Diapositiva 1 - Laboratorio Virologia Cosenza

Corso di formazione AO Cosenza
OTTIMIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICA:
QUALITA’ DEL CAMPIONE BIOLOGICO”
15 OTTOBRE 2013
U.O. DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA CLINICA E MOLECOLARE
Olga Savino
DIAGNOSI
DIRETTA
Dimostrazione della presenza
di un microorganismo o di
suoi componenti in campioni
biologici
DIAGNOSI
INDIRETTA
Dimostrazione della presenza
di una risposta anticorpale
specifica nei confronti di un
microorganismo
Dipendono dall’infettività del virus
Dimostrazione di un microorganismo (virus)
mediante coltura substrati cellulari
METODO TRADIZIONALE
METODO RAPIDO
• Inoculazione in colture
cellulari fatte crescere su
vetrino
• Inoculazione in colture
cellulari fatte crescere su
piastre a 24 pozzetti
• incubazione a 37°C
presenza di CO2 5%
• incubazione a 37°C in
presenza di CO2 5%
in
• immunofluorescenza
con
anticorpi monoclonali antiproteine virali specifiche
•
risposta: 24-48h
• osservazione giornaliera al
microscopio ottico per
evidenziare la compara di ECP
(effetto citopatico) virusspecifico
•
CMV
risposta: 1-14 giorni
CPE da CMV
virus influenza A
virus parainfluenza 2
adenovirus
virus respiratorio sinciziale
Esiti positivi per antigeni virali mediante immunofluorescenza
su colture cellulari 18-24 ore dopo l’inoculazione
Dimostrazione diretta di un microorganismo o di suoi
componenti in campioni biologici
1
2
Ricerca diretta del
virus mediante
microscopia elettronica
Ricerca diretta di proteine
specifiche virali mediante:
• Immunofluorescenza,
• Test immunoenzimatici
• Test immunocromatografici
• Test di agglutinazione rapida al lattice
Test ELISA manuali o
automatizzati
Influenza virus
RSV (IF)
Calicivirus
Test rapido per
l’influenza
Scraping vescicole
VZV
Sangue PMN
Esempi:
presenza di un virus direttamente
nel campione biologico
 rapidità di esecuzione (stessa
giornata di arrivo del campione o
dopo 24 h)
 evidenziano
sia
particelle
infettanti che non infettanti
CMV
Dimostrazione diretta di un microorganismo o di suoi
componenti in campioni biologici
1
2
Ricerca diretta del
virus mediante
microscopia elettronica
Ricerca diretta di proteine
specifiche virali mediante:
• Immunofluorescenza,
• Test immunoenzimatici
3
ricerca di acidi nucleici
virali
mediante
test
biomolecolari
• Test immunocromatografici
• Test di agglutinazione rapida al lattice
Test ELISA manuali o
automatizzati
Influenza virus
HPV (ibridazione in
situ)
Rotavirus
(elettroferotipo)
RSV (IF)
rt-PCR
Calicivirus
Test rapido per
l’influenza
Real Time
PCR
PCR MULTIPLEX
MICROARRAY
Tecniche quantitative di
amplificazione geniche
valutazione contemporanea di target
virali o batterici diversi
Normalized fluorescence
Fluorescence signal
0
10
20
30
40
Time (minutes)
50
60
Sangue
Tessuti
criopreservati,
paraffinati,
formalinizzati
Campioni
bioptici
Urine
Saliva
Aspirato midollare
Feci
CAMPIONI ANALIZZABILI
CON TECNICHE MOLECOLARI
Liquor
Tamponi
Altri fluidi
corporei
(faringeo,nasofaringeo,
endocervicali, vulvari,
congiuntivali ecc.)
Aspirato
nasofaringeo
Espettorato
Liquido
amniotico/villi coriali
Liquido seminale
Esfoliato
endocervicale
Liquido da lavaggio
broncoalveolare
Che cosa ricercano le
tecniche molecolari?
Sequenze del genoma a DNA o
RNA dei microorgaismi
RNA
DNA
1. NON NECESSARIA LA VITALITÀ DELL’AGENTE PATOGENO
2. INDISPENSABILE:
• integrità dell’acido nucleico (qualità)
• quantità dell’acido nucleico
DNA
Il DNA è una molecola stabile per la presenza di due catene
associate
dalla presenza di molti legami deboli. Questa
disposizione rende molto difficile la dissociazione della
molecola di DNA
RNA
Struttura a singola elica,
meno stabile del DNA
• facilmente e rapidamente degradabile
• vulnerabile all’idrolisi spontanea in condizioni di pH, temperature elevate
ed in presenza di cationi bivalenti quali lo zinco
FALSI NEGATIVI: DNA, RNA
INATTIVAZIONE O INIBIZIONE
1. FATTORI INTRINSECI
- enzimi presenti nel campione
- inibitori aspecifici
2. FATTORI ESTRINSECI
- danno ossidativo
- enzimi presenti nell’ambiente
- pollini
(meno di 10 grani di polline sono in grado di digerire
enzimaticamente componenti essenziali delle reazioni di amplificazione)
- polvere dei guanti
Wilson I.G.: Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification. App and Environ Microbiol 1997; 63(10): 3741-3751
Classificazione in
base al substrato
Classificazione in
base all’attività
ESONUCLEASI:
determinano la
rottura del legame fosfodiestereo a livello
dell’ultimo nucleotide del filamento:
DESOSSIRIBONUCLEASI
(DNAsi)
NUCLEASI
RIBONUCLEASI
(RNAsi)
- 3’ esonucleasi
- 5’ esonucleasi
ENDONUCLEASI:
determinano la
rottura di un legame fosfodiestereo
all’interno del filamento
Alcune nucleasi
sono dotate di
entrambe
le
attività
DNAsi
• Sono meno diffuse e meno stabili delle RNAsi
• Vengono inattivate a 121°C per 15 minuti
RNAsi
• Sono enzimi molto diffusi
• Sono molto attive su qualsiasi RNA non protetto, molto
resistenti al calore, alla sterilizzazione in autoclave e
all’irradiazione
• Sono inattivate dal Guanidinio Tiocianato e da agenti
riducenti quali il -mercaptoetanolo
FONTI DI RNAsi E DNAsi:
corpo umano (mani, viso, braccia , capelli)
FALSI POSITIVI: DNA, RNA
CONTAMINAZIONE
Endogena
(campione, provette)
 Esogena
(microorganismi, polvere, amplificati)
Wilson I.G.: Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification. App and Environ Microbiol 1997; 63(10): 3741-3751
1. Operare in asepsi per evitare la contaminazione
da agenti inattivanti oltre che da acidi nucleici
estranei
2. Utilizzo materiali (provette, puntali, soluzioni
ecc.) DNAsi e RNAsi free
RACCOLTA,
CONSERVAZIONE
E
TRASPORTO DEL CAMPIONE PER
DIAGNOSI VIROLOGICA DIRETTA
TAMPONI,
ASPIRATI,
CAMPIONI
BIOPTICI
O
AUTOPTICI:
• immergere in terreno di trasporto per virus
LIQUOR, URINA, L.PLEURICO, FECI, altro
• raccogliere in contenitore sterile
Mantenere a 2-8°C e invio in laboratorio entro 2-3
ore dal momento del prelievo
SANGUE
1.Indagini molecolari su sangue intero
CMV, EBV, HHV6, HHV8  TAPPO VIOLA con EDTA
2.
Indagini molecolari su plasma o siero
HCV RNA - HBV DNA  TAPPO ROSSO
HIV RNA
 TAPPO VIOLA
I CAMPIONI NON POSSONO ESSERE CONSERVATI
INVIO DEL CAMPIONE A TEMPERATURA AMBIENTE
DEVONO ESSERE PROCESSATI SUBITO!!
DIAGNOSI DIRETTA:
Qualche esempio…………………………..
INFEZIONI VIRALI
DELL’APPARATO GENITO URINARIO
HPV
Iter diagnostico
Campioni per ricerca DNA di HPV
Liquido seminale, Urine
primo mitto, Biopsie
del tratto urogenitale
e anale
Tamponi o scraping
endocervicali,
vaginali, vulvari,
anali,perianali
nella femmina
Tamponi uretrali, da
solco balanoprepuziale,glande,
scrapings da lesione
anale, perianale e
pene nel maschio
Contenitore
sterile
LIQUIDO
SEMINALE:
diluire 1:10 in terreno di
trasporto e congelare a 20°C
URINE:
1,5 ml. di
terreno di
trasporto
centrifugare, risospendere il
pellet in terreno di trasporto
e congelare a -20°C
ALTRI CAMPIONI:
congelare a -20°C
AZIENDA OSPEDALIERA DI COSENZA
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
CLINICA E MOLECOLARE
direttore: dr.Cristina Giraldi
SETTORE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Tampone cervico-vaginale
Ricerca e tipizzazione del Papillomavirus Umano (HPV)
mediante Polimerase Chain Reaction
cognome
provenienza
data di nascita
indirizzo
notizie cliniche
nome
medico curante
cod. fiscale
n.tessera sanitaria
esami citologici o istologici :
topografia cervicale, vaginale, vulvare
IL MEDICO ESECUTORE ( firma leggibile)
Raccolta del campione dalla cervice
Cervice normale
Cervice : condilomi piatti
Cervice : condilomatosi produttiva
Vagina : condilomi acuminati
Dove si processano i
campioni?
SETTORE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
INFEZIONI CONGENITE,
CONNATALI E PERINATALI
STATO IMMUNITARIO
IgM+, IgG+
DATAZIONE INFEZIONE
IgG avidità bassa
Infezione in gravidanza
III° livello diagnostico
DIAGNOSI PRENATALE
test biomolecolari
sangue materno - placenta - sangue cordale - l.amniotico - l.pleurico, ascitico e tessuti fetali
DIAGNOSI PRENATALE
Quando?
 dopo 8 settimane dall’infezione materna
 > 18^ settimana di gestazione
(21^-22^ sett.)
CONGENITAL CMV INFECTION
PRIMARY
INFECTION
PREGNANT WOMEN
Transplacentar route
FETUS
Amniocentesi: 21-22 settimana di gestazione
Isolamento virale (shell vial)
CMV DNA PCR
 il virus viene eliminato nel liquido amniotico attraverso l’urina e solo
dopo la 20-21 SG si ha una consistente diuresi fetale
 CMV è un virus a replicazione lenta e occorrono circa 6-9 settimane
dopo l’infezione materna affinchè il virus venga eliminato dal feto con
l’urina nel liquido amniotico
INFEZIONI DA VIRUS
A TROPISMO EPATICO
INFEZIONI DA VIRUS
DELL’IMMUNODEFICIENZA UMANA (HIV)
Hepatitis C Virus (HCV)
Envelope
Core
Envelope
glycoproteine
Viral RNA (9400 nucleotides)
55 – 65 mm
L’infezione cronica da
HCV
interessa
circa il 3%
della popolazione
mondiale
Storia naturale infezione HCV
100 infezioni acute HCV
80% infezione persistente
20% guarigione
80 pazienti
20 pazienti
30% stabile, cronica,
nonprogressiva
24 pazienti
40% variabile
progressione
32 pazienti
30% severa
progressiva epatite
24 pazienti
terapia
cirrosi, HCC,
trapianto di fegato, morte
Fallimento
terapia (~40%)
22 pazienti
Adapted from Alter and Seeff. Semin Liver Dis. 2000.
Risposta
sostenuta (~60%)
34 pazienti
HCV utilità test virologici
HCV RNA, è un marker di replicazioneof HCV
Pattern sierologici di guarigione HCV
Pattern sierologici di infezione cronica HCV
Anti-HCV
Symptoms +/-
Anti-HCV
Symptoms +/-
HCV RNA
titer
HCV RNA
titer
ALT
ALT
normal
0
1
2
months
3
4
5
6
1
2
years
3
Time after Exposure
Chevaliez S, Pawlotsky J-M. Clin Liver Dis. 2005.
normal
4
0
1
2
months
3
4
5
6
1
Time after Exposure
2
years
3
4
HCVAb +
HCV RNA QL
HCV RNA +, ALT
decisione terapia
HCV RNA -/+
ALT N
K mesi anni
No terapia
Resultati terapia HCV: % di risposta
sostenuta virologica (SVR)
70
63
60
50
41
39
IFN
+ RBV
1998
PEG-IFN
2000-2002
40
30
20
10
13
6
0
IFN
24 wk
1998
IFN
48 wk
1998
PEG-IFN
+ RBV
2001-2004
*Intent-to-treat analysis
1. McHutchison et al. N Engl J Med. 1998. 2. Poynard et al. Lancet. 1998. 3. Zeuzem et al.
N Engl J Med. 2000. 4. Lindsay et al. Hepatology. 2001. 5. Fried et al. N Engl J Med. 2002.
6. Manns et al. Lancet. 2001. 7. Hadziyannis et al. Ann Intern Med. 2004.
HCV-RNA nel follow up terapeutico
antivirale
HCV RNA
prima
durante
fine terapia
Predittiva di
SVR
Identifica
i soggetti NR
Predittiva di
relapse
SVR: risposta virologica sostenuta
NR: non responder alla terapia
dopo 6 mesi
dalla terapia
SVR
FOLLOW UP VIROLOGICI IN TERAPIA
TERAPIA
NON
RESPONDER
RELAPSE
BREAK
THROUGH
RESPONDER
LONG TERM
HCV RNA
HCV RNA
HCV RNA
HCV RNA
TERAPIA
HCV RNA
TERAPIA
HCV RNA
TERAPIA
tempo
Quale test si deve eseguire per
individuare un’infezione HCV correlata?
Ricerca anticorpi anti-HCV
O
Ricerca HCV RNA
Ricerca anticorpi anti-HCV
nel follow up terapeutico antivirale
quale ricerca e quale prelievo?
Provetta sierologica per ricerca di HCV
RNA quali-quantitativo
HIV
RESPONSABILE DELLA PIÙ GRANDE
PANDEMIA
DI TIPO COMPORTAMENTALE
Stime OMS
nel mondo: ~ 33.4 milioni di soggetti infetti
oltre 42 milioni sono stati finora i decessi cumulativi per AIDS
HIV
diagnosi sierologica
INFEZIONE ACUTA



Anticorpi anti-HIV






Sindrome similmononucleosica
Rash maculopapulare
Sintomi
gastrointestinali
Encefalopatia
CD4 linfopenia
CD8 linfocitosi
Anemia
Trombocitopenia
Febbre
ALGORITMO DIAGNOSTICO (1)
Adulti, adolescenti, bambini ≥ 18 mesi
TEST DI SCREENING
(ELISA)
POS
NEG
TEST DI CONFERMA
(WB)
POS
 HIV-RNA nel plasma
 CD4 e CD8
Il follow-up del paziente infetto
 HIV-1 RNA + CD4 e
CD8
Definire l’andamento
dell’infezione sotto il profilo
prognostico
Individuare la necessità
di somministrazione di farmaci
 HIV-1 RNA viral load
Valutare l’efficacia
del regime terapeutico in atto
Quale test si deve eseguire per
individuare un’infezione da HIV?
1. Ricerca anticorpi anti-HIV o
2. Ricerca HIV RNA
Ricerca anticorpi anti-HIV
grazie