tecniche di analisi biologiche - Digilander

TECNICHE DI ANALISI BIOLOGICHE
VENERDÍ 15.12.2006
Flow chart:
1. struttura cellulare;
2. genesi cellulare;
3. organizzazione cellulare;
4. compartimentazione cellulare;
5. struttura del d.n.a.;
6. topografia delle istruzioni presenti sul d.n.a.;
7. quali e quanti sono i geni;
8. junk d.n.a.;
9. importanza del junk d.n.a. nella caratterizzazione genotipica degli individui.
CELLULA: unità fondamentale degli organismi.
CARATTERISTICHE: circoscritta da una membrana semi impermeabile che racchiude il
citoplasma.
DIMENSIONI: dell’ordine dei μm.
LE CELLULE BATTERICHE O PROCARIOTI:
Batteri (dal greco baktétrion "bastoncino"), grande gruppo di organismi cellulari perlopiù
microscopici, privi di un nucleo distinto e caratterizzati da una modaloità di riproduzione
per divisione cellulare.
In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micron e hanno sviluppato gli
adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive. Si trovano in quasi tutti
gli ambienti: nell' acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti e perfino negli sbocchi idrotermali
delle profondità oceaniche. Alcuni proliferano sugli alimenti, mentre stabiliscono varie
forme di simbiosi con piante, animali e altri organismi.
Nello schema di classichificazione in cinque regni, i batteri costituiscono il regno dei
procraioti e si differenzisano dalle cellule di tutti gli altri organismi viventi, chiamati eucarioti,
per l'assenza di un nucleo delimitato da membrana.
Il materiale genetico della cellula batterica è costituito da un doppio filamento di DNA
circolare. In molti batteri sono, inoltre, presenti molecole di DNA accessorie e più piccole,
dette plasmidi, che generalmente portano geni non essenziali per la riproduzione del
batterio.
Sono note circa 200 specie di batteri patogeni, responsabili di numerose malattie dell'
uomo. Il grado di patogenicità può variare a seconda della virulenza della specie batterica
e delle condizioni generali dell' organsmo ospite. Fra le melattie batteriche più gravi vi
sono colera, gangrena gassosa, lebbra, peste, dissenteria, tubercolosi, sifilide, febbre
tifoide, difterite, brucellosi e polmonite. Prima della scoperta dei virus, i batteri erano
considerati gli agenti di tutte le malattie infettive.
Sono tuttavia altrettanto numerosi anche i batteri utili:i batteri decompositori, ad esempio,
trasformano le sostanze complesse degli organismi morti in sostanze semplici e in sali
minerali che ritornano in ciclo e possono essere utilizzati da altri organismi.
Altri batteri sono in grado di trasformare l'azoto presente nell'aria in forma utilizzabile dalle
piante con le quali vivono in simbiosi. Questo processo prende il nome di fissazione
dell'azoto.
Batteri utili vivono nello stomaco dei ruminanti permettendo loro di digerire le fibre di cui si
nutrono
Il formaggio, il burro, lo yogurt sono prodotti che derivano dalla fermentazione del latte ad
opera di certi tipi di batteri.
Con l'aiuto dei batteri possono essere prodotte su scala industriale numerose sostanze di
notevole importanza come l'alcol e gli antibiotici.
L'impiego dei batteri o di altri microrganismi nella produzione alimentare si chiama
biotecnologia.
LE CELLULE EUCARIOTICHE:
La differenza tra procarioti ed eucarioti è molto netta, al punto che non si conoscono
specie viventi con strutture intermedie.
I procarioti sono tutti unicellulari e all'interno dell'unica cellula che li compone non si
osserva nessuna compartimentazione dovuta a membrane interne: anche il materiale
genetico si trova libero nel citoplasma.
Tra gli eucarioti, invece, oltre a organismi unicellulari, si trovano tutti gli organismi
pluricellulari. Nelle cellule che li compongono si possono distinguere sia un vero e proprio
nucleo delimitato da una membrana sia alcuni organelli, anch'essi delimitati da una
membrana, che hanno morfologia e funzionalità proprie e dotati di una molecola di DNA
codificante un ristretto numero di proteine. Tali organelli si distinguono in mitocondri e
cloroplasti. I mitocondri producono energia, che viene immaganizzata nella molecola nota
come ATP, ossidando le sostanze organiche fino a ottenere anidride carbonica e acqua,
mediante l'ossigeno molecolare, secondo una serie di processi metabolici denominati, nel
complesso, respirazione cellulare. I cloroplasti sono gli organelli responsabili della
fotosintesi nelle piante.
Gli eucarioti sono divisi in due regni distinti: Archea, a cui appartengono gli archeobatteri,
ed Eubacteria, a cui appartengono i batteri veri e propri, detti anche eubatteri. La
distinzione degli archeobatteri dai batteri si basa su importanti differenze biochimiche e
molecolari, tra le quali la mancanza di acido muramico nella parete dalla cellula degli
archeobatteri. A differenza degli eubatteri, gli archeo batteri si rinvengono spesso in
ambienti caratterizzati da valori estremi di salinità, temperatura e anossia che, secondo
alcuni scienziati, riprodurebbero le primitive condizioni in cui si sarebbe originata la vita
sulla Terra.
Elementi centrali della nuova ipotesi sono la capacità di uno dei due microrganismi di
produrre idrogeno e la dipendenza dell'altro all'altro idrogeno prodotto. La comparsa di
fenomeni di endosimbiosi è inoltre conseguente e non propedeutica all' interazione stretta
tra i metabolismi dei due microrganismi contraenti. La teoria spiegherebbe perchè nel
genoma degli eucarioti ci siano anche geni non direttamente connessi alla respirazione
(ad esempio quelli relativi alle proteine di membrana che permettono l'ingresso nella
cellula delle sostanze necessarie per la respirazione) e renderebbe ragione della presenza
di geni di natura mitocondriale in quegli eucarioti, ancora poco noti quando Lynn Margulis
elaborò la teoria endosimbiotica, che sono privi di mitocondri.
Il corpo umano è composto da circa 1014 cellule.
MITOSI: divisione cellulare che produce due cellule identiche con lo stesso genotipo,
generate da una singola cellula. Questo termine viene utilizzato appunto per le cellule
eucariotiche, mentre per i batteri il termine che viene utilizzato è FISSIONE CELLULARE.
Il processo operato per la produzione di proteine è:
D.N.A.
TRASCRIZIONE
m R.N.A.
TRADUZIONE
PROTEINE
Le proteine possono essere definite come macromolecole oppure polimeri naturali.
Sono costituite da venti amminoacidi naturali e possono essere composte di 100 fino 1000
aa, che conferiscono alla proteina una struttura stereochimica ben definita.
STRUTTURA PRIMARIA
STR. SECONDARIA
STR. TERZIARIA
STR.
QUATERNARIA.
La complessità strutturale e funzionale delle cellule è dovuta alla presenza delle proteine
appunto.
LE FUNZIONI PROTEICHE SONO:
1. ENZIMATIHE;
2. FUNZIONANO DA MESSAGGERI;
3. STRUTTURALI.
Il D.N.A. è costituito da una doppia elica, che corre dalla direzione 5’ alla 3’ e viceversa,
tenuta insieme dall’appaiamento delle basi nucleotidiche che formano tra di loro legami
idrogeno.
La composizione del d.n.a. è di quattro nucleotidi: ADENINA, GUANINA, CITOSINA e
TIMINA.
La regola rappresentata nell’immagine su esposta è detta regola di Chalgov.
Un singolo nucleotide è costituito da fosfato + ribosio + nucleoside.
Il diametro del d.n.a. è di 5 μm.
La distanza tra i due filamenti di d.n.a è di 6 nm.
La lunghezza totale di d.n.a. all’interno di un uomo è di diciotto metri.
Le molecole di d.n.a. subiscono un iper avvolgimento grazie all’interazione con gli istoni:
H1, H2A, H2B, H3 e H4.
In media si avvolgono 146 aa attorno agli ottametri composti di coppie di H2A, H2B, H3 e H4,
mentre l’istone H1 si trova tra un nucleosoma (composto da un ottametro e dal d.n.a.
avvolto su di esso) ed il successivo e viene detto istone spacer, perché si trova appunto
sul d.n.a. spaziatore.
SISTEMA DI COLLANA DI PERLE:
Gli stessi nucleosomi si avvolgono assumendo una struttura detta a SOLENOIDE, il ci
diametro è di 30 nm.
Il solenoide si attorciglia su sé stesso diventando cromatina, che ha un diametro di 200 nm.
La cromatina i avvolge dando forma al CROMOSOMA, il cui singolo CROMATIODIO,
durante la fase M, ha un diametro di 700 nm.
In interfase la maggior parte della cromatina si presenta con un diametro di 30 nm.
Specie diverse si sono differenziate grazie al numero totale dei cromosomi all’interno del
nucleo cellulare (il numero di cromosomi è detto cariotipo).
Tendenzialmente il cariotipo in natura ha un numero pari.
In H. sapiens il cariotipo consta di 46 n (cromosomi).
Il cromosoma è composto di un terzo da d.n.a. e di due terzi da proteine.
La struttura del cromosoma prende il nome di CROMATINA, che è composta di
EUCROMATINA ed ETEROCROMATINA.
L’eterocromatina si colora di un colore scuro ed è costituita dalla parte di cromosomi che
non operano sintesi proteica, mentre l’eucromatina non si colora ed è la parte che
contiene la maggior quantità di informazioni necessarie per la sintesi proteica.
I cromosomi interagiscono con la membrana nucleare, quindi con i pori, in modo che
possano essere sia trascritti sia duplicati; esistono quindi zone o domini intranucleari
organizzati.
Il CICLO CELLULARE si suddivide in due fasi principali a loro volta suddivise in più fasi:
1. CRESCITA CELLULARE:
•
G1 = GAP 1, fase in cui vengono prodotte le proteine;
•
S = fase di SINTESI, cioè viene duplicato il d.n.a.;
•
G2 = GAP 2, fase di preparazione per la divisione;
2. FASE MITOTICA:
•
La cellula suddivide due nuclei;
•
Citokinesi.
SCAFFOLD: IMPALCATURA.
S.A.R.: scaffold attachment region. Sono le aree specifiche in cui il d.n.a. compatta
maggiormente la sua struttura.
LEZIONE N. 2
Il dna si può presentare come dna a doppia elica o double strand (ds) ovvero come dna a
singola elica o single strand (ss).
Il dna può essere suddiviso in due tipologie distinte:
1. dna codificante, cioè il gene vero e proprio; le parti del cromosoma contenente i
geni sono definiti loci;
2. dna non codificante.
I geni in media anno una sequenza di 103 – 104 bp (base pair) ed iniziano con un codone
di inizio “ATG”, terminando con un codone terminale “TGA” etc.
Il verso del gene è parallelo al verso del dna contenuto all’interno dei cromosomi stessi,
cioè 5’ ATG --------------TGA 3’.
5’
sequenze regolatrici
3’
sequenze regolatrici
locus
a monte
a valle
ATG
TGA
All’interno dei loci sono presenti introni (sequenze non codificanti) ed esoni (sequenze
codificanti).
Il genoma aploide umano ha dimensioni dell’ordine di grandezza di 3 * 109 bp.
Il numerosi geni stimati è di 3*104. Il 90% del nostro genoma è composto da sequenze non
codificanti. Questo comporta il cosiddetto paradosso del valore C, che indica il contenuto
genomico.
I geni sono carenti nelle regioni terminali dei telomeri e centrali dei cromosomi, dette
centromeri.
I geni più frequenti codificano per:
•
dnasi;
•
kinasi;
•
recettori;
•
citoscheletro.
I geni sono quindi suddivisibili in due categorie:
•
housekeaping genes o geni costitutivi, che sono attivi in tutti i tessuti e codificano
per proteine essenziali per il normale funzionamento delle cellule. Se vengono
inattivati la cellula muore;
•
inducile genes o geni inducubili, che vengono attivati a seconda dei fattori
ambientali, differenziativi o cronologici.
Il dna extragenico non è codificante e si può suddividere in:
•
sequenze singole, che sono presenti in unica copia;
•
sequenze ripetute, che sono presenti in molteplice copia, spesso sono organizzati
in tandem.
Inventory of a eukaryotic genome
Moderately repetitive DNA
„
Functional
„
„
„
„
rRNA genes (250 cop ies)
tRNA genes (50 sites with 10– 100
cop ies each in hu man )
his tone genes in many species
„
„
„
„
Without known function
„
„
„
„
„
„
„
„
„
„
1–5 kb long
10–10 00 0 copies per genome
pseudogenes
composed of repeats of up to 13 bp
~100s of kb long
~ 106 copies/genome
most of the heterochromatin around
the centromere
telomeres
„
long interspersed elements
(LINEs)
„
„
Alu is an examp le (some func tion in
gene reg ulation)
200–30 0 bp long
100 000's of copies (300 000 Alu)
sc at tered locati ons (not in tandem
repeats )
composed of repeats of 14–500 bp
segments
1–5 kb long
many different ones
scattered throughout the genome
microsatellites
„
short interspersed elements
(SINEs)
„
minisatellites
e.g. actin, glo bin
tandem gene family arrays
„
„
„
dispersed gene families
„
„
Highly repetitive DNA
„
contain a short repeat unit (typically
6 bp: TTAGGG in human genome,
TTGGGG in Paramecium, TAGGG in
trypanosomes, TTTAGGG in
Arabidopsis)
250–1 000 repeats at the ends of
each chromosome
Durante la duplicazione del dna capita che vengano fatti alcuni errori di copiatura durante
l’inserimento delle basi sul filamento di nuova generazione.
Grandi sequenze non codificanti dovrebbero funzionare da tamponi contro le mutazioni.
Il polimorfismo (cioè la differenza) dei loci risulta quindi essere molto importante,
soprattutto per quanto riguarda le sequenze on codificanti.
Nelle sequenze tandem è più facile sbagliare durante la copiatura.
Mutazioni all’interno delle cellule germinali sono ereditate
Per comprendere se un individuo è omozigote od eterozigote per un determinato locus
bisogna sfruttare il processo elettroforetico (fingerprint).
Types of genetic differences between people
Differences (misspellings in our book) in DNA segments between any two
persons can be used as genetic markers, which are fragments of DNA
that can be distinguished from one another because of differences in their
nucleotide sequences.
Types:
1.
2.
3.
Single Nucleotide Polymorphisms : also known as SNPs. Are a single
base pair change in a single strand of DNA. These are the most
prevelant form of differences between any two individuals.
Minisatellites: 10-100 nucleotides repeated several times in tandem;
bordered by unique DNA sequences. Variable Number Tandem
Repeats (VNTR) is an example. There are about 50,000 VNTRs in
the human genome.
Microsatellites: also called Short Tandem Repeats (STRs). Similar to
Minisatellites but sequence repeats are sm aller. Examples are tetraand di-nucleotide sequence repeats . . . .