Maria Antonietta Lepore
Valutazioni
sperimentali su oligoelementi
con metodiche elettive
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via Raffaele Garofalo, 133 a/b
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ISBN
978–88–548–2906–0
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I edizione: novembre 2009
A Vladimiro con immenso amore
Mamma
Indice
9
Capitolo I
Selenio
1.1. Introduzione, 9 – 1.2. Materiali e metodi, 11 – 1.3. Risultati
della discussione, 13 – 1.4. Conclusioni, 13 – 1.5. Bibliografia, 15
17 Capitolo II
Valutazione sperimentale sulla determinazione del
cross–link del piridinio attraverso la cromatografia
liquida ad alta pressione
1.1. Introduzione, 18 – 1.2. Materiali e metodi, 24 – 1.3. Risultati,
24 – 1.4. Conclusioni, 25 – 1.5. Bibliografia, 26
2 9 Capitolo III
La spettrofotometria di assorbimento atomico
nella valutazione del piombo
nei liquidi biologici
1.1. Introduzione, 30 – 1.2. Materiali e metodi, 31 – 1.3.
Determinazione del piombo nelle urine, 34 – 1.4. Conclusioni, 36 – 1.5. Bibliografia, 37
Capitolo I
Selenio
In questo lavoro è stata effettuata la determinazione dei livelli pla-
smatici del selenio mediante la tecnica della spettrofotometria per
assorbimento atomico in fornetto a grafite. Il metodo utilizzato non
è complesso né indaginoso ed è sufficientemente preciso ed accurato.
Infatti, le prove di precisione in giorni diversi hanno confermato che
i valori ottenuti non subiscono, in media, variazioni significative. Il
metodo di elezione per l’analisi degli elementi in tracce, come il selenio, resta, a tutt’oggi, la spettrofotometria per assorbimento atomico,
perché è lo strumento più comune a tale scopo; ha ambito di adattamento molto ampio; ha capacità di avvertire le variazioni dei valori dei
campioni migliori delle altre tecniche. Inoltre, non meno importante,
la spettrofotometria per assorbimento atomico rende possibile, usando adatte modifiche della matrice, una veloce e facile esecuzione di
numerosi campioni.
1.1. Introduzione
Il selenio è un elemento chimico non metallico.
Nel comportamento chimico e nelle proprietà fisiche è
affine allo zolfo ed al tellurio.
Esiste in diverse forme allotropiche, di cui una stabile,
cristallina, dall’aspetto grigio e simile ad un metallo; come
polvere è selenio amorfo, rosso, invece la forma vetrosa è
nera.
10
Capitolo I
Sotto forma di monosolfuro il selenio si presenta in scaglie
giallo–arancio e viene utilizzato soprattutto in veterinaria; come
disolfuro, invece, tipicamente colorato in rosso, è utilizzato a
scopo farmaceutico.
Il selenio è tra gli elementi più rari in natura; è presente nell’atmosfera come derivati di metile; è un componente dell’amminoacido selenocisteina.
È un oligoelemento essenziale, svolge una azione antiossidante cellulare di protezione nei confronti dei radicali liberi
in sinergia con la vitamina E e di prevenzione nelle patologie
cardiovascolari e tumorali; gioca un ruolo importante nel funzionamento della tiroide, dove è un cofattore essenziale dell’enzima 5–deiodinasi, responsabile della conversione di T4
in T3.
Il selenio si presenta naturalmente nell’ambiente.
Viene liberato sia con processi naturali sia attraverso attività
umane.
L’attività del selenio è legata alla presenza della vitamina E;
è un cofattore importante dell’enzima glutatione perossidasi, la
cui attività è indispensabile per il mantenimento del numero dei
globuli rossi (1–2).
Protegge il muscolo cardiaco e rinforza le difese immunitarie; ha proprietà anticoagulanti; proprietà antinfiammatorie;
rallenta i meccanismi dell’invecchiamento.
La carenza di selenio determina cardiopatie, ipertensione,
arteriosclerosi, degenerazione muscolare, morbo di Crohn, insufficienza renale (3).
Il selenio è largamente impiegate nelle industrie dei metalli,
industrie di vernici, nell’industria della riproduzione per fotocopie; in elettronica, nelle fotocellule e nelle celle fotovoltaiche;
nella fotografia.
È impiegato anche per decolorare il vetro.
L’esposizione al selenio avviene solitamente a livello professionale e può causare affaticamento, stordimento, irritazione
delle mucose.
Selenio
11
Quando l’esposizione è molto elevata, si può determinare
accumulo di liquido nei polmoni e bronchite.
La gravità degli effetti dell’assorbimento del selenio nell’organismo dipende dalle concentrazioni ingerite.
L’avvelenamento da selenio può divenire così grave da determinarne la morte.
La sovraesposizione a vapori di selenio può procurare accumulo di liquido nei polmoni, bronchite, polmonite, dolori addominali, disturbi neurologici, epatopatie; di solito ciò accade
solo in seguito ad esposizione professionale.
Risulta indaginoso e complesso mettere a punto una metodica per la determinazione del selenio nel sangue, soprattutto a
causa della sua esigua concentrazione plasmatica e la spettrofotometria per assorbimento atomico in fornetto a grafite sembra
la più adatta a questo scopo (4).
Con questa metodica sono stati ottenuti risultati esaurienti
ed attendibili.
1.2. Materiali e metodi
Sono stati esaminati 330 soggetti, 165 uomini e 165 donne, di età compresa tra 20 e 76 anni non esposti professionalmente.
A ciascuno di essi è stato effettuato un prelievo di sangue per eseguire la determinazione della concentrazione
del selenio nel plasma.
È preferibile eseguire l’analisi estro 48 ore dal prelievo;
se ciò non fosse possibile, è necessario conservare i campioni in frigorifero ad una temperatura non superiore a
+2° C.
I reagenti utilizzati sono:
– soluzione standard di selenio per assorbimento atomico;
– nitrato di nichel soluzione 0,5 g/l.
12
Capitolo I
Tabella 1.1. Riferimenti del fornetto a grafite
Temperatura
Tempo
Flusso del gas
Gas
°C
sec
L/min
1° Fase
120
60
30
argo
2° Fase
600
20
30
argo
3° Fase
1000
10
30
argo
4° Fase
1800
6
30
argo
5° Fase
2100
3
30
argo
6° Fase
2500
2
30
argo
La strumentazione consiste in:
–
–
–
–
–
–
spettrofotometro per assorbimento atomico;
lampada a catodo cavo specifica per il selenio;
correttore del fondo al deuterio;
fornetto a grafite;
apparato per produrre idruri;
registratore.
I requisiti operativi:
– quantità introdotta nello strumento: 20 μl;
– lunghezza d’onda: 196 nm;
– gas utilizzato: argo.
Nella tabella 1.1 sono riportati i parametri del fornetto a grafite.
Si esegue la preparazione del campione con 50 μl di plasma,
50 μl di soluzione di nichel nitrato 0,5 g/l, 200 μl di H2O distillata.
Selenio
13
Si agita e si iniettano 20 μl della soluzione nella strumentazione.
Per determinare la curva di taratura si utilizza un pool di
plasma di soggetti professionalmente non esposti; si aggiunge
il selenio in modo tale che le concentrazioni finali contengano
aumenti nell’intervallo 0– 200 μg/l.
I valori normali sono inferiori a 200 μg/l.
1.3. Risultati della discussione
I valori medi ottenuti per le femmine sono 86,5 (+/–30) e
per i maschi 92,8 (+/–32).
Il metodo proposto in questo studio è risultato lineare, in
quanto i valori rientrano in un intervallo molto ampio, ben oltre i limiti di riferimento riscontrati; preciso, perché sono state
effettuate 3 analisi di uno stesso campione in giorni differenti
ottenendo un valore medio sovrapponibile; rapido, perché si
deve fare solo una diluizione del campione senza lunghe e indaginose procedure di preparazione.
Inoltre, è una tecnica affidabile e specifica.
I valori ottenuti sono molto simili, come media, ad altri lavori già pubblicati e noti in letteratura (5–6).
1.4. Conclusioni
Il selenio è un metalloide o semimetallo, ossia un elemento
in grado di agire sia come metallo sia come non metallo.
In natura vi sono 6 isotopi stabili ed esiste in diverse forme
allotropiche (7).
Infatti, si trova sotto forma di polvere rosso, mentre come
massa vetrosa amorfa molto scura oppure sotto forma cristallina esagonale grigia e lucida tanto simile al metallo da essere
chiamata selenio “metallico”.
14
Capitolo I
Il selenio, come la maggior parte dei suoi composti, in concentrazioni elevate è tossico e risulta più velenoso dell’arsenico
(8).
L’intossicazione è determinata, generalmente, da inalazioni
di gas industriali in soggetti professionalmente esposti e causa
cardiopatia, epatopatia, ipertensione, infezioni polmonari, disturbi gastrointestinali e, in dosi eccessive, può portare anche
alla morte.
Anche in soggetti che vivono in zone dove il terreno è ricco
di selenio i sintomi sono analoghi con dermatiti, parestesie e
paresi (9).
Molto importante è, quindi, tenere sotto controllo le condizioni e le procedure lavorative che provocano polveri causando
effetti pericolosi sulla salute.
Tra le forme allotropiche del selenio, la più abbondante è il
selenio grigio o “metallico”.
Si trova sparso in natura alla concentrazione di 99,5%, associato soprattutto allo zolfo.
È la forma termodinamicamente stabile ottenuta dall’elemento fuso, nella quale tendono a trasformarsi tutte le altre.
Il bario selenito ha l’aspetto di una polvere cristallina bianca
e viene usato soprattutto nell’industria del vetro per colorare
o decolorare il vetro stesso, perché neutralizza il colore verde
provocato dalle impurità di ferro.
Il selenito di bario viene preferito per la produzione di vetro
particolare con alto indice di rifrazione (10).
Il biossido di selenio è un solido polimerico bianco, stabile,
con proprietà acide.
È utilizzato nella chimica organica come agente ossidante
per la sintesi di cortisone oppure come agente antiossidante per
la preparazione di oli lubrificanti.
La propensione del selenio a passare dallo stato tetravalente a quello esavalente oppure ad essere presente in entrambi
questi stati determina molte difficoltà nei processi chimici per
rendere nuovamente disponibile questo elemento.
Selenio
15
1.5. Bibliografia
1. Arnaud J., Ducros V., Guillelmin C., Vidailhet M., Wilke B.C., Selenium
glutathione peroxidase and lipid peroxidation products before and after
selenium supplementation, Clin.Chem. Acta, 1998.
2. Pleban P.A., Munitami A., Beachim J., Determination of selenium
concentration and glutathione peroxidase activity in plasma and
erythrocytes, Clin. Chem, 2002.
3. Cornelis R., Versieck J., Normal levels of trace elements in human blood
or serum, Anal. Chim. Acta, 2005.
4. Kamade T., Yamamoto, Use of the transitions elements to enhance sensitivity for selenium determination by graphite furnace atomic absorption
spectrophotometry combined with solvent extraction with APDC-MIBK
system, Talanta, 2000.
5. Pohl B., Determination of selenium normal levels in serum, Instruments
at Works, 2006.
6. Brodie K.G., Knowles M.B., Determination of selenium in blood by
graphite furnace atomic absorption spectrometry, J. Anal. At. Spectrom.
2006.
7. Clinton O.E., Determination of selenium in blood and plant material by
hydride generation and atomic absorption spectroscopy, Analyst, 2007.
8. Pierce F.D., Brown H.R., Inorganic interferences study of automated
arsenic and selenium determination with atomic absorption spectrometry, Analyst., 2008.
9. Smith A.E., Interferences in the determination of elements that form
volatile hydride with sodium borohydride using atomic absorption
spectrophotometry and the argon-hydrogen flame, Analyst., 2006.
Capitolo II
Valutazione sperimentale
sulla determinazione del cross–link
del piridinio attraverso la cromatografia
liquida ad alta pressione
La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) rappresenta la
tecnica che più si avvicina ad un sistema cromatografico ideale. È un
metodo di separazione di miscele su colonne riempite con piccole
particelle mediante eluizione con un liquido sotto pressione. HPLC
è la forma di cromatografia liquida su colonna distinta da capacità e
celerità di separazione elevate attraverso l’utilizzo di alte pressioni.
Inoltre, ha grande versatilità per consentire di separare, rivelare e dosare con grande efficienza sostanze non sufficientemente termostabili
e composti non volatili, altrimenti non realizzabili. Tali caratteristiche
le permettono un largo impiego nel dosaggio e nella esecuzione di
molte sostanze nei liquidi biologici. In questo lavoro sono state prese
in considerazione due marcatori biochimici di attività osteoclastica,
idrossilisilpiridinolina e lisilpiridinolina, validi nella identificazione di
patologie neoplastiche ossee. Tra i markers osteoclastici, questi due
presentano maggiore specificità e risultano gli indicatori di riassorbimento osseo più utilizzati.
High pressare liquid chromatography is a technique which closely resembles an ideal chromatographic procedure. It involves the separation
of mixture on columns filled with small particles by elution with an
under–pressure fluid. HPLC is characterized by a high effectiveness and
rapidity of separation, mainly due to the employment of high pressures.
Its significant versatility, moreover, allows the separation, the detection,
17
18
Capitolo II
and the dosage of substances which are not sufficiently termostable and of non volatile compounds. These features allow its wide
employment in the dosage and the detection of many substance in
biological fluids. In this work, the Authors assess two biochemical
markers of the osteoclastic activity, hydroxylysilpyrridinoline and
lysilpyrridinoline, for the detection of osseous neoplastic diseases. In
comparison to the other osteoclastic markers, they present a higher
specificity and turn out to be the most commonly used markers of
reabsorption.
1.1. Introduzione
La sigla HPLC definisce la forma di cromatografia liquida su
colonna, caratterizzata da capacità e da velocità di separazione
elevate con l’uso di alte pressioni (1).
Come ogni altro tipo di cromatografia, anche quella liquida
ad alta pressione, ha due fasi: la fase mobile, o liquida, che è
costituita dal solvente che scorre attraverso la fase stazionaria,
che è la colonna cromatografica riempita di particelle solide,
generalmente gel di silice dal diametro di 10 μm.
Quindi, essa descrive la tecnica che separa miscele su colonne riempite con queste particelle mediante eluizione con liquido sotto alta pressione.
HPLC è il metodo più efficace per l’identificazione e la determinazione quantitativa di specifiche sostanze o gruppi di sostanze in campioni biologici.
È costituita da:
–
–
–
–
–
una pompa che regola e mantiene il flusso della fase mobile;
una colonna cromatografica, generalmente in acciaio;
un dispositivo di iniezione del campione;
un rivelatore;
un registratore.
Il componente che più caratterizza e decide la qualità delle
prestazioni in HPLC è il sistema di pompaggio.
