Polimerase Chain Reaction

Polimerase Chain Reaction:
la tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare
Dr.ssa Lucia Collini - Trento, 26/XI/2011
Polimerase Chain Reaction (PCR):
ideata nel 1983 da Kary Mullis,
permette l’amplificazione in
miliardi di copie di qualsiasi frammento
di DNA di cui siano note le sequenze
fiancheggianti.
1993
Premio Nobel per la
Chimica
La scoperta della PCR (Polimerase Chain Reaction)
«Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it»
E’ la tecnica di studio degli acidi nucleici (DNA-RNA) che ha più
contribuito alla semplificazione tecnologica, alla diffusione e allo sviluppo
della biologia molecolare in tutti gli ambiti di ricerca e di diagnostica
clinica.
Che cosa è la PCR?
E’ la sintesi enzimatica in vitro che
permette di ottenere molte copie di
uno specifico frammento di DNA
(sequenza target)
PCR
Richiede reagenti semplici, poco costosi e poco tempo
-DNA stampo
-Primers, oligonucleotidi (~20bp) a singola catena
-DNA polimerasi (termostabile)
-dNTPs
-Mg2+
-Tampone (Buffer)
DNA polimerasi di
Thermus aquaticus
PCR
E’ una tecnica che consente di amplificare piccole
quantità di DNA
Cicli termici ripetuti
Trenta cicli incrementano la quantità di DNA di oltre un miliardo di volte
PCR
ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE
DI AMPLIFICAZIONE
Primers
Base Azotata
(Adenina, Timina,
Citosina, Guanina, Uracile)
DNA polimerasi
DNA STAMPO
DESOSSIRIBOSIO
Desossi Nucleotidi trifosfati (dNTP)
Siti dei primers
DNA target
Lunghezza DNA amplificato
DNA estratto dal campione
PCR
fase 1
DENATURAZIONE
La doppia elica di DNA
stampo è aperta al calore
95°
°C
PCR
fase 2
ANNEALING
I primers si appaiano alle sequenze
complementari sul DNA stampo
37-72°
°C
PCR
fase 3
ESTENSIONE
La DNA polimerasi allunga gli inneschi e
produce 2 nuove catene di DNA
72°
°C
IL PROCESSO SI RIPETE
95°
°C
Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA
“copiato” raddoppia
Resa teorica di una reazione di PCR a
partire da una singola copia di DNA
Numero di cicli
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Numero di molecole di amplificati
2
4
8
DNA
16
1
32
64
PCR
128
1 x 109
256
512
1.024
2.048
4.096
8.192
16.384
32.768
65.536
Y= N2n
131.072
262.144
524.288
1.048.576
Y= numero molecole di DNA
2.097.152
4.194.304
amplificato
8.388.608
N= numero molecole di DNA
16.777.216
35.544.432
di partenza
67.777.216
134.217.728
n= numero dei cicli di PCR
268.435.456
536.870.912
1.073.741.724
LA REAZIONE DI PCR
Plateau
Fase Lineare
Log [DNA]
Fase Geometrica
n°
° cicli
PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA
RESA DELLA PCR
Specificità
Sensibilità
Riproducibilità
Scelta dei primers
Condizioni di reazione
Contaminazione
Scelta dei primers
Eterogeneità genomica
Presenza di inibitori
Tipo di campione
Efficienza della reazione
Standardizzazione delle fasi del metodo:
preparazione del campione
protocollo di PCR
sistema di rivelazione
I REAGENTI DELLA REAZIONE DI PCR
DNA TARGET
Omogeneo (plasmide purificato): ogni molecola è identica
e rappresenta la sequenza da amplificare
Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il
DNA
genomico, sospensione cellulari o materiale
biologico)
DNA TARGET
Inibitori della PCR
Troppo DNA
Troppo RNA
Presenza di
emoglobina
Eparina
Ioni metallici
SDS
Composti Aromatici
Etanolo
Urea
Detergenti
OLIGONUCLEOTIDI O PRIMERS
SPECIFICI
UNIVERSALI
DEGENERATI
Estrema cura nella scelta della regione da amplificare (evitare
sequenze inusuali come serie di purine o pirimidine)
Estrema purezza (intesa come assenza di componenti che
diminuiscono l’efficienza della PCR)
Lunghezza: 20-30 paia di basi (non meno di 16 bp)
Equilibrato rapporto AT/GC
Evitare sequenze
DISEGNO
palindromiche che
provocano strutture
DEI
secondarie (loop).
PRIMERS
Le estremità 3’ non
devono essere tra
-OH
loro complementari:
Taq
formazione dei
OH“primers-dimeri”
-OH
DNA POLIMERASI
(Taq polimerasi)
attività
3’ esonucleasica
3’
attività
attività
5’ esonucleasica catalitica
5’
5’
3’
DNA stampo
Primer a RNA
Nuovo filamento
DNA polimerasi
DNA polimerasi
termostabile
5’
Primer
oligonucleotidico
Nuovo filamento
3’
5’
3’
DNA stampo
3’
Primers
a RNA
Nuovo filamento
3’
5’
5’
LE CONDIZIONI DI REAZIONE
DENATURAZIONE
SEPARAZIONE
DELLE DUE
ELICHE DEL DNA
TARGET
94-95°
°C per 15-60 secondi
ANNEALING
INCONTRO E
IBRIDAZIONE DEI
PRIMERS CON IL DNA
TARGET
FASE PIU’ DELICATA DELLA PCR
Calcolo della temperatura
di annealing (37-72°C)
La durata dipende dal tipo
di strumento utilizzato
ESTENSIONE
POLIMERIZZAZIONE
DI NUOVE MOLECOLE
COMPLEMENTARI AL
DNA TARGET
60°
°-72°
°C
per 15-60 secondi
TIPI DI PCR
Quale metodo di PCR ?
PCR Real-time
Multiplex PCR
LCR
PCR nested
Branched DNA
NASBA
(Nucleic Acid Sequence Base Amplification)
NESTED - PCR
Vantaggio: aumenta la specificita’ e la sensibilita’ dell’ amplificazione.
Infatti eventuali prodotti secondari della prima reazione non vengono
5’ nella seconda.
amplificati
3’
-
DNA TARGET
-
Primo step:
Primers Esterni
I AMPLIFICATO
Secondo Step:
Primers Interni
II AMPLIFICATO
RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE
PCR nested
regione nota
cDNA
3’
I primer specifico
regione ignota
TTTTT
5’
II primer specifico
Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione
interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella regione
nota dell’ mRNA
La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo
primer,
-si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione,
-probabilità alta di avere un frammento specifico
-probabilità bassa di due sequenze omologhe limitrofe due volte nel
genoma.
- si può ricorrere ad un terzo primer interno.
PCR MULTIPLEX
permette l’analisi di più target contemporaneamente
vengono usati miscele di primers o primers degenerati
Multiplex PCR for automatic Detection
TAT 5 ore,
applicabile su
campioni di sangue,
materiale
periodontale, liquido
articolare, liquor,
sputo e altri liquidi
biologici
LIGASE CHAIN REACTION (LCR)
DNA stampo
primers antisenso
primers senso
ligasi
termostabile
primers “legati”
il processo si ripete
per 30 o più cicli
primers legati:
prodotti di LCR
viene sfruttata l'azione
di una ligasi
termostabile e la
presenza di quattro
oligonucleotidi in grado
di appaiarsi, a due a due,
a specifiche sequenze
della molecola di DNA.
LCR
REAL TIME PCR
amplificazione e rivelazione del prodotto
amplificato (DNA target) avvengono
contemporaneamente.
Il DNA target è riconosciuto e rilevato
attraverso l’impiego di sonde fluorescenti
(Taqman, Molecolar Beacon etc..).
L’incremento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di
DNA amplificato (nella fase iniziale).
PCR Real-time
VIRUS
•Erpetici
•Enterovirus
•Parvovirus
•Citomegalovirus
•HIV
•HCV
•HBV
Metodi di PCR Real-time
permettono di identificare e/o quantificare il genoma di tutti i
virus riportati (con i relativi sierotipi) in più matrici biologiche:
-liquor
-sangue intero
-plasma, etc
utilizzano uno stesso profilo termico permettendo di amplificare più
genomi virali contemporaneamente con:
-riduzione dei tempi di esecuzione
-aumento della sensibilità (> 99%) e specificità alta (> 99%)
Branched DNA
Metodo quantitativo che
utilizza speciali sonde
chemioluminescenti che
si legano
specificatamente alla
sequenza di acido
nucleico da identificare
creando una struttura
ramificata “branched
DNA”(bDNA).
A
N
D
d
e
h
c
n
a
r
B
Il segnale ottenuto alla
fine della reazione è
proporzionale alla
quantità di bersaglio
presente nel campione.
(Nucleic Acid Sequence Base Amplification)
NASBA:
da RNA a DNA e di nuovo a RNA
Utilizzando:
3 enzimi(RNA
polimerasiT7,
RT, RNASiH) e
2 primer
specifici
consente
l’amplificazione
sia di RNA sia di
DNA in maniera
esponenziale.
Il prodotto della reazione
NASBA è un RNA a
singolo filamento, che
rappresenta 106-109
volte la sequenza
bersaglio, sembra fornire
maggiori garanzie di
specificità.
La tecnica si pone come alternativa al metodo RT-PCR in molte occasioni, specie
quando la sequenza di partenza è di RNA. Rispetto alla PCR, il NASBA permette:
-Maggiore efficacia di amplificazione di RNA in una miscela ricca di DNA
-Condizioni di lavoro isotermiche (di solito 41°
°C)
-Maggiore rapidità dei test
-Rivelazioni di minori quantità di acido nucleico
APPLICAZIONI
della Polymerase chain reaction
Applicazioni di diagnostica infettivologica
Le tecniche molecolari
PATOGENO
CAUSA
PATOGENO
CAUSA
PATOGENO
PATOGENO
SINDROME
tecnica
molecolare
CAUSA
CAUSA
PATOGENO
CAUSA
PATOGENO
CAUSA
PATOGENO
CAUSA
Più patogeni danno la stessa sindrome clinica,
1 sola tecnica molecolare per la causa reale
PCR nella diagnosi di infezione del sistema nervoso centrale
Caso clinico
Agosto 2011:
M.Z., ragazzo di 15 anni, entra in Pronto Soccorso con
febbre, cefalea, rigor nucalis, stato confusionale, e
eruzione cutanea rubeoliforme su torace
Anamnesi: soggiorno in campeggio, in terapia con
cefalosporina di terza generazione
Consulenza infettivologica: rachicentesi
Liquor TORBIDO
Esame chimico-fisico:
Accertamenti eseguiti
Proteine: 50 mg/dl
Glucosio: 45 mg/dl
Leucociti: 2500 (65% polimorfonucleati, 25% linfociti)
Colorazione gram: negativa
Latex test: negativo, Esame colturale: negativo
Biologia molecolare per batteri: negativa
Biologia molecolare per Enterovirus POSITIVA
IgM per CoxsachieVirusA POSITIVE, IgG negative
Applicazioni mediche
diagnosi pre e post-natale di malattie genetiche
(es. Anemia falciforme)
diagnosi di tumori (es. linfomi)
Applicazioni mediche
Gene therapy
Aggiunta di un gene a correzione di un
disordine ereditario
Lo scopo è quello di sostituire dei
geni “cattivi” con i geni “buoni”
oppure per migliorare le “prestazioni”
di una specie
Applicazioni mediche
Proteine
Possono venire prodotte in cellule batteriche
-Insulina
-Interferone
-Peptidi Atriali
-Attivatore
tissutale del
plasminogeno
-Ormone della
crescita
Applicazioni mediche
clonare, sequenziare e modificare i geni o in generale segmenti di DNA
La tecnica per ottenere questi nuovi
vaccini si basa sull’ identificazione della
proteina o delle proteine di un agente
infettivo che siano in grado di indurre
una risposta immunitaria protettiva
simile a quella stimolata dall’agente
infettivo completo. In questo modo
tramite tecniche di ingegneria genetica,
si possono selezionare i geni
corrispondenti, clonarli e farli
esprimere in vettori diversi, oppure
eliminarli mediante una delezione
selettiva. Una variante di questo
sistema sarebbe, una volta identificata la
proteina di interesse immunologico,
ottenere la o le proteine per sintesi
proteica.
Vaccini
Applicazioni in agronomia
Attività insetticida
Resistenza a erbicidi
Tolleranza a stress ambientali
Vita più lunga o maturazione ritardata
Migliori qualità nutrizionali (nutraceutics)
Allungamento dei tempi di conservazione
Il riso è l’unica fonte di cibo per molte
popolazioni, soprattutto asiatiche, ma
manca della provitamina A (β -carotene)
La sua carenza porta a cecità e
immunodeficienze
Sono stati introdotti geni in modo che
venga espresso il β -carotene
nell’endosperma dei semi.
Vantaggi: la provitamina A è espressa
nel riso quindi anche alimentandosi di
solo riso si garantisce l’apporto di ßcarotene nella dieta
Golden rice
Applicazioni in agronomia
Golden rice
-modificazione genetica per produrre beta-carotene (provitamin A)
-viene convertita in vitamina A
Daffodil
phytoene
synthase
gene (psy)
Bacterial
carotene
desaturase
gene (crtI)
Daffodil
lycopene
β-cyclase
gene (lcy)
Genes introduced
into rice genome
Rice
chromosome
psy
crtI
lcy
Phytoene
synthase
Carotene
desaturase
β-Cyclase
Expression
in endosperm
GGPP
Phytoene
Lycopene
β-Carotene
(Provitamin A)
Applicazioni in agronomia
CRY1Ab l'endotossina di Bacillus thuringiensis,
La linea di mais MON 810 ottenuta tramite
trasformazione con metodo biolistico utilizzando il
plasmide PV- MBK07
Mais BT Bacillus thuringiensis
Il mais brevettato dalla Novartis contiene un gene del
Bacillus thuringiensis (Bt) che produce la proteina (Cry
Protein) che cristallizza nell’intestino delle larve di piralide
provocandone la morte, ma innocua per l’uomo e per molti
insetti utili.
Mais BT Bacillus thuringiensis
BT (un batterio del suolo) ha gene
proteina insetticida Cry (delta-endotossina)
Ingegneria genetica: gene isolato
e inserito nel corredo genetico piante mais
Piante GM esprimono tali proteine
Piralide si nutre
di mais GM
Ingerisce
Pro-tossina
Proteasi
Tossina
Legame con recettori nell’epitelio intestinale delle larve
Succhi gastrici
PH 9.5-12
Diffusione endotossina
nell‘ intestino
Pori compromettono equilibrio flussi ionici cellulari
annullamento metabolismo cellulare,
malfunzionamento apparato digerente
Morte
insetto
Efficacia inversamente proporzionale a età insetto
Caratteri
Mais BT
Mammiferi non
possiedono tali recettori
Insensibili ad azione
della tossina
Specificità proteine Cry su diverse specie
Applicazioni forensi
“CSI effect”
L’analisi forense del DNA
• Casi criminali: indagato/vittima-
traccia
• Test di paternità: paternità
controversa
• analisi prenatali: determinazione del
sesso
• Soggetti scomparsi: relazioni famigliari
• Studio di DNA antichi: identificazioni
storiche di mummie
Applicazioni forensi
Analisi forense del DNA
• Raccolta del campione
• Valutazione tipo di traccia (sangue, saliva, sperma,
ecc.) = diagnosi generica
• Estrazione del DNA
• Quantificazione del DNA
• Analisi
• Interpretazione
Sorgenti di DNA
• Presente in ogni materiale cellulare
che contiene un nucleo
• Presente nel materiale biologico
lasciato sulla scena del crimine
Applicazioni forensi
Tipizzazione ed analisi dei polimorfismi del DNA
Test di paternità
Applicazioni forensi
Casi criminali
IL RISULTATO DEL “TEST DEL
DNA”
• ESCLUSIONE: L’INDAGATO E LA
TRACCIA NON HANNO LO
STESSO PROFILO GENETICO
• NON ESCLUSIONE: L’INDAGATO
NON PUO’ ESSERE ESCLUSO
DALL’AVER LASCIATO LA
TRACCIA
• RISULTATO NON CONCLUSIVO
(AD ES. PER SCARSA QUANTITA’
O QUALITA’ DEL DNA)
Applicazioni forensi
Identificazioni storiche
Il 19 settembre 1991 una
coppia di escursionisti
tedeschi (eccellenti alpinisti),
Erika ed Helmut Simon,
scorse, a 3.200 metri di
altitudine, sul massiccio dell'
Őtzal, un cadavere umano che
emergeva dalla neve congelata
Secondo lo studio del DNA
contenuto nei suoi mitocondri,
Ötzi appartiene a un sottogruppo
che non ha lasciato eredi
Il Dna mitocondriale e' un orologio
biologico dell'evoluzione molto piu'
puntuale rispetto al Dna
cromosomico perche' si trasmette
unicamente per via materna ed e'
piu' soggetto alle variazioni
molecolari dovute alle influenze
dell'ambiente esterno, a differenza
del Dna cromosomico che, racchiuso
all'interno del nucleo della cellula, e'
piu' protetto.
campioni del contenuto dell'intestino
prima di morire aveva mangiato carne di stambecco
Your DNA is 99.7 percent like that of the person next to you
The 0.3 percent difference is immensely important
It means we differ at 6 million letters
We are both very alike and very different