PCR - tandem | univr

Scientists with lab coats: Corso di
laboratorio Chimico-Biologico
Dott.ssa Valeria Berton
Università di Verona
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento)
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
Campione di DNA
Campione di tessuto / sangue
Isolare il DNA (ed eliminare il resto)
Prelevare una piccola quantità di tessuto / sangue (0,1 – 0,5 gr) e metterlo in una vial
Aggiungere lo stesso volume di Buffer di Lisi
EDTA
Tris pH 7.5
1% SDS
Chelante, sequestra gli ioni ed evita l’attivazione delle DNAsi
Sali per regolare acidità e osmolarità (variazioni di pH  i DNA perde la sua forma a doppio filamento)
Detergente per rompere le membrane cellulari
RNAsi
Per ottenere DNA puro
Distruggere (gentilmente) il tessuto con un mini-pestello
Attenzione, non deve essere troppo viscoso! Aggiungere Buffer di lisi se necessario
Centrifugare (12 - 14.000 rpm) per separare le componenti cellulari dal DNA
Prelevare il surnatante e aggiungere fenolo/cloroformio 1:1
Purifica il DNA dalle proteine cellulari
Campione di DNA
Mescolare
Centrifugare
Prelevare i surnatante e aggiungere isopropanolo
Mescolare
Centrifugare
Prelevare il surnatante e conservare il pellet
Lavare il pellet con etanolo 70-75%
Centrifugare
Prelevare il surnatante
Lasciare asciugare il pellet
Risospendere il pellet in H2O distillata o TE (con EDTA)
Controllo il DNA: spettrofotometro
Purezza
Concentrazione
Spettrofotometro: misura la radiazione assorbita da una materia (che è proporzionale alla massa della materia stessa)
I0: intensità iniziale
I1: intensità finale
I1/I0 = Trasmittanza
Assorbanza: A = ελ l M
Costante per ogni sostanza
Molarità (concentrazione)
Controllo il DNA: spettrofotometro
Grafico assorbanza del DNA puro
1,6
50 μg DNA / ml = 1 u.a. 260
assorbanza
Conc. μg DNA / ml = A 260 x 50 / 1 u.a.
5 μl di DNA
1000 μl
Diluizione: 200
A260 = 0,5
50 μg : 1 = x μg : 0,5
0
x μg = 0,5 x 50 / 1
lunghezza d’onda (nm)
Diluizione DNA?
25 x 200 = 5.000 μg DNA /ml
Controllo il DNA: spettrofotometro
DNA e proteine hanno un picco di assorbanza a lunghezze d’onda diverse
260/280: contaminazione da proteine
260/230: DNA contaminato da EDTA, fenolo
Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio
Valutazione approssimativa di: concentrazione, lunghezza e purezza del DNA
Il DNA in soluzione viene messo in un gel e viene sottoposto ad un campo elettrico
I gruppi fosfato dello scheletro del DNA sono carichi negativamente
In un campo elettrico il DNA migra verso il polo positivo
Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio
La polvere di agarosio viene sciolta in una soluzione tampone calda; si aggiunge un colorante fluorescente
La soluzione calda viene versata su un apposito supporto con un pettine
Man mano che la soluzione si solidifica, l’agarosio forma delle maglie
Più agarosio nella soluzione  maglie più strette  molecole lunghe di DNA non riusciranno ad attraversare le maglie
Meno agarosio nella soluzione  maglie più larghe  molecole lunghe di DNA passano più facilmente
La quantità (la percentuale) di agarosio nella soluzione va determinata per campioni di dimensioni diverse
Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio
Quando il gel è solidificato, si mette nella vasca elettroforetica
Si toglie il pettine  rimangono dei fori nel gel
Preparazione del campione di DNA: un’aliquota di DNA viene miscelata con
- saccarosio/glicerolo (per renderlo più denso)
- un colorante (per renderlo visibile)
Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio
Metto il campione di DNA in un pozzetto (e altri campioni negli altri)
Applico corrente elettrica
Attenzione all’orientamento del gel!
Posso seguire la corsa del gel grazie al colorante aggiunto
Il colorante fluorescente presente nel gel si lega al DNA
Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio
Posiziono il gel sopra ad un transilluminatore
 il colorante viene eccitato
 emette fluorescenza
DNA marker: riferimento del peso
DNA integro: unica banda, molto alta
DNA frammentato: «smear», striscio di bande
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento)
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
PCR: primers
Devono essere specifici
Lunghezza del primer: se corto  meno specifico
se lungo  più specifico, ma devono essere più puri
18-22 bp
Composizione: no ripetizioni interne, no omologie (AAATTTAAATTT)
primer ricchi di GC possono sostenere Temp di annealing più alte
Corrispondenza con la sequenza target: deve essere massima
tollerati mismatch, ma non al 3’
C o G in 3’ per favorire legame
Se la sequenza target è ignota?
Si confrontano sequenze omologhe per trovare le regioni più conservate (uguali in specie diverse)
PCR: primers
Software:
Primer Premier
AlleleID
Beacon Designer
PrimerPlex
Vector NTI Advance software
Primer BLAST
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
PCR: Polimerasi
Taq polimerasi Thermus aquaticus
Temp ottimale 75-80°C (1000 bp in meno di 10 sec a 72°C)
Emivita: 2 ore a 92.5°C
Non ha attività di proofreading (Pfu DNA polimerasi)
Utilizza ioni Mg++ come catalizzatori
La concentrazione di MgCl2 nella reazione è fondamentale
Basse concentrazioni  polimerasi meno attiva ma più specifica
Alte concentrazioni  polimerasi più attiva ma meno specifica
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
Nucleotidi
dNTPs (deossinucleotidi)
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
Aggiungere alla soluzione
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
Buffer
10-50mM Tris-HCl pH 8.3,
fino a 50mM KCl,
stabilizza il DNA durante l’amplificazione ma può diminuire la denaturazione
1.5mM o più di MgCl2
cofattore della polimerasi;
ma influenza la specificità dell’appaiamento
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
PCR
Denaturazione
Annealing (appaiamento dei primers)
Amplificazione
Denaturazione: equilibrio tra riuscire a denaturare
(separare) il DNA e non denaturare la Polimerasi
Annealing: i primer devono legarsi al DNA
Temp troppo alta  denatura il DNA  i primer non si legano
Temp troppo bassa  i primer si legano a sequenze non specifiche
La Temp alla quale il 50% dei primer si lega: AT = 2°C; CG = 4°C
Amplificazione: Temp ottimale per la Polimerasi (72-75°C)
PCR
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
Elettroforesi
Posiziono il gel sopra ad un transilluminatore  il colorante viene eccitato  emette fluorescenza
DNA non amplificato: unica banda, molto alta
Se conosco il peso del frammento amplificato con PCR:
Controllo la presenza di una banda all’altezza del peso corretto
Non vedo la banda corrispondente
Riprova (magari sbagliato un passaggio)
DNA
ladder 1
Diminuire la Temp di annealing (anche solo nei primi cicli)
Controllare la sequenza dei primer
Controllare la concentrazione dei primer (troppo bassa)
Aumentare il numero dei cicli
Il campione di DNA era troppo poco
Il campione di DNA era contaminato da impurità (durante l’estrazione)
La polimerasi non ha funzionato (controllare il buffer)
Se c’è la banda del controllo positivo e non del campione, potrebbe esserci un’interferenza da parte di
qualche sostanza presente nel campione
2
Smear / Bande multiple
Meno DNA campione
Aumentare la Temp di annealing (legame più specifico)
Controllare la sequenza e la lunghezza dei primer
Controllare la concentrazione dei primer (troppo alta)
Contaminazione con DNA esogeno (strumentazione, area di lavoro, operatore)
Banda nel controllo negativo
Cambiare tutte le soluzioni
Pulire la strumentazione
Lavorare in modo più attento
PCR
Molti componenti della PCR sono volatili e molto concentrati
Aliquote, conservazione a -20°C
Contaminazione della strumentazione
Set di strumenti diversi per ogni fase: preparazione delle mix, utilizzo post-PCR, caricamento del gel
Controlli!
Positivo: DNA che abbiamo visto funziona bene con i primers che sto per usare
Negativo: stessa preparazione dei campioni, ma non contiene DNA