espressione in cellule di mammifero: vettori non virali

ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO
RICERCA
?
CELLULE IN COLTURA
-Struttura,funzione e regolazione di un gene
-Produzione di proteine (anche farmaci)
ANIMALI TRANSGENICI
-modelli di malattia
-xenotrapianti
-bioreattori
TERAPIA GENICA
-Ripristino vie metaboliche
-Aumento difese
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO
VETTORI NON VIRALI
VETTORI VIRALI


SOLO ARTIFICIALI:
NON ESISTONO
IN NATURA PLASMIDI PER
CELLULE DI MAMMIFERO
DERIVATI DA VIRUS NATURALI
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO:
VETTORI NON VIRALI O VETTORI VIRALI
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI
Origine di replicazione
Generalmente da virus animali (SV40)
GENE TARGET
Promotori (Enhancer/Silencer) eTerminatori
Generalmente da:
virus animali
SV40, cytomegalovirus (CMV), herpes
simplex virus (HSV)
…..o geni di mammifero altamente espressi:
actina β, timidina chinasi, ormone della
crescita bovino
3’ UTR e Sito Poliadenilazione
- a valle della sequenza codificante necessarie perla corretta sintesi e
poliadenilazione di mRNA
Sequenze introniche
Tra promotore e gene
MARCATORI SELEZIONABILI
MARCATORI DI ORIGINE BATTERICA
Neor: neomicina fosfotrasferasi batterica
G-418 (geneticina) / blocca la traduzione e
uccide la cellula
COMPLEMENTAZIONE DI VIE METABOLICHE INTERROTTE
DHFR: gene per diidrofolato
reduttasi Utilizzabile con
cellule DHFRConferisce resistenza a
Metotrexato (MTX)
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI
VETTORI CONTENENTI
PIU’ GENI
VETTORI DICISTRONICI
IRES= Internal
Ribosome Entry
Site
Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)
•  Trasformazione (microoorganismi)
•  Trasfezione (eucarioti)
•  Infezione (se il vettore è un virus)
Tecniche (chimiche e fisiche)
•  Uso di sostanze permeabilizzanti
•  Elettroporazione
•  liposomi
•  Bombardamento con microparticelle
•  Microiniezione
ESPRESSIONE TRANSIENTE O STABILE?
ESPRESSIONE TRANSIENTE EPISOMALE: SV40 E ANTIGENE T
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI
VANTAGGI
• 
• 
• 
• 
NO nuovi virus patogeni
RIDOTTO rischio di reazione immunitaria
SI al trasferimento di molti tipi di DNA anche molto grandi
SI alla produzione in grandi quantità a basso costo
SVANTAGGI
•  BASSA efficienza di trasduzione e di integrazione (effetti non
duraturi)
•  ALTA probabilita’ di mutagenesi inserzionale
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI VIRALI
• IL GENE TARGET VIENE INSERITO NEL GENOMA
VIRALE sotto il controllo di un promotore forte.
• IL VIRUS ORIGINALE E’ DIFETTIVO
(no replicazione autonoma)
•  LE PARTICELLE VIRALI RICOMBINANTI VENGONO
PRODOTTE IN LINEE CELLULARI SPECIALI
(linee di packaging).
Queste complementano i difetti presenti nel genoma
virale.
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: QUALI VIRUS?
• Retrovirus : infettano solo cellule in divisione e si integrano
stabilmente in maniera casuale (murini)
• Lentivirus : derivati del virus HIV, possono infettare cellule
quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale.
• Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e
danno grosse reazioni immunitarie.
• Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed
espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo.
• Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti
effetti citotossici.
I ESEMPIO: I RETROVIRUS
•  virus con envelope
•  genoma =10 Kb ssRNA
• retrotrascritto a dsDNA dopo infezione
•  si integra nel genoma dell’ospite (possibile mutagenesi)
•  infetta solo celule in divisione
RETROVIRUS
LTR Ψ
gag
pol
env
LTR
•  gag: proteine del core
•  pol: trascrittasi inversa
•  env: proteine dell’envelope
•  LTR: long terminal repeat= promotore/enhancers e sequenze
necessarie per l’integrazione
•  ψ: sequenze per il packaging
RETROVIRUS DIFETTIVI NELLA REPLICAZIONE
LTR Ψ
LTR Ψ
LTR Ψ
gag
pol
env
cDNA
neo
LTR
promoter
cDNA
LTR
LTR
Mantenuta la
regione LTR e
sequenza di packaging (elementicis).
Promotore: virale o eucariotico
Marker
di
selezione
(es.
neomicina).
Dimensione max del transgene:
7.5 Kb.
E LE PROTEINE NECESSARIE PER LA
REPLICAZIONE?
LINEA CELLULARE DI
PACKAGING
VIRUS HELPER
ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI
VIRALI
VANTAGGI
•  ALTA efficienza di trasduzione
SVANTAGGI
•  SI nuovi virus patogeni per ricombinazione con virus presenti
nell’ospite
•  SI Mutagenesi inserzionale (solo quelli ad integrazione casuale)
•  LIMITE alle dimensioni de DNA
•  SI Reazioni immunitarie
•  SI Costi elevati
ESPRESSIONE IN CELLULE IN COLTURA
(Cellule da tessuto immortalizzate*)
Svantaggi:
Difficile scale-up
Tempi lunghi
Rese basse
Problemi di sicurezza
*CHO (Chinese Hamster Ovary)
3T3
BHK (Baby hamster kidney)
Ibridomi (anticorpi)
Ecc……..
LA RESA IN PROTEINA E’ STATA MOLTO MIGLIORATA….
GLI ORGANISMI TRANSGENICI COMPLESSI
• Ruolo Gene/proteina in un contesto fisiologico
• Modelli animali di malattie
• Xenotrapianti
• Bioreattori per produrre proteine
DUE TIPI DI
ESPERIMENTI
I TOPI TRANSGENICI
Il metodo delle cellule staminali embrionali (ES)
Pluripotenti= formano tutti tessuti
Singola cellula =
rosa o gialla
Piante ed animali transgenici come bioreattori.
-Vantaggi: possibilità di facilitare la purificazione del prodotto se questo
si trova in una parte commestibile e conservabile (semi, latte).
Bassi costi di produzione.
Il gene si introduce per
microiniezione nell’ovulo
o nell’embrione (1-2 cellule)
Il promotore si attiva in tessuti
e momenti dello sviluppo
specifici
Svantaggi:
Il primo animale è molto costoso
Tempi di generazione e resa
Controllo dei dosaggi
Problemi di Biosicurezza
Ruminanti non fanno tutte le modificazioni post-traduzionali
DOVE SI PRODUCONO LE
PROTEINE RICOMBINANTI?
LATTE
BOVINI
OVINI
SUINI
UOVA
3 settimane
20 settimane
UCCELLI
SANGUE (-)
300 UOVA/ANNO
(100 mg/uovo)
950 USD/g ( cellule coltura)
700 USD/g (transgene)
ALCUNE APPLICAZIONI SPERIMENTALI:
I VACCINI A DNA
I VACCINI A DNA PRODUCONO GLI ANTIGENI
DIRETTAMENTE NELL’OSPITE
I VACCINI A DNA PRODUCONO GLI ANTIGENI
DIRETTAMENTE NELL’OSPITE