test e un DNA di riferimento:
-Monosomie parziali (microdelezioni)
-Trisomie parziali (microduplicazioni o amplificazioni)
-Valutazione di pazienti con ritardo mentale/disabilità
intellettiva e/o malformazioni congenite/dismorfismi
non ben inquadrati dal punto di vista diagnostico
-Valutazione di riarrangiamenti genetici nei tumori
…o CMA (Chromosomal MicroArray)
Le dimensioni di un microarray (DNA chip)
aCGH: DNA chip
Microchip di DNA (Microarray)
Permettono in tempi brevi e a bassi costi
l’analisi dell’intero genoma – Possono contenere fino
a 1 milione di «sonde» (brevi sequenze di DNA)
40
aCGH: alcuni esempi applicativi
Identificazione di una microdelezione nel cromosoma 11
del(11)(q13.2-q13.4) mediante aCGH