4. duplicazione del DNA - Progetto e

25/03/15
4. La DUPLICAZIONE del DNA contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale;1 non è
consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale
IL DNA E‘IL MATERIALE GENETICO EREDITARIO Esperimento di Griffith Le cellule ba*eriche avevano ricevuto le istruzioni gene5che per trasformarsi in cellule ba0eriche patogene e quindi causare la polmonite. Era una trasformazione permanente, cioè ereditabile, poiché i ba*eri delle generazioni discenden5 dalle cellule ba*eriche che avevano subito trasformazioni provocavano anch’essi la polmonite. Quindi esiste qualcosa che si trasme*e da un organismo all’altro portando cara*eris5che ereditarie……… Ma cos’è?
2 1
25/03/15
Esperimento di Avery Frazionamento dell’estra0o in classi molecolari E’ il DNA che porta l’informazione ereditabile 3 Il DNA, prima di essere trasmesso da una cellula alle cellule figlie, deve essere duplicato Il processo di duplicazione del DNA è detto replicazione e si verifica prima che la cellula si divida. 4 2
25/03/15
Ognuno dei frammenF di DNA può fungere da stampo Ogni frammento con5ene una sequenza nucleo5dica complementare a quella del filamento opposto 5 Si o0engono 2 doppie eliche complete iden9che alle preceden9 6 3
25/03/15
La replicazione del DNA è semiconservaFva: elica madre + elica figlia di nuova sintesi 7 Esperimento di Meselson-­‐Stahl centrifugazioni in gradiente di densità del DNA (in soluzione di CsCl) Crescita batteri in terreno di coltura ricco dell'isotopo pesante 15N (DNA pesante). Batteri trasferiti in un nuovo terreno in cui cioè era presente 14N anziché 15N (DNA più leggero). Trascorso tempo necessario per la successiva replicazione del DNA è ripetuta la procedura (due bande di DNA) 8 4
25/03/15
Replicazione conservativa
Replicazione distributiva
9 Replicazione semi-conservativa
10 5
25/03/15
La sintesi del DNA parte dalle ORIGINI DI REPLICAZIONE 11 dalle origini di replicazione hanno inizio 2 FORCELLE di REPLICAZIONE v di replicazione = 50 nucleotidi/sec DNA umano= 150 x 106 bp Tempo replicazione = 0,02 x 150 x 106 = 800 ore 12 6
25/03/15
Replicazione avviene in tempo molto più breve Come mai fase S dura 8 ore in una cellula animale? Durante fase S si attivano varie unità di replicazione (da 20 a 80) anche se non tutte insieme Le origini di Replicazione si trovano ad intervalli di 30 – 300 bp Una forcella si arresta quando ne trova un’altra che procede in senso opposto 13 14 7
25/03/15
Meccanismi di replicazione -­‐ Eliche si devono separare in modo che basi complementari vengano allineate (elicasi) 15 Meccanismi di replicazione -­‐ La DNA polimerasi catalizza l’aggiunta di un deossiribonucleotide trifosfato all’estremità 3’-­‐
OH 16 8
25/03/15
Alla forcella replicativa i due filamenti di DNA hanno polarità opposta DNA polimerasi catalizza solo in direzione 5’ – 3’ 17 Se entrambe le catene fossero sintetizzate in maniera continua nella direzione in cui si muove la forcella di replicazione, si dovrebbe verificare una sintesi in senso 3' -­‐> 5'; la spiegazione di come ciò non avvenga fu provata da Okazaki. Filamento guida Filamento lento una delle due catene verrà sintetizzata in modo continuo, e sarà la cosiddetta catena veloce (o catena leader), la cui sintesi nel senso 5' -­‐> 3' procede nella stessa direzione della forcella di replicazione; l'altra catena è sintetizzata in maniera discontinua, detta perciò catena lenta (o catena ritardata), ed è quella in cui la sintesi in senso 5' -­‐>3' procede in direzione opposta all'avanzamento della forcella di replicazione, sotto forma di frammenti di Okazaki, che verranno uniti successivamente dalla DNA ligasi. 18 9
25/03/15
La forcella di replicazione è ASIMMETRICA
-­‐  Un filamento è sintetizzato in maniera continua : FILAMENTO GUIDA -­‐  Un filamento è sintetizzato a frammenti (frammenti di Okazaki): FILAMENTO LENTO 19 DNA polimerasi
(dNMP)n + dNTP ———→ (dNMP)n+1 + PPi
20 10
25/03/15
La struttura della DNA polimerasi assomiglia ad una mano Il “palmo”contiene il sito catalitico: controlla correttezza appaiamento basi le “dita” trattengono i dNTP nella corretta posizione per la reazione catalitica; provocano curvatura stampo per esporre solo la prima base dopo l’innesco Il “pollice” stabilizza complesso tra DNA polimeasi e substrato 21 Come la DNA polimerasi discrimina tra desossinucleotidi
trifosfato e ribonucleotidi trifosfato
La DNA polimerasi non può utilizzare gli rNTP
Sebbene gli rNTP siano nella cellula 10 volte più concentrati dei dNTP, essi sono incorporati
ad una velocità 1,000 volte più bassa rispetto ai dNTP.
22 11
25/03/15
nel Filamento discontinuo (lento) si possono formare dei ripiegamenti (strutture a
forcina), quindi per far in modo che la DNA pol possa lavorare
Intervengono Single Strand Binding Protein (SSBP) stabilizzano il singolo
filamento di DNA
23 DNA polimerasi: problemi (e soluzioni)
24 12
25/03/15
Le nuove catene di DNA per essere sintetizzate hanno bisogno di un INNESCO (PRIMER) di RNA di ≈ 10 basi sintetizzato dalla PRIMASI La PRIMASI al contrario della polimerasi è in grado di iniziare una nuova catena unendo due ribonucleotidi trifosfati. 25 -­‐  Filamento guida: 1 solo primer -­‐ Filamento lento: 1 primer ogni frammento Per avere filamento di DNA continuo: -­‐  nucleasi: degrada RNA -­‐  polimerasi riparativa: DNA al posto di RNA -­‐  DNA ligasi unisce il P in 5’ di un frammento con l’OH in 3’ dell’altro 26 13
25/03/15
scorre sul DNA e lo aggancia allo stampo e ne aumenta la processività 27 Per duplicare il DNA occorrono anche altre proteine -­‐  Elicasi: separa i 2 filamenti con consumo di ATP -­‐  Proteine che legano il filamento singolo -­‐  Morsetto scorrevole: mantiene la polimerasi salda sullo stampo -­‐  fissatore del morsetto: chiude il morsetto scorrevole attorno al DNA REPLISOMA 28 14
25/03/15
Come si replicano le parti terminali dei cromosomi? 1. 
Sintesi DNA si arresta poco prima che finisca lo stampo 2.  Si aggiungono sequenze ripetitive a 3’ dello stampo 3.  La telomerasi ha un tratto RNA complementare alla sequenza ripetitiva 4.  Sintetizza DNA telomerico 29 La DNA poilmerasi si autocorregge
1 errore ogni 107 bp
30 15
25/03/15
La DNA polimerasi presenta siti separati
per la sintesi del DNA e per l’attività di autocorrezione
1. viene aggiunto nucleotide sbagliato 2. DNA di nuova sintesi NON appaiato allo stampo 3. Cambiamento conformazione polimerasi 4. Sito E rimuove il nucleotide legato per ultimo 31 L’attività di autocorrezione spiega perché sintesi avviene solo in direzione 5’ – 3’
32 16
25/03/15
Gli errori durante la replicazione del DNA vanno corretti per evitare una mutazione Se riparazione sul filamento stampo: Mutazione persiste Se riparazione sul filamento nuovo: Mutazione evitata 33 Correttore di appaiamento del DNA Distingue filamento sintetizzato per ultimo
(dove si trova l’errore) da quello vecchio
grazie a delle interruzioni (nick) presenti nei
filamenti lenti che durano molto poco:
correzione è molto veloce
34 17
25/03/15
Riparazione del DNA avviene in 3 fasi ESCISSIONE Tratto danneggiato reciso da NUCLEASI RISINTESI All’ OH in 3’ del filamento tagliato si lega una DNA polimerasi di riparazione SALDATURA Da parte della LIGASI che unisce i frammenti 35 Riparo per escissione di basi (BER) 36 18
25/03/15
Riparo per escissione di nucleotidi (NER) sistema di riparazione codificato dai geni uvr (uvrA, uvrB e uvrC). I cui prodotti formano complesso UvrABC-­‐endonucleasi. Piegatura DNA
Taglio a monte del
sito di distorsione
37 Rotture DNA su doppio filamento Ricongiunzione NON omologa delle estremità Riavvicinamento per
mezzo di enzimi appositi
38 19
25/03/15
Le DNA polimerasi sono specializzate in ruoli differenti all’interno della cellula
39 Procarioti il cromosoma è circolare la replicazione comincia in un solo punto sul DNA circolare la duplicazione avviene nel citoplasma Eucarioti i cromosomi sono lineari e molto lunghi i cromosomi possiedono numerose origini di replicazione la duplicazione avviene nel nucleo 40 20
25/03/15
DIFFERENZE NELLA REPLICAZIONE TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI PROCARIOTI EUCARIOTI Non hanno nucleo Hanno il nucleo Il DNA è circolare Il DNA è lineare Enzima principale della replicazione: DNA-­‐polimerasi III DNA-­‐polimerasi alfa e delta Molte bolle di replicazione 1 sola bolla di replicazione 1/2 forcelle di replicazione 2 forcelle di replicazione (uni/bidirezionale) 41 21