Assorbanza
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Corso di Chimica Generale - CHI 083424 - CCS Ingegneria Chimica A.A. 2015/2016 (I° Semestre) SPETTROSCOPIA UV-VISIBILE Prof. Attilio Citterio Dipartimento di CMIC “Giulio Natta” https://corsi.chem.polimi.it/citterio/ Spettroscopia • A insieme di strumenti per misurare le proprietà molecolari. • La spettroscopia è l’assorbimento o l’emissione di luce. • L’analisi spettrochimica può esser definita come l’uso dello spettro della radiazione elettromagnetica in analisi qualitative e quantitative. • Quando una molecola assorbe luce, la sua energia aumenta Attilio Citterio • Quando una molecola emette luce, la sua energia diminuisce Fotoni o Quanti di Luce • Atomi e molecole assorbono solo alcune frequenza, ma non altre. 0 260 • 240 Ci sono due ragioni per questa osservazione. L’energia assorbita o emessa è proporzionale alla frequenza, . Energia di un fotone = h Costante di Plank e– Attilio Citterio Effetto Fotoelettrico (emissione di elettroni da un metallo solido irraggiato) Elettrodo metallico illuminato Batteria - eLuce incidente da sorgente + + e- Generatore a voltaggio variabile - + + Elettrodo di raccolta - Amperometro Misura dell’energia cinetica degli elettroni emessi (fotoelettroni) = Voltaggio per cui la corrente è zero Attilio Citterio Energia dei Fotoelettroni Emessi da Metalli Ecin./ kJ mol-1 Infrarosso Visibile Ultravioletto 400 Cs 300 K Mg Zn Ni Pt 200 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 o del Cesio x 1014 (Hz) Pendenza = h (costante di Plank) Ecin. = Efot.- Eemis.= h - Attilio Citterio = h Ecin. = h (- ) Peculiarità dell’Effetto Fotoelettrico L’emissione fotoelettrica dimostra che l’energia dell’elettrone: Aumenta se si aumenta Non è influenzata aumentando l’intensità L’intensità influenza il numero di elettroni emessi per secondo Attilio Citterio Quantizzazione dell’Energia Molecolare Le energie molecolari sono quantizzate energia energia Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse Attilio Citterio Quantizzazione dell’Energia Molecolare Le energie molecolari sono quantizzate energia energia Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse Attilio Citterio Altre Evidenze della Quantizzazione • Assorbimento del corpo nero (Panck) • Capacità termica dei solidi a bassa temperatura quindi E = h Attilio Citterio Spettrometri • sorgente • monocromatore (selettore di frequenza) • campione • rivelatore Attilio Citterio Strumenti a Dispersione Usati negli spettrometri visibile/ultravioletto e nei vecchi tipi di strumenti infrarosso Attilio Citterio Strumenti a Trasformata di Fourier Richiedono estesi calcoli per convertire il segnale in uno spettro. Usati nei moderni strumenti. Attilio Citterio Lo Spettro Elettromagnetico 10-14 10-12 10-10 10-8 106 103 1 10-3 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 Lunghezza d’onda [m] =c/ E = h Attilio Citterio Infrasuoni Suoni (udibili) Ultrasuoni Radio NMR Infrarosso Televisione Ultravioletto Visibile Visibile Raggi X Raggi Gamma Raggi Cosmici Ultravioletto Frequenza [Hz] 1010 1015 1014 Radar 1017 Microonde 1019 Infrarosso 1022 108 1010 Transizioni Elettroniche nella Formaldeide transizione * transizione (187 nm) n * (285 nm) Attilio Citterio Transizioni Elettroniche e Spettri di Atomi E S2 S1 E I S0 S2 S0 S1 S0 S0S2 S0S1 Attilio Citterio Transizioni Elettroniche e Spettri UV-visibile in Molecole livelli elettronici livelli vibrazionali livelli rotazionali E S2 massimi di assorbimento (max.) I S1 Ampiezza della banda a metà altezza Su = transizioni elettroniche Attilio Citterio Spettri Derivati di una Banda di Assorbanza Gaussiana Assorbanza Assorbanza Assorbanza: A f ( ) 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 2° derivata 1° derivata 2.0E-04 0.01 1a Derivata: dA f ' ( ) d 0.0E+00 -2.0E-04 0.00 -4.0E-04 -0.01 -6.0E-04 2 2a Derivata: d A '' f ( ) 2 d 3° derivata 4° derivata 2.0E-05 1.0E-06 1.0E-05 5.0E-07 0.0E+00 0.0E+00 -1.0E-05 -5.0E-07 -2.0E-05 300 Attilio Citterio 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Aumento Risoluzione Assorbanza • Sovrapposizione di 2 bande Gaussiane con un NBW di 40 nm separate da 30 nm 1.5 1.0 0.5 0.0 400 500 600 500 600 4° derivata 5.0E-06 • Separate alla 4a derivata 0.0E+00 -5.0E-06 400 Attilio Citterio Trasmissione e Colore L’occhio umano vede il colore complementare di quello che è assorbito Attilio Citterio Assorbanza e Colori Complementari 800 700 600 500 400 Lunghezza d’onda [nm] Colore assorbito Colore complementare 650-780 rosso blu verde 595-650 arancio verde blu 560-595 giallo verde 500-560 verde 490-500 blu verde rosso 480-490 verde blu arancio 435-480 blu 380-435 violetto Attilio Citterio porpora rosso-porpora giallo giallo-verde Trasmittanza Trasmissione e Concentrazione La Legge di Lambert-Bouguer 100% 50% 25% 12,5% 6,75% Io I1 I2 I3 I4 3,125% I5 100% 50% 25% Lunghezza Percorso T I / I 0 e Cammino Cost. Attilio Citterio Trasmittanza e Cammino Ottico La Legge di Beer 100% I0 C 50% I1 100% Trasmissione 100% 2C 25% I2 100% 3C 12.5% I3 100% 4C 6.75% I4 50% 100% 5C 3.125% I5 25% Concentrazione T I / I 0 e Concentrazione Cost. Attilio Citterio La Legge di Lambert-Bouguer-Beer Assorbanza 1.5 1.0 0.5 0.0 Concentrazione A log T log I / I 0 log I 0 / I b c Attilio Citterio Miscela Bicomponente 1.5 y x x+y Assorbanza 1.0 0.5 0.0 200 210 220 Lunghezza d’onda 230 240 Esempio di miscela bi-componente con scarsa sovrapposizione spettrale Attilio Citterio Miscela Bi-componente 1.5 y x x+y Assorbanza 1.0 0.5 0.0 200 210 220 Lunghezza d’onda 230 240 Esempio di miscela bi-componente con significativa sovrapposizione spettrale Attilio Citterio Influenza di un Errore Casuale del 10% 1.5 Assorbanza Vero Misurato 1.0 0.5 0.0 200 210 230 220 Lunghezza d’onda 240 Influenza sulle concentrazioni calcolate • Scarsa sovrapposizione spettrale: Errore 10% • Significativa sovrapposizione spettrale: Dipende dalla similarità, può essere molto più alto (p.es. 100%) Attilio Citterio Spettri di Assorbimento di Derivati dell’Emoglobina Sulfemoglobina Ossiemoglobina Carbossiemoglobina Emoglobina (pH 7.0-7.4) Deossiemoglobina Assorbanza [AU] 0.2 0.1 0.0 500 550 600 Lunghezza d’onda [nm] Attilio Citterio 650 • Buona intensità nell’intervallo UV • Utile intensità nell’intervallo del visibile • Basso rumore di fondo • Intensità calante nel tempo Irradiazione Spettrale Intensità dello Spettro della Lampada ad Arco di Deuterio 1 0.1 0.01 0.00 200 300 400 500 600 Lunghezza d’onda [nm] Attilio Citterio 700 • Bassa intensità nell’intervallo UV • Buona intensità nell’intervallo visibile • Rumore di fondo molto basso Irraggiamento Spettrale Intensità dello Spettro della Lampada a Tungsteno-Alogena • Basso drift 10 1 0.1 0.01 200 400 600 800 Lunghezza d’onda [nm] Attilio Citterio 1000 • Alta intensità nell’intervallo UV • Alta intensità nell’intervallo visibile • Rumore di fondo medio Irraggiamento Spettrale Intensità dello Spettro della Lampada a Xeno 100 10 1 0.1 0.01 200 400 600 800 Lunghezza d’onda [nm] Attilio Citterio 1000 Dispositivi di Dispersione Prisma • Dispersione non-lineare • Sensibile alla temperatura Reticolo • Dispersione lineare • Differenti ordini Primo ordine Attilio Citterio Secondo ordine Dispositivo Fotomoltiplicatore • Alta sensibilità a bassi livelli di luce • Il materiale catodico determina sensibilità spettrale • Buon segnale/rumore di fondo Catodo • Sensibile agli urti Attilio Citterio Anodo Il Rivelatore a Fotodiodi Fotone Contatto metallico • Ampio intervallo dinamico • Rapporto segnale/rumore molto buono ad alti livelli di luce • Dispositivo a stato solido SiO2 strato p Regione intrinseca strato n Attilio Citterio Blocco d’oro Diagramma Schematico di un Dispositivo a Fotodiodi Luce • Stesse caratteristiche dei fotodiodi • Dispositivo a stato solido • Veloci cicli di lettura Fotodiodo Capacitore Registro deviazione Deviatore transistor Linea video Ciclo di lettura Attilio Citterio Spettrometro Convenzionale Rivelatore Monocromatore Campione Fessura d’uscita Dispositivo di dispersione Sorgente Fessura d’ingresso Attilio Citterio Spettrometro a “Diode Array” Batteria di diodi Policromatore Campione Sorgente Dispositivo di dispersione Fessura d’ingresso Attilio Citterio Spettrometro a “Diode Array” Shutter Lente Campione Lente Lampada a Tunsteno Lampada a deuterio Fessura Reticolo Diode array a 1024-elementi Sistema ottico di uno spettrofotometro HP 8453 a “diode array” Attilio Citterio Spettrometro Convenzionale Monocromatore Fessura d’uscita Dispositivo di dispersione Fessura Sorgente d’ingresso Riferimento Chopper Rivelatore Campione Sistema ottico di uno spettrofotometro a doppio raggio Attilio Citterio Spettrometro a “Diode Array” Lampada visibile Cella del riferimento Lampada UV Specchi a lati di cubo Elisse sorgente Specchio sorgente Elisse spettrografica Specchio orientante il raggio inferiore UV Cella del campione Visibile Reticolo olografico Uscita Spettrografo e batteria rivelatore Specchi a lati di cubo Specchio orientante il raggio inferiore Sistema ottico dello spettrofotometro a diode array HP 8450A Attilio Citterio Spettrometro Convenzionale Monocromatore Fessura d’uscita Dispositivo di dispersione Sorgente Fessura d’ingresso Riferimento Rivelatore Campione Rivelatore Deviatore del raggio Sistema ottico di uno spettrofotometro a raggio sdoppiato Attilio Citterio Definizione di Risoluzione Segnale in uscita dal rivelatore intensità Smax 0.8xSmax lunghezza d’onda lunghezza d’onda La risoluzione spettrale è una misura della capacità di uno strumento di differenziare tra due lunghezze d’onda adiacenti Attilio Citterio Ampiezza di Banda Spettrale intensità I 0.5 I SBW lunghezza d’onda La SBW è definita come l’ampiezza, a metà dell’intensità massima, della banda di luce uscente dal monocromatore Attilio Citterio Ampiezza di Banda Spettrale Naturale assorbanza A 0.5 A NBW lunghezza d’onda La NBW è l’ampiezza della banda di assorbimento del campione a metà del massimo di assorbimento Attilio Citterio Effetto della SBW sulla Forma della Banda assorbanza 1 nm 5 nm 10 nm 20 nm 50 nm lunghezza d’onda Il rapporto SBW/NBW deve essere 0.1 o migliore per dare una misura di assorbanza con un’accuratezza del 99.5% o migliore. Attilio Citterio Assorbanza Effetto del Campionamento Digitale Spettro originale Assorbanza Processo di campionamento Spettro digitalizzato lunghezza d’onda Anche l’intervallo di campionamento usato per digitalizzare lo spettro per la valutazione e lo stoccaggio da parte di un computer influenza la risoluzione Attilio Citterio Resettabilità della Lunghezza d’Onda 0.20 Errore = 0.0 AU Assorbanza [AU] 0.15 0.10 Errore = 0.1 AU (10%) 0.05 0.00 220 240 260 280 lunghezza d’onda [nm] 300 Influenza della resettabilità della lunghezza d’onda sulle misure al massimo e sulla pendenza della banda di un assorbimento Attilio Citterio Effetto della Luce Diffusa 4.0 0.00 % di Luce Diffusa 0.01 % di Luce Diffusa 0.10 % di Luce Diffusa 1.00 % di Luce Diffusa Assorbanza misurata 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.5 1.0 2.0 1.5 2.5 Assorbanza vera 3.0 3.5 4.0 Effetto di vari livelli di luce diffusa sulle assorbanze misurate confrontate con le assorbanze reali Attilio Citterio Errore di Assorbanza Teorico 15.0 Errore % 10.0 5.0 0.0 -5.0 -10.0 Curva dell’errore da luce diffusa Curva ’errore luce diffusa + noise Curva errore luce diffusa - noise -15.0 -20.0 -25.0 0.001 0.01 0.1 Assorbanza 1 4 L’errore totale a qualsiasi assorbanza è la somma degli errori dovuti alla luce diffusa e al rumore di fondo (rumore dei fotoni ed elettronico) Attilio Citterio Effetto del Drift 0.20 Errore Assorbanza [AU] 0.15 0.10 0.05 0.00 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 lunghezza d’onda [nm] 320 Il drift è una potenziale causa di errore fotometrico e deriva dalle variazioni tra le misure di I0 e I Attilio Citterio Caratteristiche di Trasmissione dei Materiali di Cella 100 Silice fusa Trasmittanza [%] 80 Quarzo fuso 60 40 Plastica acrilica 20 0 Vetro Vetro ottico 200 250 300 350 lunghezza d’onda [nm] 400 Notare che tutti i materiali mostrano approssimativamente almeno il 10% di perdita nella trasmittanza a tutte le lunghezze d’onda. Attilio Citterio Tipi di Celle 1 (a) (b) Cella Standard rettangolare aperta in testa (a) e cella con apertura (b) per volumi limitati di campione Attilio Citterio Tipi di Celle (II) (a) (b) Micro cella (a) per volumi molto piccoli e cella a flusso (b) per applicazioni automatizzate Attilio Citterio Effetto dell’Indice di Rifrazione (b) Raggio collimato Campione Rivelatore (b) Raggio focalizzato Luce non rivelata Variazioni nelle misure dell’indice di rifrazione del riferimento e del campione possono causare misure sbagliate di assorbanza Attilio Citterio Geometria non Planare del Campione Area fotosensibile Rivelatore Rivelatore Campione “inclinato” Campione planare Alcuni campioni possono agire come componenti ottici attivi nel sistema e deviare o defocalizzare il raggio luminoso Attilio Citterio Assorbanza [AU] Assorbanza [AU] Effetto del Tempo di Integrazione 0.0008 ± 0.00013 AU 0.0006 0.0004 0.0002 0.1 sec 0.0000 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 0.0000 ± 0.00004 AU S/N = 5.5 S/N = 18 16 sec 450 500 550 lunghezza d’onda [nm] 600 Mediare i dati raccolti riduce il rumore di fondo della radice quadrata del numero dei punti mediati Attilio Citterio Effetto della Media sulle Lunghezze d’Onda Assorbanza Assorbanza S/N Segnale Rumore lunghezza d’onda # dei punti Intervallo ottimale NBW • Mediare le lunghezze d’onda riduce anche il rumore (della radice quadrata dei punti raccolti) • L’ampiezza del segnale viene influenzata Attilio Citterio Aumento dell’Intervallo Dinamico Assorbanza Misurata [AU] 3.0 2.5 2.0 0.1428 mg/ml spironolattone 1.5 Assorbanza [AU] 1.5 241 nm 1.0 1.0 266 nm 0.5 0.5 200 250 300 lunghezza d’onda 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Concentrazione mg/ml La scelta di una lunghezza d’onda nella pendenza di una banda di assorbimento può aumentare l’intervallo dinamico ed evitare la preparazione del campione come la diluizione Attilio Citterio Diffusione Rivelatore Campione trasparente Rivelatore Campione che diffonde La dispersione causa un assorbanza apparente in quanto meno luce raggiunge il rivelatore Attilio Citterio Spettri Diffusi 1.0 Assorbanza [AU] 08 Diffusione di Tyndal Diffusione di Rayleigh 0.6 0.4 0.2 0.0 200 • Diffusione di Rayleigh : • Diffusione di Tyndall : 300 400 500 600 lunghezza d’onda [nm] 700 800 Particelle piccole rispetto alla lunghezza d’onda Particelle grandi rispetto alla lunghezza d’onda Attilio Citterio Correzioni per Isoassorbanza 1.0 1 Spettro analita Spettro interferente Spettro misurato Assorbanza [AU] 0.8 0.6 A1 A1 A1 =A1 – A2 0.4 0.2 0.0 200 1 A2 250 300 350 400 450 500 lunghezza d’onda [nm] L’assorbanza alla lunghezza d’onda di riferimento deve essere equivalente all’interferenza alla lunghezza d’onda analitica Attilio Citterio Modellizzazione del Fondo 1.0 Spettro misurato Assorbanza [AU] 1 0.8 Spettro diffuso estrapoato 0.6 AC A1 0.4 AC = A1 – A5 Intervallo del modello 0.2 A5 0.0 200 250 300 350 400 lunghezza d’onda [nm] 450 500 Si può eseguire la modellizzazione del fondo se l’interferenza è dovuta ad un processo fisico Attilio Citterio Riferimenti Interni 0.20 Spettro a Spettro b 1 Assorbanza [AU] 0.15 0.10 A1a ≠ A1b A2a ≠ A2b 0.05 2 0.00 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 lunghezza d’onda [nm] 320 Corregge per la costante absorbanza del fondo su un intervallo Attilio Citterio Correzione a Tre Punti Assorbanza [AU] 1.0 1 Spettro misurato AC A1 AC = A1 – A5 0.8 0.6 0.4 2 0.2 3 A2 0.0 200 250 A1 300 350 A3 400 450 500 lunghezza d’onda [nm] • Uses two reference wavelengths • Corrects for sloped linear background absorbance Attilio Citterio Discriminazione delle Bande Larghe 1.0 Assorbanza 0.5 0.0 0.005 Derivata prima 0.000 -0.005 0.005 Derivata seconda 0.000 -0.005 -0.010 400 500 lunghezza d’onda [nm] 600 • Le derivate possono eliminare l’assorbimento di fondo • Le derivate discriminano rispetto alle ampie bande di absorbanza Attilio Citterio Correzione della Diffusione per Spettroscopia Derivata Assorbanza [AU] 1.0 Spettro misurato Spettro reale 0.5 0.0 Derivata prima 0.01 0.00 -0.01 300 400 500 600 700 lunghezza d’onda [nm] La diffusione è discriminata come una banda ampia di assorbanza Attilio Citterio Effetto della Fluorescenza 2.5 Lunghezza d’onda di eccitazione Assorbanza [AU] 2.0 1.5 Spettro di assorbanza vera Spettro misurato con ottica diretta Spettro misurato con ottica inversa 1.0 0.5 0.0 200 Lunghezza d’onda di emissione 250 500 350 400 450 500 Lunghezza d’onda [nm] 550 600 La luce emessa da un campione fluorescente causa un errore nella misura dell’assorbanza Attilio Citterio Angoli di Accettazione e Grandezza dell’Errore di Fluorescenza Ottica diretta Rivelatore Ottica inversa Fenditura Rivelatore • Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse • Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse Attilio Citterio 1.75 1.75 1.50 1.50 Assorbanza del 1.25 campione misurata 1.00 1.25 misurata 1.00 Assorbanza dello standard 0.75 0.75 0.50 0.50 Concentrazione nota dello standard 0.25 0.00 Curve di calibrazione possibilmente vere Assorbanza [AU] Assorbanza [AU] Calibrazione Inadeguata 0 5 10 Concentrazione 15 Possibile risultato di quantificazione 0.25 0.00 0 5 10 Concentrazione 15 • Teoricamente si richiede solo uno standard per calibrare • In pratica, deviazioni dalla legge di Beer possono causare risultare sbagliati Attilio Citterio 1.50 Assorbanza [AU] Assorbanza [AU] Insieme di Dati di Calibrazione 1.00 0.50 0.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 5 10 Concentrazione 15 0 5 10 Concentrazione 15 • Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse • Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse Attilio Citterio Coefficiente di concentrazione Assorbanza [AU] Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Linearità 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 0.998 Intervallo ottimale 0.996 0.994 0.992 0.990 200 300 400 Lunghezza d’onda [nm] 500 • Una curva lineare di calibrazione è calcolata ad ogni lunghezza d’onda • Il coefficiente di correlazione da una stima della linearità Attilio Citterio Assorbanza [AU] Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Accuratezza 0.8 0.6 0.4 0.2 Concentrazione 0.0 11.0 Concentrazione misurata Concentrazione vera 10.0 Intervallo ottimale 9.0 8.0 7.0 200 300 Lunghezza d’onda [nm] 400 500 • I risultati di quantificazione sono are calcolati ad ogni lunghezza d’onda • Le concentrazioni calcolate danno una stima dell’accuratezza Attilio Citterio Precisione di una Analisi Valore [mg/ml] 31.44 31.42 31.40 31.38 31.36 Media = 1.41 mg/ml Deviazione standard = 0.022 mg/ml 2 4 6 Numero di misure 8 10 La precisione di un metodo è il grado di accordo tra I singoli risultati delle prove quando si applica ripetutamente la procedura a campionamenti multipli Attilio Citterio Assorbanza [AU] Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Sensibilità 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 1.0 % RSD 0.8 Intervallo ottimale 0.6 0.4 0.2 0.0 200 300 400 Lunghezza d’onda [nm] 500 • Il calcolo della deviazione standard relativa dei valori misurati ad ogni lunghezza d’onda • La lunghezza d’onda con la RSD % inferiore possibilmente fornirà la migliore sensibilità Attilio Citterio Concentrazione [mg/ml] Assorbanza [AU] Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Selettività 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 20 Concentrazione misurata Concentrazione vera 15 10 5 200 Intervallo ottimale 400 300 Lunghezza d’onda [nm] 500 La selettività è l’abilità di un metodo a quantificare accuratamente e specificamente l’analita o analiti in presenza di altri composti Attilio Citterio Assorbanza Ideale e Standard di Lunghezza d’Onda Assorbanza [AU] 0.8 0.06 Standard di assorbanza Standard di lunghezza d’onda 0.4 0.2 0.0 200 250 200 350 400 450 500 550 600 700 800 Lunghezza d’onda [nm] • Uno standard ideale di assorbanza dovrebbe avere una assorbanza costante a tutte le lunghezze d’onda • Uno standard ideale di lunghezza d’onda dovrebbe avere picchi molto stretti e ben-definiti Attilio Citterio Filtro Ideale per Luce Diffusa Trasmittanza [AU] 100 80 60 40 20 0 200 250 300 400 350 450 Lunghezza d’onda [nm] 500 600 700 Un filtro ideale di luce diffusa dovrebbe trasmettere tutte le lunghezze d’onda eccetto quelle usate per misurare la luce diffusa Attilio Citterio Soluzione di Perclorato di Olmio Assorbanza [AU] 0.8 0.6 0.4 0.2 0 200 300 400 500 Lunghezza d’onda [nm] 600 Il più comune standard per l’accuratezza della lunghezza d’onda è il perclorato di olmio Attilio Citterio 800 Soluzione di Dicromato di Potassio Assorbanza [AU] 2.0 1.5 235 nm 257 nm 313 nm 350 nm 1.0 0.5 0.0 200 250 300 450 350 500 400 Lunghezza d’onda [nm] 550 600 Lo standard di accuratezza fotometrica richiesto da molte farmacopee è una soluzione di bicromato di potassio Attilio Citterio Soluzioni Standard per Luce Diffusa 100 KCl 200 nm Trasmittanza [AU] 80 NaNO2 340 nm NaI 220 nm 60 40 20 0 200 250 300 350 450 400 500 Lunghezza d’onda [nm] 600 I più comuni standard per luce diffusa e le rispettive lunghezze d’onda usate Attilio Citterio 700 Toluene in Esano (0.02% v/v) Picco – 0.442 AU Assorbanza [AU] 0.5 0.4 Rapporto – 1.61 0.3 0.2 Valle – 0. 275 AU 0.1 258 260 262 264 266 268 270 Lunghezza d’onda [nm] 272 274 276 La risoluzione è stimata prendendo il rapporto dell’assorbanza del massimo vicino a 269 nm e il minimo vicino a 266 nm. Attilio Citterio Analisi di Conferma Caffeina 1.0 Assorbanza [AU] 0.8 264 nm 274 nm 284 nm 0.6 Acido salicilico 0.4 0.2 0.0 250 260 270 280 290 300 Lunghezza d’onda [nm] 310 320 Nell’analisi di conferma, si usa l’assorbanza ad una o più ulteriori lunghezze d’onda per quantificare un campione Attilio Citterio Similarità Spettrale Correlazione = 0.999 0.8 0.6 Standard 0.4 0.2 0.0 Incognito Standard [AU] Normalizzato 1.0 0.2 0.1 0.0 300 250 0.3 Lunghezza d’onda [nm] Incognito 0.8 Standard 0.6 0.4 0.2 0.0 250 300 350 Lunghezza d’onda [nm] 400 1.0 1.5 0.5 Incognito [mAU] Correlazione = 0.056 0.3 Standard [AU] Normalizzato 1.0 0.0 0.2 0.1 0.0 0.0 0.2 0.1 Incognito [mAU] Grafici comparativi di spettri simili e dissimili Attilio Citterio 0.3 Precisione e Accuratezza – Accuratezza – Precisione + Accuratezza – Precisione Attilio Citterio – Accuratezza + Precisione + Accuratezza + Precisione Assorbanza [AU] Uso dell’UV Cinetica dell’Idrolisi del Sultone Lunghezza d’onda [nm] Attilio Citterio Spettrometro Convenzionale La geometria più semplice si trova negli strumenti a singolo raggio. Per effettuare la misura, si introduce prima il bianco e se ne misura la Io . Quindi si introduce il campione (utilizzando la stessa cuvetta) e se ne misura la I, e lo strumento ne calcola a scelta la trasmittanza o l’assorbanza. Rivelatore Fenditura d’uscita Dipsositivo di dispersione Campione Fenditura d’ingresso Monocromatore Sorgente Attilio Citterio Gli strumenti a raggio singolo sono poco costosi, hanno alta resa luminosa, e perciò alta sensibilità, a causa della semplicità del sistema. Lo svantaggio sta nel tempo che deve intercorrere tra le due misure e nell’aumento dei problemi di deriva. Rivelazione Spettrofotometrica a “diode array” Un rivelatore spettrofotometrico a “diode-array” usa una batteria di rivelatori e una configurazione ottica “inversa”, con il dispositivo di dispersione collocato dopo il campione. Si ha il vantaggio che solo la luce passante sull’asse dalla sorgente alla fenditura prima del dispositivo di dispersione raggiunge il rivelatore; la luce avente altri angoli viene scartata. Così la luce ambiente non interferisce e si può lasciare aperta la zona del campione, rendendo il sistema più facile da utilizzare e versatile. batteria di diodi Dispositivo di dispersione Fessura d’ingresso Campione Policromatore Sorgente Attilio Citterio La luce di tutte le lunghezze d’onda colpiscono il “diode-array” e sono misurate simultaneamente. Lo spettro si recupera per scansione elettronica della batteria. In principio, gli spettrofotometri a “diode-array” possono avere una geometria a raggio singolo o doppio ma, in pratica, i vantaggi dei primi si combina bene con il rivelatore a “diode-array”.
