l.lanza - MAF Servizi Srl

Le malattie complemento
mediate: EMOGLOBINURIA
PAROSSISTICA NOTTURNA
Diagnostica e
classificazione dell'EPN
Dott.ssa Lorella Lanza
Laboratorio di Diagnostica Citofluorimetria
S.C. Anatomia Patologica
Ospedale Santa Corona
Savona, 6 novembre 2015
L’analisi citometrica è il test più
sensibile ed informativo per
•l’identificazione di un clone
caratterizzato dall’assenza totale
o parziale delle molecole GPIlinked
•la diagnosi dell’ EPN
Il test citofluorimetrico utilizza
anticorpi monoclonali diretti contro
proteine GPI-linked o altri reagenti
che si legano all'ancora GPI sulla
superficie dei globuli rossi o dei
globuli bianchi.
GPI Linked Proteins in Blood Cells
CD59, CD90, CD109
CD59
CD55
CD58
CD55
CD58
CD59
CD109
CD24
CD66b
CD16
CD66c
CD87
CD55
CD58
CD59
CD48
CD109
CD157
CD177
B cells
RBC
Stem Cell
Platelets
T cells
FLAER
Monocytes
PMN
NK cells
CD14
CD48
CD55
CD52
CD157
CD58 CD59
CD87 CD109
CD16
CD48
CD24
CD73
CD55
CD58
CD59
CD108
CD48
CD52
CD73
CD55
CD58
CD59
CD87
CD108
CD109
CD48
CD55
CD58
CD59
CD52
The International Clinical Cytometry Society (ICCS)
Gruppo di studio ClonePnh
PANNELLO PER DIAGNOSI EPN
I
II
III
IV
V
VI
FLAER CD24
CD14 HLADR CD45 CD15
Vuoto
Vuoto
CD59
GPA
CD45 Vuoto
Con questo tipo di combinazioni si possono rilevare
cloni molto piccoli (test ad alta sensibilità, 1x10-4) .
FLAER (fluorescently labeled aerolysin)
Aerolysin è una proteina batterica che si lega
selettivamente all’ancora GPI di qualsiasi
proteina.
FLAER non può essere utilizzato per l’analisi
sugli eritrociti perchè il reagente non si lega
efficacemente ai globuli rossi
Cellule EPN non legano FLAER perchè
non esprimono GPI e quindi nel test
citofluorimetrico
un
istogramma
identifica una distribuzione bimodale
del picco di fluorescenza
assenza di
fluorescenza
Presenza di
fluorescenza
Cellule positive
Cellule negative
L’analisi citofluorimetrica non fornisce solo dato
positivo o negativo, ma discrimina popolazioni
discrete con differenti gradi di carenza di un antigene
e ne determina la percentuale.
bassa espressione 0,5%
Non espressione 96,5%
alta espressione
3%
Cellule con completa carenza di proteina GPI-linked
sono chiamate EPN III, quelle con parziale carenza
sono chiamate EPN II e quelle con normale
espressione EPN I .
EPN I
Cellule normali
EPN III
Totalmente
difettive
EPN II
Parzialmente difettive
CLONE EPN = EPN III + EPN II
Cloni EPN2, EPN3 e EPN2-EPN3
Cloni nell’ Archivio
Tipo di Clone
PNH2
PNH2 + PNH3
PNH3
Total
N
29
54
446
529
%
5.5
10.2
84.3
100.0
100 labs, 75 active, 5.000 tests, 529 clones identified
Le linee guida della Clinical Cytometry Society (CCS)
raccomandano l'uso di SANGUE PERIFERICO per
l'analisi citofluorimetrica
3- 4 ml di sangue periferico in EDTA (volume maggiore
nei casi di spiccata pancitopenia)
NO SANGUE MIDOLLARE : ANALISI FUORVIANTE
CELLULE ANALIZZATE
- Granulociti Neutrofili popolazione che meglio riflette le
dimensioni del clone PNH
- Eritrociti MA dimensione del clone PNH può essere
sottostimata per emotrasfusioni o emolisi intravascolare
- Monociti solo test di conferma della presenza del clone
- Nessun ruolo dei linfociti
Per il test di screening è raccomandata la
quantificazione di almeno 2 proteine GPI-linked sulla
popolazione di riferimento per escludere la possibilità
che la carenza sia dovuta ad un difetto ereditario di
una singola proteina.
La quantificazione di eventi rari prevede 3 livelli di sensibilità tecnica del
test:
bassa (limite di sensibilità 1%, ossia una cellula EPN su 100 cellule
normali);
media (limite di sensibilità 0,1%, ossia una cellula EPN su 1.000 cellule
normali);
alta (limite di sensibilità 0,01%, ossia una cellula EPN su 10.000 cellule
normali).
Il numero minimo di eventi da acquisire al citometro nel
gate specifico, per ciascun livello di sensibilità, è definito
dal numero minimo di eventi che consente di individuare un
cluster di cellule patologiche (PNH) pari o superiore a
30 (valore che è ritenuto il numero minimo di cellule che
definisce un cluster significativo).
Risulta ovvio che le sensibilità indicate sono quelle a cui
tendere nell’analisi: si potrebbe infatti non arrivare alle
sensibilità indicate a causa della scarsa cellularità dei
campioni, come ad esempio nelle citopenie marcate.
Il referto dovrà contenere
Sensibilità del metodo
diagnosi definitiva di PNH, che
coincide con la presenza del
clone, anche se di
ridotte dimensioni (0.01%).
descrizione puntuale del difetto
delle molecole GPI-linked su
granulociti, monociti ed eritrociti,
che rappresenta un riferimento
indiretto alla clonalità della
proliferazione;
Classification of PNH
A. Classic PNH
B. PNH in the setting of another specified bone marrow disorder
(eg, PNH/aplastic anemia or PNH/refractory anemia-MDS)
C. PNH-subclinical (PNH-sc) in the setting of another specified
bone marrow disorder (eg, PNH-sc/aplastic anemia)
Differenti livelli di espressione della malattia e
quindi diverse dimensioni del clone EPN
Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, Hillmen P, Luzzatto L, Young N, Kinoshita T, Rosse W,
Socié G; International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood
106(12),3699-709 (2005)
Flow cytometry is recommended to identify the GPI-AP
deficient peripheral blood cells that are diagnostic of PNH.
Assessment of hemolytic parameters and bone marrow
analysis are required to determine the subcategory into which
each patient falls
Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, Hillmen P, Luzzatto L, Young N, Kinoshita T, Rosse W,
Socié G; International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood
106(12),3699-709 (2005)
PNH Classica.
Evidenza clinica e biochimica di emolisi intravascolare
(reticolocitosi, aumento LDH, e bilirubina indiretta, bassa
concentrazione di aptoglobina)
Midollo iper- o normo-cellulato con iperplasia eritroide;
alterazioni morfologiche lievi o assenti
Dimensione del clone usualmente >50%
PNH nel contesto di un’altra patologia
con insufficienza midollare
Evidenza clinica e biochimica di emolisi intravascolare (reticolocito
aumento LDH, e bilirubina indiretta, bassa concentrazione di
aptoglobina)
Evidente insufficienza midollare
(anemia aplastica, MDS, mielofibrosi).
Dimensione del clone usualmente <30%
PNH subclinica nel contesto di un’altra patologia
con insufficienza midollare
Nessuna evidenza clinica e biochimica di emolisi
intravascolare (reticolocitosi, aumento LDH, e bilirubina
indiretta, bassa concentrazione di aptoglobina)
Evidente insufficienza midollare
(anemia aplastica, anemia refrattaria-MDS).
Dimensione del clone piccola usualmente <1%
(rilevata con test ad alta sensibilità su eritrociti
e/o granulociti)
Caso clinico
Maggio 2012, Uomo 47 aa
WBC 4,4/mmc (N 27%-1200/mmc, L 62%-2700/mmc, Mo 11%470/mmc), Hb 8,5 gr/dl, PLT 5000/mmc
LDH , aptogl , ret 55/1000
BOM: MDS con aplasia/ipoplasia della serie magacariocitaria
CFM: L’analisi citometrica mostra la presenza di un clone <1% di cellule
EPN sulla popolazione di riferimento (granulociti). Tale risultato non è
compatibile con una diagnosi di Emoglobinuria Parossistica Notturna florida
e va interpretato alla luce del quadro clinico-laboratoristico e midollare del
paziente (possibile EPN subclinica associata a disordine midollare, quale
anemia aplastica o mielodisplasia).
TERAPIA: supporto trasfusionale eritrocitario e piastrinico
assenza risposta a immunosoppressivi e stimolanti eritropoiesi
TPO mimetico: miglioramento crasi ematica, piastrinopenia
persistente senza necessità di supporto trasfusionale
EPN su RBC
Maggio 2012
Sensibilita’ 0.01% – EPN III 0.1% (245 eventi)
EPN su WBC
Maggio 2012
Granulociti sensibilita’ 0.1 – EPN III 0.4% (83 eventi)
Monociti sensibilita’ 0.5 – EPN III 0.0%
Ottobre 2015 Controllo ematologico
WBC 5,5/mmc (N 35%-1900/mmc, L 48%-2600/mmc, Mo 15%425/mmc), Hb 14,9 gr/dl, PLT 33000/mmc
BOM ed aspirato: Displasia trilineare, mielodisplasia con
ipoplasia megacariocitaria ed eccesso di blasti (5-9%).
CFM: L’analisi citometrica mostra incremento del clone di
cellule EPN 2,2% sulla popolazione di riferimento (granulociti).
PNH subclinica nel contesto di un altro disordine ematologico
(classe III di Parker).
EPN su RBC
Ottobre 2015
Sensibilita’ 0.01% – EPN III 0.1% (245 eventi)
EPN su WBC
Ottobre 2015
Granulociti sensibilita’ 0.01% – EPN III 2.2% (6547 eventi)
Monociti sensibilita’ 0.05% – EPN III 0.0%
Progetto multicentrico per la validazione di uno
screening citofluorimetrico semplificato di pazienti
sottoposti all'indagine per la ricerca dei cloni di
Emoglobinuria Parossistica Notturna
 Studio multicentrico eseguito presso 20 laboratori di
citometria del GPMI
 Ogni responsabile del laboratorio dovrà indicare un
clinico (ematologo clinico o internista) di riferimento per
l'identificazione dei pazienti che presentano i requisiti
clinici per l'inclusione nello studio.
 Ogni laboratorio dovrà identificare e sottoporre a
screening almeno 10 pazienti in 1 anno
Criteri di inclusione
pazienti che presentano contemporaneamente due criteri
clinico laboratoristici per i quali è comunque indicata la ricerca
Evidenza di emolisi o
dei cloni EPN
Trombosi
inspiegate
(venose/arteriose)
Sindromi mielodisplastiche
Citopenie
Insufficienza renale
+
Citopenie o
assenza di risposta alla terapia
anticoagulante o
trombosi in sedi addominali, cerebrali o
dermiche
+
evidenza di emolisi o
ipoplasia midollare o
citopenia refrattaria o
episodi trombotici
+
evidenza di emolisi o
anemia sideropenica refrattaria o
non responsive alla terapia
+
evidenza di emolisi
Il test oggetto del progetto verrà eseguito adottando
una tecnica analitica citofluorimetrica "minimalista" in
cui sono impiegati due soli reagenti (FLAER e anti
CD15) per l'identificazione dell'eventuale clone sulla
sola popolazione di riferimento (i granulociti)
impiegando una tecnica analitica a media o alta
risoluzione (0,1% o 0,01%).
Obiettivi del progetto
Validazione del protocollo analitico semplificato per
l'esecuzione dello screening citofluorimetrico.
Valutazione multicentrica della frequenza di cloni EPN in
soggetti ad alto rischio.
 Vantaggi in termini di tempi di esecuzione del test e di costi
GRAZIE PER L’ATTENZIONE