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Relazione scientifica short term mobility ZIFARELLI
Lo scopo di questo progetto di short term mobility era di apprendere una innovativa tecnica di
elettrofisiologia grazie alla quale è possibile studiare canali ionici e trasportatori espressi in
organelli intracellulari, in particolare endosomi e lisosomi. L’obiettivo è stato raggiunto con pieno
successo. Inoltre la permanenza nel laboratorio del Prof. Xu ha consentito di stabilire una
collaborazione con uno dei gruppi di ricerca più avanzati e affermati nel campo del trasporto ionico
attraverso endo-lisosomi.
Alla base della tecnica vi è l’incubazione di cellule di mammifero con la vacuolina, una sostanza
chimica che è in grado di allargare i corpuscoli endo-lisosomiali fino a 5-6 micron in maniera tale
che siano visibili con un microscopio ottico e un obiettivo di ingrandimento 40X. Il meccanismo di
azione della vacuolina al momento non è ancora noto. Con questo trattamento diventa comunque
possibile compiere esperimenti di patch-clamp su corpuscoli endo-lisosomiali e studiare quindi
proteine di trasporto endogene o espresse eterologamente.
Un aspetto importante di questo tipo di esperimenti è la rottura della membrana plasmatica in
maniera tale che i corpuscoli endo-lisosomiali siano liberati dall’ambiente cellulare ed accessibili
agli esperimenti di patch-clamp. La rottura viene eseguita con una pipetta da patch che taglia la
membrana plasmatica in prossimità del bordo della cellula. La rottura non è netta ma avviene
compiendo piccoli movimenti con la pipetta attaccata alla membrana. I movimenti devono essere
decisi ma non eccessivamente bruschi in modo da non danneggiare gli endo-lisosomi e da fare in
modo che essi, anche se accessibili, rimangano confinati in prossimità della cellula dove sono
meglio visibili e più facile è l’approccio con una nuova pipetta da patch. Infatti la pipetta usata per
liberare gli endo-lisosomi viene sostituita con una nuova pipetta e sugli endo-lisosomi liberati si
possono compiere esperimenti di patch-clamp in maniera analoga a quanto si fa normalmente con
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cellule intatte. Questa fase richiede una considerevole esperienza e manualità che possono essere
acquisite solo con una pratica costante e adeguatamente prolungata.
La preparazione delle cellule con endo-lisosomi allargati, in particolare utilizzando cellule Hek e
Cos-1, e la liberazione degli endo-lisosomi dalle cellule è stata ripetuta diverse volte raggiungendo
una ottima manualità in questa che è una fase critica in questo tipo di esperimenti. Una volta liberati
dalla membrana plasmatica, sugli endo-lisosomi allargati viene applicata la tecnica del patch-clamp
in maniera analoga a quanto si fa su cellule intatte, stabilendo prima un cosiddetto giga-seal tra
pipetta e membrana e poi rompendo la membrana per ottenere accesso al lato interno della
membrana.
Un esempio di una misura di patch-clamp su un lisosoma di una cellula Cos-1 trasfettata con il
canale TRPML1 è rappresentata in figura 1. In questa misura è possibile osservare come l’attività
basale di TRPML1 dia origine a una corrente limitata che è difficile distinguere da correnti non
specifiche. La corrente viene però fortemente aumentata dall’agonista specifico ML-SA1
(Mucolipin Synthetic Agonist) che conferisce anche una specifica voltaggio dipendenza.
In conclusione, l’obiettivo del progetto di short term mobility, l’apprendimento degli elementi
fondamentali della tecnica di patch-clamp su endosomi e lisosomi è stato pienamente raggiunto. La
tecnica potrà quindi essere utilizzata nel laboratorio dello scrivente sia per studiare gli antiporti Cl/H+ ClC-5 e ClC-7, sia per studiare altre proteine localizzate in endo-lisosomi. A questo riguardo è
stato già raggiunto un importante risultato preliminare; è stata infatti verificata l’espressione di ClC5 (marcato con GFP) in vescicole endo-lisosomiali di cellule Cos-1 trattate con vacuolina (Fig. 2).
Questo suggerisce che l’antiporto ClC-5 può essere effettivamente studiato con questa tecnica anche
se a causa della mancanza di tempo non è stato possibile effettuare queste misure durante il
soggiorno presso il laboratorio del Prof. Xu.
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Inoltre, un ulteriore risultato della short term mobility è quella di aver stabilito una collaborazione
con uno dei gruppi di ricerca più avanzati e affermati nel campo del trasporto ionico attraverso
endo-lisosomi.
Legenda delle figure
Figura 1
Misure di patch-clamp su endo-lisosomi di cellule trasfettate con il canale TRPML-1 ottenute con
soluzione citoplasmatica contenente (in mM): 140 K-Gluconato, 4 NaCl, 1 EGTA, 2 Na2-ATP, 2
MgCl2, 0.39 CaCl2, and 10 Hepes (pH 7.2; concentrazione di calcio libero ∼100 nM). La soluzione
in pipetta conteneva (in mM): 145 NaCl, 5, KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Mes, 10 Hepes, and 10
glucosio (pH 4.6). La traccia in rosso mostra l’effetto dell’attivatore ML-SA1 (Mucolipin Synthetic
Agonist) a una concentrazione di 20 μM.
Figura 2
A) cellule Cos-1 trasfettate con 0.5 μg di DNA del canale TRPML1 e trattate overnight con 5 μM di
vacuolina.
B) immagine in fluorescenza delle stesse cellule mostrate in A). Il canale TRPML1 trasfettato è
infatti marcato con la sonda fluorescente rossa mCherry.
C) cellule Cos-1 trasfettate con 0.5 μg di DNA del trasportatore ClC-5 e trattate come in A).
D) immagine in fluorescenza delle stesse cellule mostrate in C). Il trasportatore ClC-5 trasfettato è
infatti marcato con la sonda fluorescente verde GFP.
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Figure 1
Whole endolysosome patch
TRPML-1 WT
ML-SA1 (Mucolipin Synthetic Agonist)
Figure 2
A
B
C
D