Assorbanza

Corso di Chimica Generale - CHI
083424 - CCS Ingegneria Chimica
A.A. 2015/2016 (I° Semestre)
SPETTROSCOPIA UV-VISIBILE
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento di CMIC “Giulio Natta”
https://corsi.chem.polimi.it/citterio/
Spettroscopia
•
A insieme di strumenti per misurare le proprietà molecolari.
•
La spettroscopia è l’assorbimento o l’emissione di luce.
•
L’analisi spettrochimica può esser definita come l’uso dello
spettro della radiazione elettromagnetica in analisi qualitative
e quantitative.
• Quando una
molecola
assorbe luce,
la sua energia
aumenta
Attilio Citterio
• Quando una
molecola
emette luce,
la sua energia
diminuisce
Fotoni o Quanti di Luce
•
Atomi e molecole assorbono solo alcune frequenza, ma
non altre.
0
260
•
240
Ci sono due ragioni per questa osservazione.
 L’energia assorbita o emessa è proporzionale alla frequenza, .
Energia di un fotone = h
Costante di Plank
e–
Attilio Citterio
Effetto Fotoelettrico (emissione di elettroni
da un metallo solido irraggiato)
Elettrodo metallico
illuminato
Batteria
-
eLuce incidente
da sorgente
+
+
e-
Generatore
a voltaggio
variabile
-
+
+
Elettrodo di raccolta
-
Amperometro
Misura dell’energia cinetica degli
elettroni emessi (fotoelettroni) =
Voltaggio per cui la corrente è zero
Attilio Citterio
Energia dei Fotoelettroni Emessi da Metalli
Ecin./ kJ mol-1
Infrarosso
Visibile
Ultravioletto
400
Cs
300
K
Mg
Zn
Ni Pt
200
100
1
2 3
4 5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
o del Cesio
x
1014
 (Hz)
Pendenza = h (costante di Plank)
Ecin. = Efot.- Eemis.= h - 
Attilio Citterio
 = h 
Ecin. = h (- )
Peculiarità dell’Effetto Fotoelettrico
L’emissione fotoelettrica dimostra che l’energia
dell’elettrone:
 Aumenta se si aumenta 
 Non è influenzata aumentando l’intensità
 L’intensità influenza il numero di elettroni
emessi per secondo
Attilio Citterio
Quantizzazione dell’Energia Molecolare
Le energie molecolari sono quantizzate
energia
energia
Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono
permesse
Attilio Citterio
Quantizzazione dell’Energia Molecolare
Le energie molecolari sono quantizzate
energia
energia
Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono
permesse
Attilio Citterio
Altre Evidenze della Quantizzazione
•
Assorbimento del corpo nero (Panck)
•
Capacità termica dei solidi
a bassa temperatura
quindi
E = h
Attilio Citterio
Spettrometri
• sorgente
• monocromatore
(selettore di frequenza)
• campione
• rivelatore
Attilio Citterio
Strumenti a Dispersione
Usati negli spettrometri visibile/ultravioletto e nei
vecchi tipi di strumenti infrarosso
Attilio Citterio
Strumenti a Trasformata di Fourier
Richiedono estesi calcoli per convertire il segnale in
uno spettro. Usati nei moderni strumenti.
Attilio Citterio
Lo Spettro Elettromagnetico
10-14
10-12
10-10
10-8
106
103
1
10-3
10-6
10-4
10-2
1
102
104
106
Lunghezza d’onda [m]
=c/
E = h
Attilio Citterio
Infrasuoni
Suoni
(udibili)
Ultrasuoni
Radio
NMR
Infrarosso
Televisione
Ultravioletto
Visibile
Visibile
Raggi X
Raggi Gamma
Raggi Cosmici
Ultravioletto
Frequenza [Hz]
1010
1015 1014
Radar
1017
Microonde
1019
Infrarosso
1022
108
1010
Transizioni Elettroniche nella Formaldeide
transizione
  *
transizione
(187 nm)
n  *
(285 nm)
Attilio Citterio
Transizioni Elettroniche e Spettri di Atomi
E
S2
S1
E
I
S0  S2
S0  S1
S0
S0S2 S0S1 
Attilio Citterio
Transizioni Elettroniche e Spettri UV-visibile
in Molecole
livelli elettronici
livelli vibrazionali
livelli rotazionali
E
S2
massimi di
assorbimento
(max.)
I
S1
Ampiezza
della banda a
metà altezza
Su
= transizioni
elettroniche
Attilio Citterio

Spettri Derivati di una Banda di Assorbanza
Gaussiana
Assorbanza
Assorbanza
Assorbanza:
A  f ( )
1.0
1.0
0.5
0.5
0.0
0.0
2° derivata
1° derivata
2.0E-04
0.01
1a Derivata:
dA
 f ' ( )
d
0.0E+00
-2.0E-04
0.00
-4.0E-04
-0.01
-6.0E-04
2
2a Derivata:
d A
''

f
( )
2
d
3° derivata
4° derivata
2.0E-05
1.0E-06
1.0E-05
5.0E-07
0.0E+00
0.0E+00
-1.0E-05
-5.0E-07
-2.0E-05
300
Attilio Citterio
400
500
600
700
300
400
500
600
700
Aumento Risoluzione
Assorbanza
• Sovrapposizione di 2
bande Gaussiane con
un NBW di 40 nm
separate da 30 nm
1.5
1.0
0.5
0.0
400
500
600
500
600
4° derivata
5.0E-06
• Separate alla 4a
derivata
0.0E+00
-5.0E-06
400
Attilio Citterio
Trasmissione e Colore
L’occhio umano vede il colore complementare di quello
che è assorbito
Attilio Citterio
Assorbanza e Colori Complementari
800
700
600
500
400
Lunghezza
d’onda [nm]
Colore
assorbito
Colore
complementare
650-780
rosso
blu verde
595-650
arancio
verde blu
560-595
giallo verde
500-560
verde
490-500
blu verde
rosso
480-490
verde blu
arancio
435-480
blu
380-435
violetto
Attilio Citterio
porpora
rosso-porpora
giallo
giallo-verde
Trasmittanza
Trasmissione e Concentrazione
La Legge di Lambert-Bouguer
100%
50%
25%
12,5%
6,75%
Io
I1
I2
I3
I4
3,125%
I5
100%
50%
25%
Lunghezza Percorso
T  I / I 0  e  Cammino Cost.
Attilio Citterio
Trasmittanza e Cammino Ottico
La Legge di Beer
100%
I0
C
50%
I1
100%
Trasmissione
100%
2C 25%
I2
100%
3C 12.5%
I3
100%
4C 6.75%
I4
50%
100%
5C 3.125%
I5
25%
Concentrazione
T  I / I 0  e  Concentrazione Cost.
Attilio Citterio
La Legge di Lambert-Bouguer-Beer
Assorbanza
1.5
1.0
0.5
0.0
Concentrazione
A   log T   log  I / I 0   log  I 0 / I     b  c
Attilio Citterio
Miscela Bicomponente
1.5
y
x
x+y
Assorbanza
1.0
0.5
0.0
200
210
220
Lunghezza d’onda
230
240
Esempio di miscela bi-componente con scarsa
sovrapposizione spettrale
Attilio Citterio
Miscela Bi-componente
1.5
y
x
x+y
Assorbanza
1.0
0.5
0.0
200
210
220
Lunghezza d’onda
230
240
Esempio di miscela bi-componente con significativa
sovrapposizione spettrale
Attilio Citterio
Influenza di un Errore Casuale del 10%
1.5
Assorbanza
Vero
Misurato
1.0
0.5
0.0
200
210
230
220
Lunghezza d’onda
240
Influenza sulle concentrazioni calcolate
• Scarsa sovrapposizione spettrale:
Errore 10%
• Significativa sovrapposizione spettrale: Dipende dalla similarità, può essere
molto più alto (p.es. 100%)
Attilio Citterio
Spettri di Assorbimento di Derivati
dell’Emoglobina
Sulfemoglobina
Ossiemoglobina
Carbossiemoglobina
Emoglobina (pH 7.0-7.4)
Deossiemoglobina
Assorbanza [AU]
0.2
0.1
0.0
500
550
600
Lunghezza d’onda [nm]
Attilio Citterio
650
• Buona intensità
nell’intervallo UV
• Utile intensità
nell’intervallo del
visibile
• Basso rumore di
fondo
• Intensità calante
nel tempo
Irradiazione Spettrale
Intensità dello Spettro della Lampada ad
Arco di Deuterio
1
0.1
0.01
0.00
200
300
400
500
600
Lunghezza d’onda [nm]
Attilio Citterio
700
• Bassa intensità
nell’intervallo UV
• Buona intensità
nell’intervallo
visibile
• Rumore di fondo
molto basso
Irraggiamento Spettrale
Intensità dello Spettro della Lampada a
Tungsteno-Alogena
• Basso drift
10
1
0.1
0.01
200
400
600
800
Lunghezza d’onda [nm]
Attilio Citterio
1000
• Alta intensità
nell’intervallo UV
• Alta intensità
nell’intervallo
visibile
• Rumore di fondo
medio
Irraggiamento Spettrale
Intensità dello Spettro della Lampada a
Xeno
100
10
1
0.1
0.01
200
400
600
800
Lunghezza d’onda [nm]
Attilio Citterio
1000
Dispositivi di Dispersione
Prisma
• Dispersione non-lineare
• Sensibile alla temperatura
Reticolo
• Dispersione lineare
• Differenti ordini
Primo ordine
Attilio Citterio
Secondo ordine
Dispositivo Fotomoltiplicatore
• Alta sensibilità a
bassi livelli di luce
• Il materiale catodico
determina
sensibilità spettrale
• Buon
segnale/rumore di
fondo
Catodo
• Sensibile agli urti
Attilio Citterio
Anodo
Il Rivelatore a Fotodiodi
Fotone
Contatto metallico
• Ampio intervallo
dinamico
• Rapporto
segnale/rumore
molto buono ad
alti livelli di luce
• Dispositivo a stato
solido
SiO2
strato p
Regione intrinseca
strato n
Attilio Citterio
Blocco d’oro
Diagramma Schematico di un Dispositivo a
Fotodiodi
Luce
• Stesse
caratteristiche
dei fotodiodi
• Dispositivo a
stato solido
• Veloci cicli di
lettura
Fotodiodo
Capacitore
Registro
deviazione
Deviatore
transistor
Linea video
Ciclo di lettura
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Rivelatore
Monocromatore
Campione
Fessura
d’uscita
Dispositivo
di dispersione
Sorgente
Fessura
d’ingresso
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Batteria di diodi
Policromatore
Campione
Sorgente
Dispositivo
di dispersione
Fessura
d’ingresso
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Shutter
Lente
Campione
Lente
Lampada a
Tunsteno
Lampada a
deuterio
Fessura
Reticolo
Diode array a
1024-elementi
Sistema ottico di uno spettrofotometro HP 8453 a “diode array”
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Monocromatore
Fessura
d’uscita
Dispositivo
di dispersione
Fessura
Sorgente d’ingresso
Riferimento
Chopper
Rivelatore
Campione
Sistema ottico di uno spettrofotometro a doppio raggio
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Lampada visibile
Cella del
riferimento
Lampada UV
Specchi a
lati di cubo
Elisse
sorgente
Specchio
sorgente
Elisse
spettrografica
Specchio
orientante il
raggio inferiore
UV
Cella del
campione
Visibile
Reticolo
olografico
Uscita
Spettrografo e
batteria
rivelatore
Specchi a
lati di cubo
Specchio orientante il
raggio inferiore
Sistema ottico dello spettrofotometro a diode array HP 8450A
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Monocromatore
Fessura
d’uscita
Dispositivo
di dispersione
Sorgente
Fessura
d’ingresso
Riferimento
Rivelatore
Campione
Rivelatore
Deviatore
del raggio
Sistema ottico di uno spettrofotometro a raggio sdoppiato
Attilio Citterio
Definizione di Risoluzione
Segnale in uscita
dal rivelatore
intensità
Smax
0.8xSmax
lunghezza d’onda
lunghezza d’onda
La risoluzione spettrale è una misura della capacità di uno
strumento di differenziare tra due lunghezze d’onda adiacenti
Attilio Citterio
Ampiezza di Banda Spettrale
intensità
I
0.5 I
SBW
lunghezza d’onda
La SBW è definita come l’ampiezza, a metà dell’intensità
massima, della banda di luce uscente dal monocromatore
Attilio Citterio
Ampiezza di Banda Spettrale Naturale
assorbanza
A
0.5 A
NBW
lunghezza d’onda
La NBW è l’ampiezza della banda di assorbimento del
campione a metà del massimo di assorbimento
Attilio Citterio
Effetto della SBW sulla Forma della Banda
assorbanza
1 nm
5 nm
10 nm
20 nm
50 nm
lunghezza d’onda
Il rapporto SBW/NBW deve essere 0.1 o migliore per dare una
misura di assorbanza con un’accuratezza del 99.5% o migliore.
Attilio Citterio
Assorbanza
Effetto del Campionamento Digitale
Spettro
originale
Assorbanza
Processo di
campionamento
Spettro
digitalizzato
lunghezza d’onda
Anche l’intervallo di campionamento usato per digitalizzare lo
spettro per la valutazione e lo stoccaggio da parte di un
computer influenza la risoluzione
Attilio Citterio
Resettabilità della Lunghezza d’Onda
0.20
Errore = 0.0 AU
Assorbanza [AU]
0.15
0.10
Errore = 0.1 AU (10%)
0.05
0.00
220
240
260
280
lunghezza d’onda [nm]
300
Influenza della resettabilità della lunghezza d’onda sulle misure al
massimo e sulla pendenza della banda di un assorbimento
Attilio Citterio
Effetto della Luce Diffusa
4.0
0.00 % di Luce Diffusa
0.01 % di Luce Diffusa
0.10 % di Luce Diffusa
1.00 % di Luce Diffusa
Assorbanza misurata
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
0.5
1.0
2.0
1.5
2.5
Assorbanza vera
3.0
3.5
4.0
Effetto di vari livelli di luce diffusa sulle assorbanze misurate
confrontate con le assorbanze reali
Attilio Citterio
Errore di Assorbanza Teorico
15.0
Errore %
10.0
5.0
0.0
-5.0
-10.0
Curva dell’errore da luce diffusa
Curva ’errore luce diffusa + noise
Curva errore luce diffusa - noise
-15.0
-20.0
-25.0
0.001
0.01
0.1
Assorbanza
1
4
L’errore totale a qualsiasi assorbanza è la somma degli errori
dovuti alla luce diffusa e al rumore di fondo (rumore dei fotoni ed
elettronico)
Attilio Citterio
Effetto del Drift
0.20
Errore
Assorbanza [AU]
0.15
0.10
0.05
0.00
220 230
240 250 260 270 280 290 300 310
lunghezza d’onda [nm]
320
Il drift è una potenziale causa di errore fotometrico e deriva
dalle variazioni tra le misure di I0 e I
Attilio Citterio
Caratteristiche di Trasmissione dei Materiali
di Cella
100
Silice
fusa
Trasmittanza [%]
80
Quarzo
fuso
60
40
Plastica
acrilica
20
0
Vetro
Vetro
ottico
200
250
300
350
lunghezza d’onda [nm]
400
Notare che tutti i materiali mostrano approssimativamente
almeno il 10% di perdita nella trasmittanza a tutte le lunghezze
d’onda.
Attilio Citterio
Tipi di Celle 1
(a)
(b)
Cella Standard rettangolare aperta in testa (a)
e cella con apertura (b) per volumi limitati di campione
Attilio Citterio
Tipi di Celle (II)
(a)
(b)
Micro cella (a) per volumi molto piccoli e cella a flusso (b) per
applicazioni automatizzate
Attilio Citterio
Effetto dell’Indice di Rifrazione
(b) Raggio collimato
Campione
Rivelatore
(b) Raggio focalizzato
Luce non
rivelata
Variazioni nelle misure dell’indice di rifrazione del riferimento e
del campione possono causare misure sbagliate di assorbanza
Attilio Citterio
Geometria non Planare del Campione
Area fotosensibile
Rivelatore
Rivelatore
Campione “inclinato”
Campione planare
Alcuni campioni possono agire come componenti ottici attivi
nel sistema e deviare o defocalizzare il raggio luminoso
Attilio Citterio
Assorbanza [AU]
Assorbanza [AU]
Effetto del Tempo di Integrazione
0.0008
± 0.00013 AU
0.0006
0.0004
0.0002
0.1 sec
0.0000
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0.0000
± 0.00004 AU
S/N = 5.5
S/N = 18
16 sec
450
500
550
lunghezza d’onda [nm]
600
Mediare i dati raccolti riduce il rumore di fondo della radice
quadrata del numero dei punti mediati
Attilio Citterio
Effetto della Media sulle Lunghezze d’Onda
Assorbanza
Assorbanza
S/N
Segnale
Rumore
lunghezza d’onda
# dei punti
Intervallo
ottimale
NBW
• Mediare le lunghezze d’onda riduce anche il rumore
(della radice quadrata dei punti raccolti)
• L’ampiezza del segnale viene influenzata
Attilio Citterio
Aumento dell’Intervallo Dinamico
Assorbanza
Misurata [AU]
3.0
2.5
2.0
0.1428 mg/ml
spironolattone
1.5
Assorbanza [AU]
1.5
241 nm
1.0
1.0
266 nm
0.5
0.5
200
250
300
lunghezza d’onda
0.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Concentrazione mg/ml
La scelta di una lunghezza d’onda nella pendenza di una banda di
assorbimento può aumentare l’intervallo dinamico ed evitare la
preparazione del campione come la diluizione
Attilio Citterio
Diffusione
Rivelatore
Campione trasparente
Rivelatore
Campione che diffonde
La dispersione causa un assorbanza apparente in quanto
meno luce raggiunge il rivelatore
Attilio Citterio
Spettri Diffusi
1.0
Assorbanza [AU]
08
Diffusione di Tyndal
Diffusione di Rayleigh
0.6
0.4
0.2
0.0
200
• Diffusione di Rayleigh :
• Diffusione di Tyndall :
300
400
500
600
lunghezza d’onda [nm]
700
800
Particelle piccole rispetto alla lunghezza d’onda
Particelle grandi rispetto alla lunghezza d’onda
Attilio Citterio
Correzioni per Isoassorbanza
1.0
1
Spettro analita
Spettro interferente
Spettro misurato
Assorbanza [AU]
0.8
0.6
A1 A1
A1 =A1 – A2
0.4
0.2
0.0
200
1
A2
250
300
350
400
450
500
lunghezza d’onda [nm]
L’assorbanza alla lunghezza d’onda di riferimento deve essere
equivalente all’interferenza alla lunghezza d’onda analitica
Attilio Citterio
Modellizzazione del Fondo
1.0
Spettro
misurato
Assorbanza [AU]
1
0.8
Spettro diffuso
estrapoato
0.6
AC A1
0.4
AC = A1 – A5
Intervallo del modello
0.2
A5
0.0
200
250
300
350
400
lunghezza d’onda [nm]
450
500
Si può eseguire la modellizzazione del fondo se l’interferenza
è dovuta ad un processo fisico
Attilio Citterio
Riferimenti Interni
0.20
Spettro a
Spettro b
1
Assorbanza [AU]
0.15
0.10
A1a ≠ A1b
A2a ≠ A2b
0.05
2
0.00
220 230
240 250 260 270 280 290 300 310
lunghezza d’onda [nm]
320
Corregge per la costante absorbanza del fondo su un
intervallo
Attilio Citterio
Correzione a Tre Punti
Assorbanza [AU]
1.0
1
Spettro
misurato
AC A1
AC = A1 – A5
0.8
0.6
0.4
2
0.2
3
A2
0.0
200
250
A1
300
350
A3
400
450
500
lunghezza d’onda [nm]
• Uses two reference wavelengths
• Corrects for sloped linear background absorbance
Attilio Citterio
Discriminazione delle Bande Larghe
1.0
Assorbanza
0.5
0.0
0.005
Derivata prima
0.000
-0.005
0.005
Derivata seconda
0.000
-0.005
-0.010
400
500
lunghezza d’onda [nm]
600
• Le derivate possono eliminare l’assorbimento di fondo
• Le derivate discriminano rispetto alle ampie bande di
absorbanza
Attilio Citterio
Correzione della Diffusione per
Spettroscopia Derivata
Assorbanza [AU]
1.0
Spettro misurato
Spettro reale
0.5
0.0
Derivata prima
0.01
0.00
-0.01
300
400
500
600
700
lunghezza d’onda [nm]
La diffusione è discriminata come una banda ampia
di assorbanza
Attilio Citterio
Effetto della Fluorescenza
2.5
Lunghezza d’onda
di eccitazione
Assorbanza [AU]
2.0
1.5
Spettro di assorbanza vera
Spettro misurato
con ottica diretta
Spettro misurato
con ottica inversa
1.0
0.5
0.0
200
Lunghezza d’onda
di emissione
250
500
350
400
450
500
Lunghezza d’onda [nm]
550
600
La luce emessa da un campione fluorescente causa un errore
nella misura dell’assorbanza
Attilio Citterio
Angoli di Accettazione e Grandezza
dell’Errore di Fluorescenza
Ottica diretta
Rivelatore
Ottica inversa
Fenditura Rivelatore
• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse
• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse
Attilio Citterio
1.75
1.75
1.50
1.50
Assorbanza del
1.25 campione misurata
1.00
1.25
misurata
1.00 Assorbanza
dello standard
0.75
0.75
0.50
0.50
Concentrazione nota
dello standard
0.25
0.00
Curve di calibrazione
possibilmente vere
Assorbanza [AU]
Assorbanza [AU]
Calibrazione Inadeguata
0
5
10
Concentrazione
15
Possibile risultato di
quantificazione
0.25
0.00
0
5
10
Concentrazione
15
• Teoricamente si richiede solo uno standard per calibrare
• In pratica, deviazioni dalla legge di Beer possono causare risultare
sbagliati
Attilio Citterio
1.50
Assorbanza [AU]
Assorbanza [AU]
Insieme di Dati di Calibrazione
1.00
0.50
0.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0
5
10
Concentrazione
15
0
5
10
Concentrazione
15
• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse
• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse
Attilio Citterio
Coefficiente di concentrazione Assorbanza [AU]
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore
Linearità
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
0.998
Intervallo
ottimale
0.996
0.994
0.992
0.990
200
300
400
Lunghezza d’onda [nm]
500
• Una curva lineare di calibrazione è calcolata ad ogni lunghezza
d’onda
• Il coefficiente di correlazione da una stima della linearità
Attilio Citterio
Assorbanza [AU]
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore
Accuratezza
0.8
0.6
0.4
0.2
Concentrazione
0.0
11.0
Concentrazione misurata
Concentrazione vera
10.0
Intervallo
ottimale
9.0
8.0
7.0
200
300
Lunghezza d’onda [nm]
400
500
• I risultati di quantificazione sono are calcolati ad ogni lunghezza d’onda
• Le concentrazioni calcolate danno una stima dell’accuratezza
Attilio Citterio
Precisione di una Analisi
Valore [mg/ml]
31.44
31.42
31.40
31.38
31.36
Media = 1.41 mg/ml
Deviazione standard = 0.022 mg/ml
2
4
6
Numero di misure
8
10
La precisione di un metodo è il grado di accordo tra I singoli
risultati delle prove quando si applica ripetutamente la
procedura a campionamenti multipli
Attilio Citterio
Assorbanza [AU]
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore
Sensibilità
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
1.0
% RSD
0.8
Intervallo
ottimale
0.6
0.4
0.2
0.0
200
300
400
Lunghezza d’onda [nm]
500
• Il calcolo della deviazione standard relativa dei valori misurati ad ogni
lunghezza d’onda
• La lunghezza d’onda con la RSD % inferiore possibilmente fornirà la
migliore sensibilità
Attilio Citterio
Concentrazione [mg/ml]
Assorbanza [AU]
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore
Selettività
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
20
Concentrazione misurata
Concentrazione vera
15
10
5
200
Intervallo
ottimale
400
300
Lunghezza d’onda [nm]
500
La selettività è l’abilità di un metodo a quantificare accuratamente e
specificamente l’analita o analiti in presenza di altri composti
Attilio Citterio
Assorbanza Ideale e Standard di Lunghezza
d’Onda
Assorbanza [AU]
0.8
0.06
Standard di assorbanza
Standard di
lunghezza
d’onda
0.4
0.2
0.0
200
250
200
350
400
450
500
550
600
700
800
Lunghezza d’onda [nm]
• Uno standard ideale di assorbanza dovrebbe avere una
assorbanza costante a tutte le lunghezze d’onda
• Uno standard ideale di lunghezza d’onda dovrebbe avere picchi
molto stretti e ben-definiti
Attilio Citterio
Filtro Ideale per Luce Diffusa
Trasmittanza [AU]
100
80
60
40
20
0
200
250
300
400
350
450
Lunghezza d’onda [nm]
500
600
700
Un filtro ideale di luce diffusa dovrebbe trasmettere tutte le
lunghezze d’onda eccetto quelle usate per misurare la luce diffusa
Attilio Citterio
Soluzione di Perclorato di Olmio
Assorbanza [AU]
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
300
400
500
Lunghezza d’onda [nm]
600
Il più comune standard per l’accuratezza della
lunghezza d’onda è il perclorato di olmio
Attilio Citterio
800
Soluzione di Dicromato di Potassio
Assorbanza [AU]
2.0
1.5
235 nm
257 nm
313 nm
350 nm
1.0
0.5
0.0
200
250
300
450
350
500
400
Lunghezza d’onda [nm]
550
600
Lo standard di accuratezza fotometrica richiesto da molte
farmacopee è una soluzione di bicromato di potassio
Attilio Citterio
Soluzioni Standard per Luce Diffusa
100 KCl
200 nm
Trasmittanza [AU]
80
NaNO2
340 nm
NaI
220 nm
60
40
20
0
200
250
300
350
450
400
500
Lunghezza d’onda [nm]
600
I più comuni standard per luce diffusa e le rispettive
lunghezze d’onda usate
Attilio Citterio
700
Toluene in Esano (0.02% v/v)
Picco – 0.442 AU
Assorbanza [AU]
0.5
0.4
Rapporto – 1.61
0.3
0.2
Valle – 0. 275 AU
0.1
258
260
262
264
266
268
270
Lunghezza d’onda [nm]
272
274
276
La risoluzione è stimata prendendo il rapporto dell’assorbanza
del massimo vicino a 269 nm e il minimo vicino a 266 nm.
Attilio Citterio
Analisi di Conferma
Caffeina
1.0
Assorbanza [AU]
0.8
264 nm 274 nm 284 nm
0.6
Acido salicilico
0.4
0.2
0.0
250
260
270
280
290
300
Lunghezza d’onda [nm]
310
320
Nell’analisi di conferma, si usa l’assorbanza ad una o più
ulteriori lunghezze d’onda per quantificare un campione
Attilio Citterio
Similarità Spettrale
Correlazione = 0.999
0.8
0.6
Standard
0.4
0.2
0.0
Incognito
Standard [AU]
Normalizzato
1.0
0.2
0.1
0.0
300
250
0.3
Lunghezza d’onda [nm]
Incognito
0.8
Standard
0.6
0.4
0.2
0.0
250
300
350
Lunghezza d’onda [nm]
400
1.0
1.5
0.5
Incognito [mAU]
Correlazione = 0.056
0.3
Standard [AU]
Normalizzato
1.0
0.0
0.2
0.1
0.0
0.0
0.2
0.1
Incognito [mAU]
Grafici comparativi di spettri simili e dissimili
Attilio Citterio
0.3
Precisione e Accuratezza
–
Accuratezza –
Precisione
+
Accuratezza –
Precisione
Attilio Citterio
–
Accuratezza +
Precisione
+
Accuratezza +
Precisione
Assorbanza [AU]
Uso dell’UV
Cinetica dell’Idrolisi del Sultone
Lunghezza d’onda [nm]
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
La geometria più semplice si trova negli strumenti a singolo raggio. Per
effettuare la misura, si introduce prima il bianco e se ne misura la Io .
Quindi si introduce il campione (utilizzando la stessa cuvetta) e se ne
misura la I, e lo strumento ne calcola a scelta la trasmittanza o
l’assorbanza.
Rivelatore
Fenditura
d’uscita
Dipsositivo di
dispersione
Campione
Fenditura
d’ingresso
Monocromatore
Sorgente
Attilio Citterio
Gli strumenti a raggio
singolo sono poco
costosi, hanno alta
resa luminosa, e perciò
alta sensibilità, a causa
della semplicità del
sistema. Lo svantaggio
sta nel tempo che deve
intercorrere tra le due
misure e nell’aumento
dei problemi di deriva.
Rivelazione Spettrofotometrica
a “diode array”
Un rivelatore spettrofotometrico a “diode-array” usa una batteria di
rivelatori e una configurazione ottica “inversa”, con il dispositivo di
dispersione collocato dopo il campione. Si ha il vantaggio che solo la luce
passante sull’asse dalla sorgente alla fenditura prima del dispositivo di
dispersione raggiunge il rivelatore; la luce avente altri angoli viene
scartata. Così la luce ambiente non interferisce e si può lasciare aperta la
zona del campione, rendendo il sistema più facile da utilizzare e versatile.
batteria di diodi
Dispositivo di
dispersione
Fessura
d’ingresso
Campione
Policromatore
Sorgente
Attilio Citterio
La luce di tutte le lunghezze d’onda
colpiscono il “diode-array” e sono
misurate simultaneamente. Lo
spettro si recupera per scansione
elettronica della batteria. In
principio, gli spettrofotometri a
“diode-array” possono avere una
geometria a raggio singolo o
doppio ma, in pratica, i vantaggi dei
primi si combina bene con il
rivelatore a “diode-array”.