UNITA’ DI RICERCA DI TORINO
Direttore: Prof. Silvio Aime
Attività scientifiche del gruppo S. Aime
L’attività di ricerca relativa all’anno 2001, nel campo dello studio di nuovi agenti di
contrasto per MRI, si è svolta seguendo diverse linee di ricerca:
Tecniche di auto-assemblaggio per l’amplificazione del Segnale
Lo sviluppo di sistemi in grado di visualizzare recettori sovraespressi da cellule tumorali
sarebbe di estremo interesse poiché, rispetto agli analoghi approcci utilizzati in Medicina
Nucleare, l’approccio MRI si avvale della grande superiorità in termini di risoluzione di
immagine. Purtroppo il numero relativamente basso di questi recettori rende problematico
questo approccio . Si rende quindi necessario mettere a punto sistemi in grado di accumulare
un gran numero di complessi paramagnetici in prossimità di ciascun sito recettoriale.
L’unità operativa ha indirizzato la sua attività di ricerca alla messa a punto di procedure di
auto-assemblaggio utili ad accumulare unità di Agenti di contrasto paramagnetici ad un
particolare sito di interesse. Sono stati sintetizzati tre nuovi complessi derivati del DOTA
portanti sulla loro superficie esterna gruppi carbossilici e fosfonoci che promuovono
l’interazione con i gruppi carichi positivamente di Polilisine. Le loro strutture sono state
determinate mediante la spettroscopia NMR (1 H, 13C e 31P). L’affinità di questi complessi
con la Polilisina è stata misurata con una procedura rilassometrica per la quale è stato
necessario utilizzare i complessi di Gd(III), che è uno ione dotato di una alto momento
magnetico. I risultati ottenuti hanno indicato che il complesso che presenta l’affinità maggiore
è quello portante due gruppi fosfonici (K A > 105). In questo settore il lavoro è continuato con
la sintesi (in collaborazione con il Prof. Pedone) di una polilisina coniugata al peptide CCK-8
in grado di riconoscere recettori specifici sovraespressi in presenza di determinate patologie
tumorali. E’ stato verificato che la coniugazione al CCK-8 non ha alterato il binding del
complesso con i due residui fosfonici alla Polilisina.
Una seconda procedura di auto-assemblaggio ha riguardato la formazione di addotti “ hostguest” con la Policiclodestrina (oligomeri contenenti un numero variabile di unità di βCiclodestrina).
A questo fine sono stati sintetizzati tre leganti (due ciclici e uno lineare) contenenti sulla loro
superficie tre sostituenti idrofobici ( -CH2 -O-CH2-R, dove R = C6 H5 e C6 H11 ). Anche in
questo caso la valutazione dell’affinità di questi complessi con le cavità della
Policiclodestrina
è stata condotta con tecniche rilassometriche utilizzando i derivati
paramagnetici dello ione Gd(III). Il “binding” risulta particolarmente buono per il complesso
contenente R = cicloesile.
Infine è stata intrapresa la sintesi di un sistema in cui ad un anello porfirinico centrale sono
stati legati quattro chelanti derivati del DTPA (Lys-DTPA). In tale sistema la forza repulsiva
tra i residui di DTPA carichi negativamente può essere modulata tramite la chelazione di ioni
Gd(III). Il sistema completamente saturato con quattro Gd(III), [Por(DTPA)4 Gd4 ], è in grado
di formare aggregati di grandi dimensioni (ca. 32 ioni Gd(III)) dovuti da una parte alla
diminuzione della carica negativa totale dei chelanti Lys-DTPA, che impedisce l’aggrazione
del legante come tale, e dall’altra all’interazione elettrostatica tra l’anello porfirinico carico
positivamente e i residui anionici di [Gd(Lys-DTPA)]2-.
Imaging Molecolare
In questi ultimi tempi è stata registrata una certa attenzione sulla possibilità di “labellare”
specifiche tipologie cellulari per poterle visualizzare in procedure MRI. Tali procedure di
imaging cellulare possono essere perseguite attraverso diverse vie:
a) Riconoscimento di recettori sovraespressi dalle cellule tumorali
Un’applicazione legata ad un affinamento degli attuali protocolli diagnostici riguarda il
“targeting” sui recettori sovraespressi nelle cellule tumorali. In questi casi il “labelling”
cellulare è stato perseguito attraverso la sintesi di opportuni complessi di Gd(III)
funzionalizzati con
particolari peptidi in grado di riconoscere tali recettori; la
visualizzazione può avvenire sia attraverso l’accumulo dei MdC sulla superficie esterna
della membrana cellulare, sia attraverso la loro internalizzazione mediata da opportuni
recettori rigenerabili.
b) Espressione di recettori BA e OTAP e internalizzazione di MdC opportunamente
funzionalizzati
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E’ noto che MdC costituiti da complessi di Gd(III) funzionalizzati con residui derivati da
acidi colici o dall’acido iopanoico sono internalizzati negli epatociti attraverso i recettori
degli acidi biliari ( BA) e del sistema proteico di trasporto degli anioni organici (OTAP).
Si è studiata l’internalizzazione di un complesso derivato dal Gd-DTPA funzionalizzato
con un acido colico utilizzando epatociti di ratto prodotti da cultura primaria e due linee di
epatomi: le HTC (ratto) e HepG2 (umane). Il complesso, viene riconosciuto bene dai
recettori (OATP) presenti sulle membrane degli epatociti mentre la quantità internalizzata
dagli epatomi è praticamente trascurabile.
L’osservazione MRI, con un MdC epatospecifico, del fegato rivelerebbe quindi la presenza
di metastasi come aree non contrastate perchè le cellule costituenti queste metastasi non
sono in grado di interna lizzare il MdC, a differenza delle circostanti cellule epatiche.
c) Utilizzo di sistemi di trasporto cellulare per l’internalizzazione di MdC opportunamente
funzionalizzati.
Le cellule tumorali esibiscono un aumento della sintesi di DNA e del metabolismo
energetico rispetto alle analoghe non trasformate. Ciò determina una maggiore necessità di
determinati metaboliti, tra cui aminoacidi e composti cationici quali ad esempio arginina,
che devono quindi essere trasportati attraverso la membrana cellulare. Numerosi studi,
condotti in particolare su fegato di ratto, hanno dimostrato che, sebbene le linee cellulari di
epatoma esprimano sistemi di trasporto presenti negli epatociti normali, negli epatomi
esistono sistemi addizionali (ad es. nuove isoforme di tali proteine recettoriali dette OCT,
Organic Cations Transporters).
Da queste considerazioni è emerso l’interesse nello sfruttare tali sistemi OCT per
sviluppare agenti di contrasto in MRI suscettibili di internalizzazione e rivelazione di un
eventuale stato patologico dell’organo di interesse.
Si è quindi proceduto alla coniugazione di un noto complesso di Gd (III) (GdDTPA) con
un’amina primaria contenente una funzione guanidinica: l’agmatina; il composto derivante
e’ il GdDTPA-BAG. Visto che studi recenti hanno attribuito l’internalizzazione cellulare
dell’agmatina allo stesso trasportatore della putrescina, si è sfruttato tale recettore per
veicolare il mezzo di contrasto, ottenendo ottimi risultati.
Attività scientifiche del gruppo B. Fubini
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La ricerca ha evidenziato importanti aspetti della chimica di alcuni particolati nocivi
tradizionalmente studiati nel nostro laboratorio, gli amianti e le silici cristalline. Per quanto
riguarda gli amianti lo studio della chimica della superficie ed, in particolare, la
caratterizzazione del ferro superficiale e lo studio della sua reattività, sono stati determinanti
nella comprensione di alcuni meccanismi biochimici alla base della loro tossicità, ed hanno
permesso di studiare possibili metodi di inattivazione di tipo fisico (riscaldamento termico) e
chimico (polimerizzazioni catalizzate dalla superficie). Per quanto riguarda la silice sono stati
affrontati alcuni aspetti riguardanti la variabilità nella risposta biologica di quarzi aventi
differenti proprietà di superficie legati alla potenziale cancerogenicità della silice cristallina.
Inoltre, è stata studiata la correlazione tra esposizione a diverse forme di silice ed alcune gravi
malattie renali di tipo autoimmune.
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