Editing dell`RNA

Uopv^i
P'^f'SA ^ 9 I
SEZONE IIIHECCANISHI 01 ESPRESSIONE CENICA
LARKY SIMPSON
Howard Hughes Medical Institute and Departments
of Molecular, Cellular and Developmental Biology
and Medical Microbiology and Immunology
University of California al Los Angeles
Los Angeles,,-! USA
L'espressione 'editing deU'RNA' e usota
per descrivere una serie di fenomeni
mediante i quali k sequenze degli mRNA,
degli rRNA e dei tPNA vengono modificate
dope la trascrizione. I diversi tipi di editing
de//'RNA voriono dairmserzione o de/ezione
di uridina (U) o citoana (C) nelle regioni
codificanti gli mRNA mitocondriali
alia sostJtuzione di specifid residui di citosina
con residui di uridina negli mRNA mitocondriali
delle piante, fine alia sostituzione di specifici
residui di adenina (A) con residui di inosina (I)
negli mRNA codificati net nudeo delle cellule
dei mammiferi. Le modificazioni sono spesso
Editing dell'RNA
regelate e- hanno significative conseguenze
fenotipiche poiche introducono un ukeriore
elemento di versatil'ita nei numeroa
meccanismi di modulazione deU'espressione
genica e delta sintesi proteica operant!
nel contesto di ogni cellula eucariotica.
rimentali cbe indicano che la sequenza nucleotidica degli
mRNA puo essere modificata in modo consistente dope la
trascrizione; questo fenomeno e noto con il nome di editing
dell'RNA. Inizialmente questirisultatibanno spinto alcuni
Una delle assunzioni di base della genetica molecolare e che ricercatori a mettete in discussione il dogma centrale della
la sequenza nucleotidica dell'RNA messaggero (mRNA) sia genetica molecolare, secondo cui I'infontiazione genetica si
una copia perfetta della sequenza del comspondente DNA, tiasferisce dal DNA all'RNA e vicevetsa, e dall'RNA alle
come conseguenza dellaregoladeU'appaiamento delle basi. proteine. Infatti, poiche rinformazione genetica per la seLa prima sfida a questa idea e venuta dalla scoperta delle quenza cambia negli mRNA, la sequenza amminoacidica
sequenze non codificanti, contenute all'intenio dei geni delle proteine non sembrava essere codificata dagli acidi
degli organism! superiori, cbe vengono rimosse con preci- nucleic! deU'organismo. Oggi questirisultatipossooo essere
sione dall'mRNA mentre i fiammenti codificanti RNA, spiegati in termini di un modello cbe non contraddice il
detti esonl, vengonoriassemblatiper costituire la sequenza dogma centrale ma che mostra catatteristiche nuove e intecodificante completa. Questa scoperta, in realta, non i in ressanti.
contraddizione con il principio che le sequenze di mRNA
Anche altri esempi di modificazioni della sequenza degli
siano una copia del DNA conispondente, in quanto gli esoni RNA non codificate dagli acidi nucleici, rilevati in altri
sono effettivamente delle copie perfette.
organismi, sono stati denominati editing dell'RNA, sebbene
Tuttavia dalla meta degli aimi Ottanta, in seguito a espe- i meccanismi sembrino essere piuttosto diversi. In alcuni
rimenli compiuti su un ahtico givppo di protozoi flagellati casi, la sito-specificita degli eventi di editing puo essere
paiassiti, detti cinetoplastidi, sono state ottenute prove spe- spiegata assumendo che esistano alcune proteine capaci di
La scoperta dell'editing dell'RNA e II dogma
centrale della genetica molecolare
PARTE nuMA / OMCINE ED EVOLUZIONE DEUA VITA
c
riconoscere specifiche seqlienze o sttutture dell'RNA, ma in mato Phytomonas. Di fatto, i primi lavori sui tripanosomi
altri casi la sito-specificita e ancora un mistero.
sono stati condotti in gran parte da medici inleressati a
queste malattie. Comunque, molte specie di tripanosomi
sono parassiti solo degli insetti e non bannorilevanzadal
punto di vista medico; altre invece sono parassite sia degli
insetti sia dei veitebrati.
Una storia personale dello studio dell'editing
dell'RNA nei tripanosomi
I tripanosomi sono afTascinanti per i moderai biologi cellulari e molecolari in quanto rappresentano una delle plu
I tripanosomi appaitengono a un vasto gtuppo di protozoi primitive linee di discendenza delle cellule eucarioiiche.
parassiti noti come protozoi cinetoplastidi. II termine tripa- Probabilmente e per quesbi ragione che possiedono una
nosoma o iripanosomatide e in efTetti il nome delle cellule serie di caraneristiche dawero insolite, che non si risconche, aU'intemo della famiglia, appartengono al genere trano in altre cellule eucariotiche. Per esempio, i tripanosoTrypanosoma, ma viene ampiamente adoperato per descri- mi hanno un solo mitocondrio che contiene un tipo singovere qualunque protozoo cinetoplastide. II nome cinetopla- lare di DNA mitocondriale nolo come DNA cineioplastidistide scaturisce dalle osservazioni dei primi studiosi che co. Tutti gli organismi eucarioti unicellulari odiemi, i cui
avevano rilevato un piccolo granulo, o cinetoplasto, alia anienati si originarono prima di quelli dei tripanosomi (cobase del flagello se le cellule venivano trattate con certi me per esempio Ciardia o Trichomonas), mancano di micolotanti. Inrealtail cinetoplasto rappresenta una potzione tocondri e quindi non utilizzano ossigeno. t. possibile che la
dell'imico e complesso mitocondrio presente in questo tipo linea evolutiva da cui, circa un miliardo di anni fa, si sono
di cellule; esso contiene una enoime massa compatta di originali i protozoi flagellati euglenozoi (comprendente i
DNA mitocondriale, che e proprio cio che veniva marcato protozoi cinetoplastidi ed Euglena, un protozoo flagellato
verde) fosse streltamente correlata a quella cellula ancesiracon la colorazione.
I tripanosomi sono repellenti e affascinanti alio stesso le primitiva che inglobo una cellula balterica aerobia, dando
tempo. Molte specie sono pericolosi parassiti dell'uomo, origine all'organulo intracellulare obbligato oggi nolo con il
ingrado di causare malattie come il morbo di Chagas, la nome di mitocondrio.
malattia del soimo afncana e la leishmaniosi, un'ulcetazione della pelle cbe in alcuni casi puo estendersi a livello della
bocca e del naso causando danfig.l. Minicircoli di DNA
II DNA del cinetoplasto
ni considerevoli. Non esistono
del cinetoplasto di L tarentolae. vaccini per nessuna di queste
Questi rappresentano frammenti
malattie e i Irattamenti, quando II mio interesse per I'insolito mitocondrio dei tripanosomi
della rcte di minicircoli
possibili, non sono mai molto ebbe inizio quando stavo conseguendo il dottorato. A quel
e maxicircoli concatenati
soddis&cend. In Africa, i bovi- tempo tutto quello che sapevamo era che questo mitoconche siritrovanella regione
ni d'allevamento (ma non quel- drio conteneva una grande massa compatta di DNA, nota
del cinetoplasto mitocondriale.
I minicircoli misuiano
li selvatici!) muoiono per una come DNA del cinetoplasto, che si poteva ben evidenziare
approssimativamente
specie di tripanosoma trasmes- con certi coloranti. II nostro sistema modello eta il tripano900 paia di basi.
sa dalla mosca tse-tse, e persino soma non patogeno Leishmania tarantolae che in origine
(Tratto da Simpson, L.
era paiassita di un geco. Ben presto sia noi sia aliri gruppi
e da Silva, A. (I97I) J. MoL Biol., le palme da cocco sono colpile
da lui tipo di tripanosoma chia- dimostrammo che questo DNA e costituito da migliaia
S6, 443-473).
(S.OOO-10.000) di piccole molecole circolari di DNA, i
minicircoli, tutte concatenate come anelli di una catena a
formare ima rete gigante di DNA, e da un piccolo numero
(20-i-SO) di molecole cireolari piii grandi, i maxicircoli,
ancb'esse legate alia rete (Simpson e Da Silva, 1971). I
minicircoli (fig->)> sebbene identic! per dimensione in ognu' na delle specie, sono costituiti da molecole a sequenza
diversa peisino all'intemo della stessa rete. Le loro dimension! variano da 460 a 2S0O paia di basi (bp) nelle diverse
specie e ogni minicircolo e oirganizzato in ima o piii regioni
conservate eregionivariabili. Unaregionedel minicircolo e
intrinsecamenteripiegata(Marini el al., 1982), ma il ruolo
genetico di tale struttura non e chiaro. I minicircoli non
sembravano codificare informazioni per la sintesi di proteine ma di cetto si replicavano molto attivamente, e hanno
tenuto impegnati per anni numerosi laboratori nel tentativo
di chiarire i meccanismi dellareplicazionee della segregazione della rete (Ryan et al., 1988; Shapiro e Englund,
1995). La fiinzione genetica dei minicircoli e rimasta a
lungo un mistero e non e stata risolta fino alia scoperta
degli RNA guida, nel 1990 (Blum el al., 1990).
La molecola del maxicircolo, le cui dimension! variano da
23.000 a 36.000 bp nelle diverse specie, rappresenta la molecola di DNA che porta rinformazione del mitocondrio e
contiene molti degli stessi geni trovati nelle molecole di
DNA mitocondriale umano: gli RNA ribosomali mitocondriali maggiore e minore, tre subunita della citocromoossidasi, il citocromo b, diverse subunita della NADH-deidrogenasi, una subunita della ATPasi Fl-FO e varie altre proteine non ancora identificate. Tutti i geni strutturali
identificati sono coinvoiti nei process! di tiasporto elettronico e di fosforilazione ossidativa a livello della membrana
interna deH'oiganulo, come awiene nelle cellule umane.
Le prime indicazioni sui geni criptici
Suyama (Chiu el al., 1975). Per'quei tempi questa era
un'idea eretica, alia quale oggi si guarda con piu favore
grazie all'esistenza di evidenze sperimentali, sia in vivo
sia in vitro, che dimostrano che i tRNA vengono importati
nel mitocondcio in diversi organismi (Tarassov et al., 1995;
Hauser e Schneider, 1995; Lima e Simpson, 1996).
C'erano numerosi altri segnali che suggerivano I'esistenza di qualcosa di insolito in questo genoma mitocondriale:
due geni (CO// e NDT) sembravano avere un nucleotide in
piu 0 in meno che creava uno spostamento nel registro di
lettura che, se non corretto, avrebbe polulo causare la terminazione della traduzione (Hensgens el al., 1984; de la
Cruz et al., 1984). Si dimostro
che questi spostamenti piti uno
fig.2. Matrice di confironto delle
o meno uno sono localizzati
sequenze inrormazionali di DNA
nelle stesse posizion! relative
dei maxicircoli di L. lareniolae e T.
sui geni di tre specie di tripanobrucei. I renangoli rossi indicano i
soma appaitenenti a tre generi
criptogcni ND7, COIII e MURF4
diversi, che sapevamo essere
di T. brucei. La fincstra di
separati da almeno 100 milioni
confronto e di 31 nuclcotidi e
di anni di storia evolutiva. Un
•'appaiamento richiesto e di 21
nucleotidi. MURF] <• NADH
altro problema era che numeroMURF3 - NADH dcidrogcnasi,
si geni erano privi dei codon!
subunita 7. MURF4 - ATPasi,
AUG codificanti metionina per
subunita 6. CYb - citocromo b.
I'inizio della traduzione. Infine,
COKII) - citocromo ossidasi,
nonostante la localizzazione resubuniia I(II). ND1(4,S) - NADH
lativa dei geni nei maxicircoli
deidrogenasi, subunita 1(4,S).
MURF - fase di lettura apena non
di L. tarentolae e T. brucei fosidentificata del maxicircolo.
se molto simile (fig.2), tre dei
(Ridisegnato da Simpson, L. ei al.
geni present! in L Jaremolae
0987). J. Biol. Chem..
mancavano nel maxicircolo di
262, 6182-6196).
Verso la meta degli anni Ottanta e stata fatta la sconcertante
scoperta che molti geni trovati nel genoma mitocondriale
imiano e di lievito sono apparentemente assent! nei mitocondri del tripanosoma, come per esempio i geni per i tRNA
mitocondriali. L'apparente assenza dei geni per i tRNA era
dawero sorprendente, in quanto tutti i mitocondri swdiati
fino ad allota contenevano de! tRNA coinvoiti nella sintesi
delle proteine mitocondriali. Per verificare se per caso alcuni dei minicircoli o alcime regioni dei maxicircoli che non
erano ancora state sequenziate codiflcassero dei tRNA,
ibridammo il DNA marcato d! minicircolo e maxicircolo
con RNA a basso peso molecolare isolato da! mitocondri
di L lorantolae, cbe era stato separato per elettrofores! su
gel d! acrilammide e trasferito su im filtro (Simpson et al.,
1989). Con nostra soipresa, I'uL. tarentolae —»
nico RNA che si ibridava era lui
insieme di 20 -^ 30 bande - cia=
PS
scuna delle quali differiva in
MURF.1coii|CYbg g
— o 2
limghezza dalle altre per im nu12S 9S
NDI" 2
cleotide - che migravano molto
oltre gli abbondanti tRNA mitocondriali, a indicare che questi
RNA erano peisino piii piccoli
dei tRNA. Queste bande erano
una componente talmente minima dell'RNA isolato cbe non
potevamo nemmeno vederle colorando il gel! Oggi sappiamo
cbe si tiattava della prima osservazione degli RNA guida che
avevano contaminato le nostre
preparazioni di R N A , ma a
quel tempo non avevamo idea
di cosa fossero que! trascritti.
Tuttavia era chiaro che nessun
tRNA mitocondriale veniva codificato Del DNA mitocondriale
e sembrava quindi probabile
che questi tRNA venissero !mportati nel mitocondrio del tripanosonu dal citoplasma, come
era stato precedentemente suggerito per Tetrahymena da Y.
PARTE PWMA / OaXSINE EO EVOLUZIONE OELLA VITA
3,75
11,25
1716 IS
lU 9 K 7 6
loule <
T. brucei (ND7, COIII e A6=MURF4). Questi geni erano
sostituit! da sequenze piu coite relativamente riccbe di guanina (G) (Simpson el al., 1987).
La scopeita deU'editlng
Nel 1986 il problema fii risolto, ma si apri un altro vaso di
Pandora pieno di problem! quando R. Benne pubblico la
sequenza dell'mRNA di COII della regione conservata
contenente il registro di lettura e trovo quattro uridine (U)
in piu che non erano codificate dal DNA del maxicircolo
(Benne el al., 1986)! La presenza di queste quattro U
inserite in tre siti annullava gli effetti dello spostamento
di tipo meno uno, consentendo la traduzione
dell'mRNA.
Ben presto vennero scoperti molti altri casi di editing
dell'RNA anche piA eclatanti. Per esempio, si scopri che
I'mRNA di Cyb era sottoposto a editing alia sua estremita
5', per inserimento di 39 U in 15 siti, aggiungendo cosi 20
nuovi amminoacidi all'estremita anuninica della proteina,
Ira cui un AUG (corrispondente a metionina) per I'inizio
della traduzione (Feagin elal., 1988a). Inoltre, sebbene con
minore frequenza, in certi geni si osservo I'eliminazione di
alcune U, come per esempio in COIII di L. tarentolae
(Shaw el al., 19^88). Per descrivere i geni i cui trascritti
subiscono editing nelle regioni codificanti, venne coniato
'il termine cripiogeni, o geni criplici, mentre le regioni
dell'mRNA cbe devono essere sottoposte a editing vennero
dette regioni pre-ediled.
Nel 1988 J. Feagin scopri in T. brucei il gene COIII ritenuto assente. In realta il gene eta sempre stato presente, ma
era un gene criptico ben nascosto, in quanto il trascritto era
soggetto a un editing cosi esteso, con aggiimta di centinaia di.
U su tutta la sua lunghezza, che I'mRNA mature cosi modificato misurava quasi il doppio deU'intero gene (Feagin el
al., 1988b). Nel laboratorio di
K. Stuart si scopri presto che
cio accadeva anche per gli altri
due geni mancanti di T. brucei
(Koslowsky ei al., 1990; Bhat
el al., 1990). Decidemmo di
chiamare questo tipo di editing
cosi estensivo
pan-editing
{pan = tutto), per difTerenziario
dal semplice editing intemo del
gene COII e dall'editing dell'estremita 5' del gene Cyb.
,'
fig.l. In alio, regioni
di giunzione del RNA
mitocondriale per il gene Cyh,
l>rc-cdiiaio (in blu),
e completamente ediiaio (in rosso).
i nucleotidi codificati in quelle
regioni sono niunerati.
Soito, allineamento delle sequenze
di mRNA' parzialmente cdiiate.
Le sequenze sono state oRenute
per RT PCR dall'RNA
del cinetoplasto di L lareniolae,
usando aU'estiemiia 3'
un oligonuclcoiide d'innesco
(primer) con editing e aH'cstrcmiia
5' un primer privo di editing.
a. Editing aneso dal 3' al 5'.
b. Configurazioni di editing
inanese. Le diveise configuiazioni
di editing (clone) sono numerate
in ordine sequenziale di editing,
mentre sulla destia sono ripottate
le relative frcquenzc con cui
si osservano (in vcrde).
(Ridisegnato da Stuim, N.R.
e Simpson, L. (1990a) Cell.
61, 871-878).
La polarita dell'editing
Si riusci finalmente a vedere un po' piu chiaro nei meccanisnu dell'editing quando Stuart scopri cbe il pan-editing
dell'mRNA di COIII di T. brucei sembrava progredire dalI'estremita 3 ' a quella 5' del trascritto (Abraham el al.,
1988). Questa ossetvazione suggeriva che il processo dovesse awenire dopo la trascrizione, in quanto la trascrizione
procede dall'estremita 5' a quella 3 ' , e spiegava anche
perehe messaggeri che avessero subito editing parziale
non riuscivano a essere tradotti: il sito di legame al ribosoma e I'ultima sequenza creata dall'editing. Scoprimmo che
lo stesso fenomeno si verificava nei geni di L lareniolae
che subiscono editing all'estremita 5' (Sturm e Simpson,
1990a). Vennero sequenziati piu di 400 mRNA con editing
parziale, derivanti dai geni Cyb e COIII, generati per ampliflcazione con il metodo della reazione a catena della
polimerasi (PCR, Polymerase Chain Reaction) a partire da
RNA mitocondriale, e si scopri che la regione compresa tra
I'estremita 3', a editing completo, e quella 5', che non
aveva subito alcun editing, presentava numerose configura-
VOLUME PMMO / AU'CRIGINE DELIA VITA
colo tra i suoi geni noli, vennero subito scoperte setle brevi
sequenze di questo tipo per quattro dei geni che subivano
editing (Blum et al., 1990). Onenemmo presto prove definitive dell'esistehza di piccoli RNA nel mitocondrio, derivati
dalla trascrizione di queste sequenze. Questi RNA contenevano anche delle sequenze alia loro estremita 5' che potevano fomiareregioniduplex appaiandosi con I'mRNA subito a
valle delleregionipre-edited. Abbiamo chiamato queste sequenze regioni di ancoraggio, in quanto fomiscono una maniera ideale per ancorare I'RNA guida (gRNA) all'mRNA,
formando im ibrido a doppio filamento nellaregioneappena
successiva a quella che deve subire editing (<ig.4).
Questi piccoli RNA avevano una mobilita clettroforetica
insolita, migrando 20 -r 30 bande ognuna delle quali possedeva un nucleotide in piu delle altre. Ci siamo subito resi
conto che questi erano gli stessi RNA che due anni prima
avevano contaminato le nosire preparazioni di tRNA (Simpson el al., 1989)! Presto ci siamo accorti che I'insolita
mobilita clettroforetica era dovuta alia presenza di code di
oIigo-[U] non codificate, lunghe fino a 24 nucleotidi, alle
estremita 3' delle molecole di RNA (Blum e Simpson,
1990). Abbiamo cbiamaio queste molecole RNA guida, o
gRNA, in quanto contengono rinformazione di sequenza
per I'ediiing. Gli RNA guida sono cosi giunti in soccorso
del dogma centrale! Naturalmente eravamo moho eccitati,
ma alio stesso tempo un po' delusi dalla scopena che la
risposia ai segreti dell'editing non era in realta niente di
completamente nuovo e sconvolgeme, bensi qualcosa cbe
La scoperta degli RNA guida
obbediva alle semplici leggi deU'appaiamento tra le basi.
Tuttavia dovevamo ancora spiegare come facessero questi
In ogni caso, non abbandonammo il dogma centrale che gRNA a operare I'editing delle molecole di mRNA.
aveva continuato a mantenersi valido per cosi tanti anni.
Fino ad allora avevamo identificato sene geni per gRNA
Venne effettuata una semplice ricerca al computer sui sparsi lungo mtto il genoma del maxicircolo che non aveDNA noto del maxicircolo di L tarentolae, in cerca di vano alcunarelazionecon i criptogeni nell'editing dei quali
sequenze brevi di DNA che po- sono coinvoiti. Questi gRNA contenevano rinformazione
tessero dare origine a RNA in per la modifica di quattro dei cinque trascritti dei criptogeni
fig.4. La scopeita
delle sequenze di gRNA.
grado di ibridarsi con sequen- noti ma nonriuscivamoa trovare im gRNA per il trascritto
In alto, allineamento
ze, sia intere sia parziali, di del gene COIII di L. tarentolae, che subisce editing all'edella sequenza dell'mRNA di ND7 RNA modificati dall'editing. stremita 5'. Poiche si sapeva che il DNA del minicircolo e
con editiiig completo (in rosso),
Oltre ai classici appaiamenti di capace di ibridare con dei piccoli trascritti caratterizzati
eon la sequenza del gRNA
Watson e Crick, C-G e A-U, dalla stessa insolita mobilita elettroforetica dei gRNA, ventrascritto, con gli appaiamenti
decidemmo di ritenere valide nero esaminate le sequenze note dei minicircoli e fii cosi
impropri purina-puiina
anche le coppie di basi G-U, trovato, nel minicircolo D12 (fig.5), un gene per un gRNA
o pirimidiaa-pirimidina.
In basso e iadicato I'appaiamento
cbe negli rRNA e nei tRNA rap- contenente informazioni di sequenza per i primi otto siti di
e la possibiliia di un completo
presentano appaiamenti leorica- editing dell'mRNA di COIII (Sturm e Simpson, 1990b).
appaiamento conetto nel caso
mente possibili, e proprio queQuesta era la prima indicazione di una Amzione genetica
in cui ti usa la sequenza di RNA
sto si rivelo essere il trucco!
per il minicircolo, che spiegava I'eterogeneita di sequenza
compleoientare al maxicircolo
Con questaricercaal compu- osservata in questa molecola di DNA: ogni classe di sequene si considerano validi
ter, effettuata su tutto il maxicir- ze codificava per un gRNA diverso aU'intemo della regione
gli appaiamenti C-U.
variabile! In totale, nel ceppo di
laboratorio di L tarentolae delmRNA
I'universita della California,
3' ediio
RNA
vennero identificate, per cloJ. gRNA
naggio e sequenziamento, 17
uascriiio
diverse classi di sequenza dei
Q appaiamenti impitipri: purina-puiina, pirimidina-pirimidina
minicircoli, ognima presente in
^^
quantita diversa (Maslov e
JtawMimwiayit^^
. Iftl^ta'
Simpson, 1992).
DNA
initial match
•*««•«> vennero trovati dei
jBwt^ATiaAgAeaieeATiA.TJSWvTJiitoBi^^
(gene gRNA; gRNA codificati dai minicircoli
zioni di editing parziale. Tale regione venne chiamata regione di giunzione. Nel caso degli RNA prodoni dal gene
Cyb, quasi tutte queste configurazioni potevano essere ordinate secondo una precisa direzionalita dell'editing, dall'estremila 3' verso quella 5' (rig.3).
Tunavia, nel caso di COllI solo il 58% delle diverse configurazioni di editing mostrava questa precisa polarita. I]
resto mostiava delle modalita di editing inatteso, in cui delle
U venivano aggiunte in siti non soggetti a editing nel trascritto maiuro, oppure nella regione 5' prima che fossero
aggiunte in quella 3'. Decker e Sollner-Webb (1990) esaminarono gli mRNA soggetti a editing paiziale dei geni Cyb e
COIII di T. brucei e trovatono in entrambi i geni una elevata
percenwale di editing inaiiesi nelleregionidi giunzione.
Quando ci si rese conto che I'editing aweniva dopo la
trascrizione ed era progressivo e polarizzaio, si ipoiizzo cbe
dovesse essere in atto un meccanismo di taglio e giunutura
dei trascritti. Comunque, il problema principale era dato dal
fatto che non sembrava esistere imo stampo di acido nucleico per questa aggiiuiia di informazione. Sembrava che I'infoimazione di sequenza derivasse dal nulla e che, nel caso
dei geni a pan-editing, si avesse la cosiruzione di geni del
mtto nuovi. Queste scoperte avevano quindi profonde implicazioni sui dogma centrale del trasferimento dell'informazione genetica.
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PARTE PMMAIOMCINE ED EVOUIZIONE DELLA VITA
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DNA del maxicircolo .
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KRNA
fig.S. La scopena dei gRNA
codificati nei minicircoli.
a. Visione schematica
delle regioni sequenziate
del minicircolo D-12-1
di L lareniolae, in cui e indicata
la polarita (fteccia lunga rossa)
del gene gRNA COIII rispetto
alia sequenza conservata 12mer
di CSB-3 (indicata net riquadro
sovrasuuue), che rappresenta
im pimto di origine
per lareplicazionedi un filamento
del DNA (fieccia rossa coita).
La fascia azzuna indica
la sequenza conservata completa.
La bana retinata in basso
indica una sequenza simile
ad un'altia regione sequenziata
del minicircolo che ha permesso
di dcterminare la polariti del gene.
b. Sequenza completa
della poizione 61-240 bp del DNA
del minicircolo che include
la possibile sequenza di gRNA
codificante per i siti di editing
dain all'8 di CO///lungo
il minicircolo D-12-1.
Le liecce rosse indicano
la localizzazione della sequenza
conscrvau lunga 12 nucleotidi
in CSB-3, che coirisponde
_
a un'origine di replicazione
per uno dei filamemi di DNA.
b. Sequenza editau dell'mRNA (in
rosso) per COIU,
allineata con quella per COIII
del maxicircolo (in asuno):
sono mostrati i 17 siti di editing
e le uridine inserite,
indicate con u.
Le deleziooi sono indicate
con il segno *.
(Ridisegnato da Sturm, N.
e Simpson, L. (1990)
CeU 61, 879-884.)
fig.6. Diagramini
deU'organizzazione genomica
dei minicircoli di L lareniolae
e T. brucei. Sono mostrate
le localizzazioni delle regioni
conservate e la polariti
della sequenza di CSB-3,
insieme eon I'adiacente regione
di DNA ripiegaio.
I geni per i gRNA
sono indicati dalle frecce.
Nel minicircolo di T. brucei
i geni per i gRNA sono
fiancheggiati da imperfette
ripctizioni invenite
di 18 nucleotidi (frecce).
• I *
'
U
AU
_ ..;.
I
_T.nin!ci.TiAC.cTocTAmoc...a
'fnsiixaia/sM\j:AK.<x^Qi:jSiSSiJc<r.'-:.':<i. •:;og_o.t.«.TOAi.i.i.i.i.o.t.croi.ii IGJTOCL
I iiiiii»i«i>i>iiiiiiiiiiiiiiii
C AC>lii|Ui|i(AaACAGiAAUGGACXiAU
..uucuAUc-s-
anche in T. brucei (Corell el al., 1993; Pollard el al., 1990).
La principale differenza osservata sta nel fatto che ogni
minicircolo di 7*. 6rucei codiiica tre gRNA diversi piuttosto
che im singolo gRNA e che i geni corrispondemi sono localizzati nella regione variabile, quasi perfettamente in altemanza con tre gnippi di ripctizioni inveitite di 18 nucleotidi che noji sono presenti in L lareniolae (fig.6). Un'altra
differenza e che in precedenza era stata dimostrata I'esistenza di piu di trecento diverse classi di sequenza dei minicircoli in 7*. brucei, invece del limitato numero riscontrato in L
lareniolae. Questo significa che il numero complessivo di
diversi gRNA in T. brucei puo essere di oltre 900. Una
caratteristica dei gRNA di T. brucei e la loro elevata ridondanza. I gRNA ridondanti possiedono sequenze diverse, ma
contengono la stessa informazione per I'editing; cio e dovuto alia possibilita di appaiamento tra le basi G-U. Di
"bend"
bend"
regione
«
.conservata ^
7CSB-3 ;l
L tanauulue
T. brucei
VOLUME PRIMO / ALL'ORIGINE DELLA VITA
recente e stata osservata anche in T. cnai un'alta percenmale di gRNA ridondanti (Avila e Simpson, 1995).
La perdita dei minicircoli durante il periodo
di crescita in coltura e la perdita dell'editing
In seguito a un primo confronto tra i genomi mitocondriali di
L lareniolae e T. brucei, avevamo notato I'esistenza di numerosi tratti di DNA relativamente ricchi di residui di G
(Simpson el al., 1987). In T. brucei tre di questi, chiamati
ND7, COIII e MURF4, si rivelarono essere tre criptogeni
nascosti i cui trascritti sono soggetti a pan-editing, ma in
entrambe le specie c'erano altre sei regioni ricche di G localizzate tra geni noti. In L. lareniolae il ttascrino derivato dalla
sesta di queste regioni subisce pan-editing, per aggiunta di
117 U in 49 siti ed eliminazione di 32 U in 13 siti di tre domini
1
di editing, dando origine a un mRNA che codifica una proteina della subunita minore del ribosoma mitocondriale
(Maslov f/a/., 1992).
t stato dimostrato che anche le altreregioniricchedi G in 7*.
brucei (chiainate CI-CS) sono criptogeni i cui trascritti sono
soggetti a pan-editing ma, nel vecchio ceppo di L tarentolae
in uso nei laboratori dell'universita della California, non furono mal identificati dei trascritti di questi geni che avessero
subito editing completo. t. suto poi dimosb:ato che gli mRNA
maturi di T. brucei derivati da CI, G2 e CS codificano le
subunita dell'NADH-deidrogenasi (Bhat el al., 1990; Souza
el al., 1992; Read el al., 1992; Souza et al., 1993).
L'aiulisi del ceppo LEM125 di L tarentolae recentemente isolato ha suggerito che il ceppo adoperato nei laboratori
dell'universita della California avesse in realta un difetto
genetico per quanto riguarda I'editing dei trascritti dei criptogeni CI-G5 (Thiemann et al., 1994). II ceppo LEM125
conteneva mRNA completamente mamri coirispondenti ai
tabclla 1
1
gRNA identificati nel ceppo di L tarentolae In uso nei laboratori dell'universita della California (UC)
e nel ceppo LEM125
CRIPTOGENE
gRNA
CRIPTOGENE
gRNA
gND7-I
Mc (16724-16752)
Mc (10120-10148)' ND7
gCOII
gND7-lI
Mc (395-346)
mc*
gCOIII-I
ND8 (01)
gND8-I
mc
gCOIU-II
mc
Cyb
Mc (16803-16767)
gND8-II
mc
gCyB-I
gCyB-II
Mc (2290-2239)
gND8-llI
mc
C3
Mc (17199-17215)
gND8-IV
mc
gG3-I
gG3-U'
Mc (14472-14445)
gND8-Vl
mc
gND8-VlI
mc
gG3-UI
mc
C4
gN08-IX
mc
gG4-I
mc
gND8-X
mc
gG4-II
mc
gND8-XII
mc
gG4-UI
mc
Mc (16881-16931)
gND8-XIII* Mc (17364-17391)
gG4-IV
ND9 (G2)
gND9-II
mc
gG4-V
mc
gND9-IU
mc
gG4-VI
mc
gG4-VIII
gND9-V
mc
mc
•
gND9-VI
mc
gG4-IX
mc
gND9-VII
mc
gG4-X
mc
gND9-VIII
mc
gG4-XIV
mc
MURF2
Mc (9908-9893)
gND9-IX
mc
gMURF2-I
Mc (13087-13146)
gND9-XII
mc
gMURF2-II
gND9-XIV
Mc (219-262)
MURF4 (ATPasi 6) gMURF4-I
mc
gND9-XV
mc
gMURF4-II
mc
RPS12 (G6)
gRPS12-I
mc*
gMURF4-UI mc
gMURF4-IV mc
gRPSI2-II
mc
gRPS12-III
mc
gMURF4-V
mc
gMURF4-VI mc
gRPS12-IV
mc
ND3 (G5)
Mc (304-350)
gRPS12-V
mc
gND3-I
gRPS12-VI
Mc (17020-16975)
mc
gND3-II .
gRPS12-VII mc
gND3-III
mc
gND3-V
gRPSI2-VIII mc
mc
gND3-VI
Non assegnati
gMlSOS
Mc (150-102)
mc
gND3-IX
mc
'Mc: gRNA codificati dal maxicircolo. La posizione del gene nel maxicircolo di L lareniolae (LEIKPMAX) e indicata tra parentesi; 'mc:
gRNA codificati dal minicircolo; 'gRNA ipotetici codificati dal maxicircolo per G3 Blocco II; 'gRNA ipotetici codificati dal maxicircolo
per ND8 (Gl) Blocco XIII; 'gRNA ipoteticiritrovatiin una chimera misguided fomiata da gRNA e mRNA
COII
COIII
PARTE PRIMA / ORIGINE ED EVOIUZIONE DELIA VITA
Basandosi sulla conoscenza
dell'esisienza di queste attivita
enzimatiche nel mitocondrio e
della progressione in direzione
3'-S' del meccanismo di editing
Numero di glU^lA codificati da:
dell'mRNA, e stato suggerito
UC+LEMI25
UC+LEMI25
un mtHlello per spiegare il ruolo
CRIPTOGENI
DNA maxicircolo
DNA minicircolo
TOTALE(ATTESO)
dei gRNA nel processo di ediCO/I
1
0
1
ting (Blum el al., 1990). Tale
0
2
2
modello, poiche posiulava una
Cyb
2
0
2
serie di reazioni che accadono
MURF2
2
0
2
in un complesso muliienzimatiMURF4 (A6)
0
6
6
co legato all'mRNA, e stato
ND7
2
2
0
chiamato modello a cascala enRPSI2 (06)
1
8
7
zimalica. Abbiamo proposto
UC+LEM125
LEM 125
che rinierazione iniziale coin9(14)
9
A^DS(Gl)
1'
volgesse la formazione di un
ND9 (G2)
8
9(17)
1
ibrido di ancoraggio tra il
2'
1
3 ( 6)
C3
gRNA e reslremiia 3' della re10(15)
C4
9
1
gione di pre-editing dell'mRND3 (G5)
5
6 ( 9)
1'
NA. Oltre alle interazioni
Totale
47
60 (83)
1'
RNA-RNA coinvolte nell'anco'gND8-XlI, un gRNA ipotetico con molti appaiamenti impropri codificate dal minicircolo; 'gG3-II, un raggio, crediamo che alcuni fatgRNA ipotetico codificalo dal maxicircolo che non era idcniificabilc per analisi Northern e Primer tori proteici recentemente trovati, che formano complessi
Extension; 'gMI50, un gRNA ipotetico trovato in una chimeia misguided formata da gRNA e mRNA
COII i gRNA (Byrne et al.,
geni CI-GS, oltre a unrepertoriopiu complesso di gRNA 1995; Bringaud el al., 1995), assistano lo svolgimento di
codificati dai minicircoli. Nel ceppo LEM 125 fiirono indi- questa specifica interazione iniziale, forsericonoscendodelviduati almeno 32 gRNA codificati dai minicircoli, assenti le strutture secondarie formate dallo stesso mRNA o dall'inel ceppo utilizzato all'universita della Califoniia (tabb.l e brido gRNA-mRNA. E stato ipotizzato che il passo succes2). Abbiamo ipotizzato che specifiche classi di sequenza dei sivo fosse un taglio specifico dell'mRNA all'altezza della
minicircoli, codificanti i gRNA implicati nei processi di prima base appaiata in modo non corretto, cosi da espoire un
editing dei trascritti dei geni CI-G5, fossero andate perdute gruppo 3'-0H libera. Questo frammento di mRNA tagliato
durante il lungo periodo di mantenimento in coltura del sarebbe un substrato per I'enzima TUTasi, che puo aggiunceppo di laboratorio dell'universita della California, proba- gervi una o piu U al 3'-teiminale. Le U aggiunte potrebbero
bilmente a causa della mancata necessita dei rispettivi pro- quindi appaiarsi ai nucleotidi A o G del gRNA e le due
dotti proteici durante la fase di coltura del cicio biologico di estremita dell'mRNA potrebbero essere ricongiunte dalla
RNA-ligasi. Questo meccanismo porterebbe a ima sorta di
Leishnumia.
aperture acemiera della doppia elica in una direzione che va
dal 3' al^' (sulI'mRNA), e I'intero processo inizierebbe di
nuovo alia successiva base appaiata impropriamente (fig.7).
II modello a cascata enzimatica ha fomito una spiegazioModelli del meccanismo di editing
ne per la polarita 3'-5' del pan-editing: tale polarita era
per Inserimento e delezione di U
dovuta alia creazione, a opera dei gRNA a valle, di sequenPrima della scoperta dei gRNA, avevamo isolato, da mito- ze di mRNA modificate e complementari alle sequenze di
condri purificati di L tarentolae, una terminaluridiltransfe- ancoraggio dei gRNA adiacenti a monte (fig.8).
II modello spiegava anche I'esistenza di configurazioni di
rasi (TUTasi), un enzima in grado di aggiungere delle U
all'estremita 3' di qualunque molecola di RNA (Bakalara editing inattese nelleregionidi giunzione degli mRNA parel al., 1989). Questo enzima era presumibilmente responsa- zialmente modificati. Abbiamo suggerito che queste diverse
bile dell'aggiunta di U aU'estremita 3' dei gRNA. Avevamo configurazionirappresentasseroil risultato di un normale
anche dimostrato la presenza di una RNA-ligasi mitocon- editing effettuato pero da gRNA sbagliati, oppure da gRNA
driale in grado di legare insieme in modo covalente due appropriati in un sito o in una fase di lettura sbagliati. Questi
molecole di RNA, e avevamo osservato che se la TUTasi processi sono stati chiamatirispettivamentemisediling fedidell'estratto mitocondriale veniva inibita dall'eparina o de- ting errato^ e misguiding (guida errata), e sarebbero indotti
gradata per digestione con proteinasi K, si metteva in azione dalla presenza di appaiamenti di basi 'vacillanti' (wobble)
im'attivitaribonucleasicacriptica che tagliava I'mRNA di G-U e forse anche A-C (Snirm el al., 1992). La formazione
Cyb gi& sottoposto a pre-editing, proprio aU'intemo della di un ibrido di ancoraggio a opera del gRNA sbagliato, o di
regione modificata (Simpson ei al., 1992). Una attivita en- im ancoraggio secondario in un sito sbagliato a opera del
donucleasica simile era stata individuata anche in estratti gRNA giusto, potrebbe dare origine a un editing inatteso, il
quale a sua volta potrebbe inteirompere il processo di editing
mitocondriali di T. brucei (Harris etal., 1992).
La complessiti del gRNA nel ceppo di L tarentolae
in uso nei laboratori dell'universita della California (UC)
e nel ceppo LEM 125
com
VOLUME PRIMO I ALL'ORIGINE DELIA VTTA
minicircoli
fig.7. Diagiamma dei modelli
di editing dell'RNA
nei mitocondri di tripanosoma.
Le cellule sono suite
colorate con Giemsa.
(Ridisegnato da Simpson, L.,
e Thiemann. O.H. (1995) Cell.
81. 837-S40).
regione conscrvaia
Trypanosoma
hivi
o-
servaia
regione conscrvaia
Leishmania
laivniulue
gRNAs
-««y.i«)MA..)-
mRNA
(preediuio
ibrido di ancoraggio
imatica
modelli a cascata enzimatica
transesierificazione
fonie di U's = gRNA
rouura - congiunzione
fonie di U's = gRNA
lonura - congiunzione
fonlediU's=UTP
fig.8. Sei gRNA sovrapposti
mediano I'editing dell'mRNA
per MURF4 (-A6).
1 siti di editing sono numerati
a partire dall'estremita 3'
veiso la S'. Gli ibridi di ancoraggio
gRNA-mRNA sono ombreggiau.
Gli appaiamenti canonici
sono indicati con il segno | mentre
gli appaiamenti G-U con il segno'..
(Ridisegnato da Maslov, D.A.
and Simpson, L. (1992) Cell.
70.459-467).
elicasi
lAAUUL'UUUUA' ~~T
^
•
"
^
gMURF4 -VI
,iL-.i>uu.:uUaUi|>Uasa|a«iaUiAACfUtJitaUCilnJi|AU-ACCCAUA/
ACCCAUAAJAAUA-S'
. „ , „ „ , , , laU.aaaCU
lU!
II
ijMUREiiy
I I :I III I
I III 1 1 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : i 1: 1: 1111:: II: IIII11 itMBBMilia!!
ai;-Al/aUaUaagaU(AUiUgaaaaCaaUi|UCACAAACU|
I I • ! : i I M i i : 11:1 I : : : 11 i T l i I I ilW»l«il"W-lwl
ibridi di
ancoraggio
50
49 48 47
46
4S
44
43
42 41 40
39
38 37 36
35
34 33 32 31
gMURF4 -IV
SMURM - I I '
AGGAIAJJIsaUi
lAJJIsaUa a a a.a.Qa.CAa|UAAAAUAU> -.UACAAjUAU&U- S'
... .tJ»JLtWaVaga>CatIa.S.a»aC.tr|UaaaUaa|AUAAACAACCAAAlJAUA
I
1
•
,,
Lil:illiillllllliMa8llH»WWWftlttfl1 I II
gMURF4-Ill
:iii||;i:iiiiii:i:lll::li!ll
aUagaUaiinlatallaCiUiCaaaUa
lAGGUCuq- 5iltasaUgy.:^UaCaajisAIJaUaaaUapGGCUCAAUUAC.
"
I I ! : i: i : : : 1 : 1 : 1 1 : : : I: i I 11
fe»t'1^-H
i : I : i i : r ^ f I i i i : : : ?! H I '•; : ; | i i w H ' l * * W ^
30
29
2 8 27
2 6 25 24 23
22
21 2 0 19
gMURF4-I
X tCf_t aI2;|CUAACCACAAIMUA : i T l : 11 :ifeW>WiWrW!lrti I
18 17
16 15
14
13 12
II
10
9
8
7 6 5 4
4?
-3- mRNA
3
2
1
PARTE PRIMA / ORIGINE EO EVOLUZIONE DEllA VITA
direzione di editing
editing regolare
mRNA
sequenza
pre-ediiaia
sequenza
ediiata
gRNA
mis-editing dclcrminaio dal mis-guiding
inis-ediicJ
falso ancoraggio
y^
Un
,ancoraggio secondario
ancoraggio iniemo
finche non si sia formata una
sequenza di ancoraggio corretta
per il successivo gRNA. In ogni
caso, le sequenze che hanno suGli ancoiaggi sono indicati
bito misediting nella regioni di
da triangoli e le lequenze misedited
giunzione potrebbero essere
dariquadricon strie tiasveisali.
nuovamente modificate con
(da Snirm, N. R et al. (1992) Cell,
70, 469-476.
I'intervento del coiretto gRNA;
in effetti sono stati osservati
molti esempi di misediting/misguiding che awalorano questa ipotesi (fig.9).
Comiuque i stata proposta anche im'altra interpretazione
degli editing inattesi (Decker e Sollner-Webb, 1990): e stato
suggerito che I'editing sia completamente casuale e awenga
per ciascun nucleotide aU'intemo di un dominio di editing, e
cbe, ima volta foimatasi la sequenza corretta, questa venga
fissata mediante appaiamenti con il gRNA. Questo problema
non sara del tuttorisoltofinoa quando non acquisiremo ima
conoscenza completa del contenuto complessivo di gRNA
nel mitocondrio, cosi da confrontare tutte le possibili configurazioni inattese di editing con le sequenze di gRNA note.
II modello a cascata enzimatica si accorda con molte osservazioni sperimentali, compresa quella nota della polarita
3'-S' dell'editing, ma non spiega in modo soddisfacente I'esistenza della coda di oligo-[U] sui gRNA. Inizialmente e
stato ipotizzato che il ruolo della coda di oligo-[U] fosse la
stabilizzazione dell'ibrido iniziale, in quanto le U possono
appaiarsi con le G e le A nellaregionedi pre-editing (Blum e
Simpson, 1990). Tuttavia, nel 1991 abbiamo suggerito che la
coda di oligo-[U] potesse svolgere un ruolo piii anivo, in
fig.V. Rappresentazione
schematica dei meccanismi
di editing normale e di misediting.
prodotto dal wisguiding.
10
particolare che fosse la fonte delle U aggiunte durante I'editing (Blum et al., 1991). E stato proposio un modello secondo
cui rOH 3'-terminale del gRNA attaccherebbe un fosfato
limgo I'mRNA, all'altezza della prima base appaiata in modo
improprio tra gRNA e mRNA, producendo ima transeslerificazione e lo scambio dell'OH con il fosfato (vedi figura 7).
La chimica di questa reazione e simile a quella che si
verifica in altre cellule duranle il processo di auiosplicing
delle molecole di RNA. Un modello analogo di transesterificaziune e stato indipcndenlcmciile proposio anche da
Cech (1991). Una delle prevision! di questo modello riguarda I'esistenza di inteimedi chimerici, formaii da gRNA legati in modo covalenie a molecole di mRNA nei siti di
editing per mezzo della coda di oligo-[U]. Abbiamo cercato
e trovato queste molecole chimeriche in tre diversi geni
(Blum et al., 1991). Questa scoperta e stata confortante,
ma non harealmentedimostrato il modello della transesterificazione, in quanto molecole chimeriche potevano essersi
formate in alni modi, specialmenle in un sistema che, come
gia sapevamo, contiene enzimi capaci di tagliare e legare
insieme le molecole di RNA (vedi figura 7).
Dal punto di vista teorico il modello della transesterificazione era attraenle, poiche richiede la stessa chimica e lo
slesso tipo di sequenze guida adoperate nel ben compreso
meccanismo di autosplicing degli introni, mentre il modello
a cascata enzimatica prevede una nuova serie di reazioni.
Tuttavia, di recente si sono avute diverse evidenze che indicano fortemente che le chimererappresentanoprodoni
terminali abortivi piuttosto che intermedi delle reazioni.
Tali evidenze sono slate ottenute da un sistema di delezione
in virro delle U, mediata dai gRNA, in estratti mitocondriali
di T. brucei (Seiwert el al., 1996), da uno smdio della stereochimica di una attivita di inserzione in vitro delle U
indipendente dai gRNA (Freeh e Simpson, 1996; Connell
et al, 1997) e anche di ima attivita di inserzione in viiro
delle U dipendente dai gRNA in estratti mitocondriali di L.
tarentolae (Byme el al., 1996). Queste osservazioni suggeriscono che il meccanismo coinvolge una reazione di tagliogiimzione mediata da proteine enzimatiche, come nel modello originale a cascata enzimatica, piii che transesterificazioni mediate dall'RNA. Tuttavia, per im completo chiarimento del meccanismo, bisogna attendere I'isolamento, l'espressione e laricostiluzionedelle componenti enzimatiche
dell'apparato di editing.
L'evoluzione dell'editing
per inserimento e delezione di U
L'origine e l'evoluzione dell'editing dell'RNA nei tripanosomi per inserimento o delezione di U e un argomento
importante e interessante: II pan-editing mediato dai
gRNA e statoriscontratoin tutte le specie di tripanosomi
finora analizzate (Femandes et al., 1993; Landweber e
Gilbert, 1994; Maslov et al., 1994). L'origine dell'editing
si e potuta farrisalireal progenitore dell'intera linea evolutiva dei cinetopj^lifli con la scoperta dell'editing mediato
dai gRNA ^ Trypanoplasma borreli, cbe appartiene ai bodonini, mi'altro sottordine di cinetoplastidi (Lukes et al..
VOLUME PRIMO I AU'ORIGINE DELLA VITA
.
1994; Maslov e Simpson, 1994). La presenza dell'editing nel
mitocondrio di Euglena e ancora argomenio di discussione,
sebbene abbiamo dimoslralo (Yasuhira e Simpson, 1996)
che il Irj.icrillo JeH'unicn gene niiKiciindrialc di qucstu
specie clonalo fino u oggi, COI, non subisce editing e che
in questo organismo non si possono mettere in evidenza
molecole simili ai gRNA mediante il metodo di marcalura
dcU'estremita 5 ' con |a-^^P]GTP e guanililtrasferasi del
virus del vaiolo bovino.
Poiche I'analisi filogenelica delle proleine mitocondriali
COI e Hsp60 (codificata nel nucleo) indica un'origine monofiletica dei mitocondri di Euglena e dei tripanosomi (Yasuhira e Simpson, 1996), una dimostrazione definiliva delI'assenza di editing nei mitocondri di Euglena indicherebbe
che I'editing e una caratteristica
«g.lO. Modello per l'evoluzione
dei criptogeni e per la perdiu
dell'ediiing deU'RNA
nci mitocondri dei cincioplastidi.
II trascritto primario (linea ncra
spcssa) subisce editing a opera
o.i primi tre gRNA sovrapposti.
Le sequenze modincaic sono
rappresenute da nquadri bianchi.
Mediante crossing-over omologo.
il cDNA del irascrino panialmcnic
modincaic sostiiuiscc il criptogcnc
originalc in uno dci maxicircoli.
Sc SI pcrdc a classe di minicireoli
codifinnie per uno del tie gRNA.
ncllc cellule che mancano
del cnpiogcne sosiituiio quesio
Irascrino non puo subire editing,
e cio puo avere conseguenze letali.
Le cellule in cui sia presente
il cnpiogcne sostiiuiio dotTebocro
avere unvanuggio selenivo.
(Ridisegnato da Simpson. L.
e Maslov, D.A. (1994) Science,
264. 1870-1871).
f ? " ' " " ' ^ ' ' " " ^ l'evoluzione
<>" Cinetoplastidi. La soluzione
di questo problema deve attendere I'analisi di altri geni milocondriali di questo organismo.
Neirambilo della linea evo,
. ^jn,,
ijs.jdi
. . . .
^
<««•' »)• •» hmiiazione dell editing alia regione 5' di tutti i geni
a editing paiziale e la presenza
di geni omologhi soggelli a panjj;,;
;„
jj correlate, sugu - - .
• je = " » ~ " ° <^'"' ' " P ' o s e m a edi" " 8 "'milalo all estremita 5 ' ,
come i geni COIH e ND7 di
Leishmania e Criihidia, siano
derivati dalla retroposizione di
J D ^ A coirispondemi a mRNA
....
. ,
, ,
" " .«'."•"? P^™"'*' * ' .'•»""°
sosimiilo I cnptogeni onginali
nel genoma del maxicircolo
(Simpson e Maslov, 1994). Cio
maxicircolo
/
T cnpiogcne ^
ediiaioaS' \
I
/
\k
/
\
cripiogcne che
deve essere
\ ccompletamente
ediiato
( \ \
RNA 5'
^y
trascritU} pre-ediiato
minicircoli
gRNA-1 ^—>v
j
ST
,1.
N
/
block I
ricombinazione
1
trascrizione
inversa
cO.MA
''
gRNA-ll
gKNA-ll
>^-^
f("Wr-3'
^
j"
/ \ —
block III -^
trascritto paizialmenie ediiato
PARTE PRIMA / ORIGINE ED EVOLUZIONE DELIA VITA
implica che questo tipo di editing dell'RNA e una caratteristica genetica instubile che puo essere facilmenie perdula nel
conw deU'evoluzione. La perdita di molle classi di sequenza
dci minicircoli (.-(Klificanli i gRNA iinplicali ncH'ediling degli mRNA C I - C 5 , nella lunga storia di collura del ceppo di
laboratorio di L. tarentolae dell'universita delta California,
si accorda perfettamente con questa ipotesi (Thiemann et al.,
1994). Cio suggerisce che deve esserci stato un qualche
vantagglo seletiivo nel mantenimento di quesio sistema genetico nel corso deU'evoluzione di quesio tipo di cellule. La
pressione seleltiva puo essere correlata al fatto che I'editing,
almeno nel complesso cicIo biologico di T. brucei, e regolato
e, in quesio tipo di cellule, vicne utilizzato come meccanismo di controllo traduzionale per regolare la biosintesi del
mitocondrio. Tuttavia questo non spiega il mantenimento
dell'editing nei tripanosomi monogenetici parassiti degli insetti, come Criihidia, a meno che non esistano degli stadi
non noti in cui si verifichino repressione e derepressione
mitocondriule, come nei tripanosomi digeneiici africuni.
Tuno cio rimane per il momento in discussione.
Se il meccanismo di editing dell'RNA che opera nei
tripanosomi si dovesse rivelare una caratteristica esclusiva
dei parassiti e non fosse presente nelle cellule umane, allora
questo processo potrebbe essere un eccellenie bersaglio per
la chemiotenipia. Un farmaco che potesse colpire seleilivamenie gli enzimi necessari per I'ediiing, potrebbe in leoria
uccidere i parassiti senza danneggiare le cellule umane
ospiti. La speranza e che I'applicazione pralica delle ricerche su quesio bizzarro fenomeno genetico possa un giomo
mostrarsi utile nel traitamenio delle numerose malattie
umane e animali causaie dai tripanosomi nei paesi del Terzo Mondo.
Altri tipi di e d i t i n g d e l l ' R N A
Un tipo ancora piii complesso di editing per inserimento di
basi e stato osservato nei trascritti mitocondriali del fungo
mucillaginoso Physarum (Gott et al., 1993; Mahendran et
al., 1994). In questo organismo tutti i trascritti del genoma
mitocondriale, rRNA, tRNA e mRNA, vengono modificati:
principalmente per inserimento di residui di C, ma anche di
U, G e A, di dinucleotidi o per sostituzioni di C con U.
Ancora non si conosce il meccanismo, o i meccanismi, di
questi eventi di editing.
Un altro tipo di editing e stato scoperto in un gene nucleare di mammifero, che codifica I'apolipoproteina B
(apoB), e nei mitocondri e nei cloroplasti delle piante, in
cui C viene sostituita da U in siti ben precisi (Hiesel ei al.,
1989; Covello e Gray, 1989). Questo e staio chiamato editing p e r sosliluzione, per disiinguerlo dall'editing per inserimento e delezione osservato nei tripanosomi e in Physarum. 1 cambiamenti da C a U sembrano coinvolgere una
deamminazione dei residui di C presenti ma non e chiaro
come questo evento venga limitato a im ceno numero di siti
specifici nel gen^ha, tranne che nel caso del singolo evento
di editing delis'apoB, in cui specifiche proteine riconoscono
brevi sequenze di DNA adiacenti al sito di editing (Backus e
Smith, 1992; Backus e Smith, 1994).
II
Un editing per sostituzione dei tRNA e stato osser\'ato
anche nei mitocondri dell'eucariote Meiiore Acanihamoeba
casielloni e nei mitocondri delle chiocciole di terra: singoli
nucleotidi appaiati in modo improprio nel braccio accettore
del iRNA vengono sostituiti da nucleotidi in grado di appaiarsi correttamente (Lonergan e Cray, 1993). Nei mitocondri dei marsupiali e dei rani e stato osservato un unico
tipo di editing per sostituzione, in cui si verifica un singolo
cambiamento da C a U all'iniemo dell'anticodone o in
prossimiia di esso (Mori ei al., 1995).
Un'altra classe di editing per sostituzione e stata rilevata in
numerosi mRNA umani per i recenori del glutammaio; essa
comporta la deamminazione dei residui di A, dando origine
alia inosina (I), riconosciuta dall'apparato di traduzione come G. Questo tipo di editing da A a I dei recettori del glutammato nei mammiferi fii scoperto in un modo insolito.
Inizialmente venne descritta un'attivita enzimatica capace
di svolgere un RNA a doppio filamento cambiando le A in
] (Bass e Weintiaub, 1988); poi venne purificala una adenosinadeamminasi per I'RNA a doppio filamento (dsRAD o
DRADA) che catalizza la deamminazione di A in I, di cui
venne poi clonalo il gene (Kim el al., 1994; Wang el al.,
1995). Infine e stata attribuita a questa attivita enzimatica
una funzione biologica con rosser\'azione che gli mRNA
per i recenori del gluiammaio venivano modificati per sostituzione di A con G in siti specifici, e che tale sosiiiuzione
richiede la formazione di una regione di RNA a doppio
filamento, la quale si oitiene con il ripiegamento di una
sequenza complemenuire localizzaia in un inirone a valle
(Higuchi el al., 1993; Maas et al., 1996). Dal momento
che I'apparalo di traduzione tratta le I come se fossero delle
G, si sospeno immediatamente cbe la dsRAD fosse la causa
principale dell'evento. Sembra tuttavia che un'altra adeninadeumminasi coirelau, la REDl, sia responsabile di quesio
specifico evento di editing (Melcher et al., 1996). Comunque recentemente la dsRAD e stata implicata nell'editing per
sostituzione di A con G che awiene nell'RNA antisenso del
virus deU'epatite B delta. L'editing per conversione di A in 1
e probabilmente molto diffiiso, vista I'ubiquita di attivita del
tipo dsRAD negli organismi superiori.
Un'altra modificazione dell'RNA, anch'essa chiamata
editing, implica I'aggiunta di G nell'mRNA di alcuni vims
(Vidal etal., 1990; Ptittetal., l991;Cunane(a/., 1991). In
vari paramyxovirus im unico gene P da origine a due diversi
mRNA: uno e una copia esatta del DNA corrispondente,
mentre I'altro contiene una o due G in piii inserite entro
un tratto di cinque o sei G. Questo produce uno spostamento
della fase di lettura originaria che permene ai ribosomi di
accedere a una seconda fase di letmra piii a valle, dando
origine a uiu proteina P altemativa con una sequenza Cterminale diversa. L'aggiunta di G nell'mRNA virale e probabilmente dovuta a una specie di stuttering (tanagliamento) dell'RNA-polimerasi durante la trascrizione.
cariotiche e coinvolge molti tipi diversi di meccanismi. II
tipo di editing per inserimenio e delezione di U osservato
nei mitocondri d;i tripanosomi sembra essere caratterislico
dei protozoi cinetoplastidi. L'editing per inserimento di C
osservato nei mitocondri di Physarum ha qualche somiglianza con l'editing dei tripanosomi, ma per giungere a
una conclusione e necessario oltenere ulteriori informazioni. L'editing per sostituzione di C con U osservato nei
mitocondri delle piante e nell'mRNA per la apoB, come
anche quello per sostituzione di A con 1 dei recenori umani
del glutammato, coinvolgono entrambi eventi di deamminazione, ma le caraneristiche strutturali, i meccanismi calalitici e i siti di legame all'RNA sono diversi per le due
reazioni. Una caranerisiica in comune tra l'editing per sostituzione di A con I e quello per inserimento e delezione
delle U, e la necessita di RNA a doppio filamento come
elemento di riconoscimento.
L'imponanza biologica dei vari tipi di editing e evidenziata dal fatto che queste modificazioni sono spesso regolale
e hanno conseguenze fenotipiche significative. Di ceno in
fiituro verranno scoperti ulteriori esempi di editing, in special modo non appena sarannu disponibili le sequenze genomiche complete di vari organismi.
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