Vescicole extracellulari
come mediatori del
trasporto nel Sistema
Nervoso
di Blanka Cerreti, Giacomo Milletti
e Vittoria Peretti
Introduzione
In tutti gli organismi pluricellulari, le vescicole
cellulari non si occupano unicamente di
trasportare macromolecole all’interno della
cellula, ma possono attraversare la membrana
plasmatica e prendere parte alla comunicazione
intercellulare. Le vescicole extracellulari (EVs)
sono state recentemente associate a diversi ruoli
in ambito neurobiologico: sia fisiologico,
durante lo sviluppo del sistema nervoso e la
sinaptogenesi, sia patologico, partecipando alla
diffusione di molecole neuropatogeniche.
Ad oggi sono stati definiti numerosi sottogruppi
di EVs ma al momento non esiste una
classificazione ampiamente accettata che tenga
conto di metodi di isolamento standardizzati e
di marcatori specifici di ogni sottogruppo. In
generale, però, sono due i tipi che la comunità
scientifica considera distinti all’unanimità: le
microvescicole (MVs) e gli esosomi. Le
differenze principali tra le due sono la
dimensione e l’origine. Le prime hanno un
diametro compreso tra 100 nm e 1,0 µm e si
formano come estroflessione della membrana
plasmatica, di cui rispecchiano pertanto anche
la composizione lipidica; la formazione delle
seconde, invece, prevede l’inclusione di
vescicole intraluminali (ILV) all’interno di
corpi multivescicolari (MVBs) e possiedono un
diametro inferiore alle prime. Questi ultimi
possono seguire a loro volta due destini
differenti: possono fondersi con i lisosomi
affinché il loro contenuto venga degradato,
oppure unirsi alla membrana plasmatica
liberando cosi gli esosomi nell’ambiente
extracellulare.
Il pathway di biogenesi più studiato è quello
degli esosomi e inizia con la formazione di
vescicole endocitiche in regioni specializzate
della membrana. Una volta distaccatesi dal
plasmalemma, si fondono con l’endosoma
precoce, che in seguito maturerà in endosoma
tardivo (Stoorvogel et al. 1991) accumulando
ILVs all’interno del proprio lume. Il
meccanismo proposto per spiegare
l’invaginazione e l’ingresso delle ILVs
all’interno dei MVBs è guidato dal complesso
ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required
for Transport), composto da circa trenta
proteine che si assemblano in quattro complessi
(ESCRT -0, -I, -II, -III). ESCRT-0 è composto
da HRS (Hepatocyte growth factor–Regulated
tyrosine kinase Substrate) che riconosce
proteine trans-membrana monoubiquitinate e
associa con STAM (Signal Transducing
Adaptor Molecule). HRS recluta TSG101 del
complesso ESCRT-I coinvolto a sua volta nel
reclutamento di ESCRT-III tramite ESCRT-II o
ALIX. ESCRT-I e -II sono responsabili della
deformazione della membrana in gemme,
mentre ESCRT-III si occupa della conseguente
scissione (Hanson & Cashikar 2012) .
Alcune evidenze suggeriscono, però, che la via
ESCRT-dipendente non sia l’unica a causare la
formazione di MVBs (fig. 1). Inizialmente
dimostrata in linee cellulari oligodendrocitarie
(Trajkovic et al.,2008), un’altra via può
determinare la formazione di esosomi in
maniera ESCRT-indipendente e prevede
l’intervento di due enzimi del metabolismo
lipidico: la sfingomielinasi neutra (nSMase) che
idrolizza la sfingomielina in ceramide e la
Figura 1: Vari pathways metabolici conducono alla
formazione di esosomi.
fosfolipasi D2 che garantisce l’idrolisi della
fosfatidilcolina in acido fosfatidico (Ghossoub
et al. 2014). In questo processo sembrano
prendere parte anche alcune proteine
appartenenti alla famiglia delle tetraspanine
(Van Niel et al. 2011) come CD63, CD9 e CD81
che si occupano, in particolare, sia della fusione
con la membrana plasmatica, sia del sorting di
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Figura 2: Tutte le principali popolazioni cellulari del SN inviano e ricevono vescicole extracellulari (KrämerAlbers e Hill 2016).
proteine esosomiali verso le ILVs (PerezHernandez et al. 2013). La famiglia delle
proteine Rab, in particolare le GTPasi Rab7,
Rab11, Rab35 e Rab27, è coinvolta nella
secrezione delle vescicole (Stenmark 2009).
Gli esosomi possiedono differenti
macromolecole al loro interno o esposte sulla
membrana; il contenuto proteico e lipidico non
è casuale ma rispecchia quello della cellula di
origine. La particolarità risiede nel contenuto in
acidi nucleici: l’elevato contenuto di miRNA,
oltre a mRNA, infatti, rappresenta un
interessante sistema di regolazione orizzontale
intercellulare dell’espressione genica a livello
post-trascrizionale (Kosaka et al. 2010).
EVs nel Sistema Nervoso
La presenza di EVs nel Sistema Nervoso è stata
ampiamente caratterizzata sia in vitro che in
vivo, è stata largamente descritta in tutte le
maggiori popolazioni neuronali e gliali ed è
stata evidenziata anche nel liquido
cefalorachidiano (CSF) (fig. 2). Il rilascio di
EVs dai neuroni e dalle cellule gliali è collegato
all’attività elettrica e al signalling dei
neurotrasmettitori.
Nei neuroni le MVBs sono frequenti nelle aree
somato-dendritiche e prendono parte a processi
di plasticità locali. In seguito ad attività
sinaptica glutammatergica, infatti, gli esosomi
rilasciati inducono la deplezione della subunità
GluR 2/3 del recettore AMPA (Chivet et al.,
2014).
Esosomi isolati da neuroni corticali dopo
stimolazione glutammatergica, inoltre, legano
preferenzialmente siti presinaptici dove
vengono in seguito internalizzati, suggerendo
un ruolo delle EVs nel signalling transsinaptico.
Il trasporto da parte di esosomi neurali del
miR-124a agli astrociti incrementa i livelli del
trasportatore del glutammato EAAT2/GLT1
negli astrociti, fondamentale per l’uptake
dell’amminoacido (Morel et al., 2013).
Il rilascio di EVs, sotto lo stimolo di
neurotrasmettitori, è stato riscontrato anche
nelle cellule gliali.
La microglia e gli astrociti, stimolati con ATP
attraverso i recettori P 2 X 7 , gemmano
3! di ! 9
microvescicole dalla membrana plasmatica in
m a n i e r a E S C RT- i n d i p e n d e n t e ; q u e s t e
interagiscono con i neuroni aumentandone lo
stato eccitatorio: sia stimolando direttamente la
trasmissione glutammatergica, sia riducendo la
trasmissione inibitoria GABAergica (Gabrielli
et al., 2015). Inoltre la microglia secerne
esosomi in risposta alla stimolazione
serotoninergica dei recettori 5-HT2R and 5HT4R mediata dal Ca2+ e dal cAMP (Glebov et
al., 2015)
Gli oligodendrociti accumulano MVBs
nell’area periassonale e rilasciano esosomi in
risposta all’attività elettrica neuronale e al
signalling del glutammato. Gli esosomi
vengono internalizzati dai neuroni via
dinamina-dipendente e clatrina-dipendente.
Recenti studi hanno condotto all’ipotesi, ancora
da verificare, che tali vescicole potrebbero
rappresentare un meccanismo di supporto gliale
importante per l’omeostasi e l’integrità a lungo
termine [citato in Krämer-Albers e Hill, 2016].
Infine, recentemente è stato dimostrato che le
cellule di Schwann nel SNP rilasciano esosomi
che svolgono un ruolo importante nella
rigenerazione in seguito a danno al tessuto
nervoso (Lopez-Verrilli et al., 2013).
Dialogo tra cervello e periferia
La comunicazione intercellulare è necessaria
per la plasticità sinaptica, il supporto trofico, e
più in generale per il funzionamento del SN.
Oltre ai più noti meccanismi di comunicazione
sinaptica, in assenza di segnale elettrico, la
comunicazione cellulare può avvenire grazie
alla secrezione di vescicole extracellulari, sia
localmente, in maniera autocrina e paracrina,
sia su lunghe distanze attraverso trasporto
endocrino [citato in Candelario & Steindler,
2014].
È ormai comunemente accettato il fatto che vi
sia una forma di comunicazione tra cervello e
periferia mediata da EVs, nonostante i
meccanismi alla base non siano ancora stati
chiariti.
È stato ipotizzato che l’aumento della
permeabilità di membrana da parte delle EVs
permetta l’attraversamento della barriera ematoencefalica e così da mediare gli scambi di
informazioni tra SNC e tessuti periferici.
(Grapp et al., 2013).
Uno studio recente mostra come le EVs
prodotte dalle cellule ematopoietiche della
periferia possano entrare nei neuroni del
Purkinje del cervelletto e conseguentemente
modificare i profili d’espressione dei miRNA
delle cellule target. Questa segnalazione
aumenta significativamente in condizioni di
infiammazione periferica, evento in cui la
stimolazione viene estesa anche ad altre
popolazioni neuronali, come i neuroni corticali
e ippocampali, mentre la microglia sembra non
esserne coinvolta. (Ridder et al., 2014).
Per avvalorare l’ipotesi del dialogo tra periferia
e cervello, Hoshino e colleghi hanno dimostrato
che gli esosomi derivati da cellule cancerose del
seno, a causa del loro specifico profilo
d’espressione delle integrine, invadono
preferenzialmente il cervello, dove promuovono
la formazione di nicchie pre-metastatiche [citato
in Krämer-Albers e Hill, 2016].
Nella direzione contraria si pensa che le EVs
veicolanti specifiche informazioni del SNC
possano muoversi dal cervello verso il circolo
sanguigno e pertanto vengono considerate un
mezzo promettente per l’identificazione di
biomarkers associati a neuropatologie (SaenzCuesta et al., 2014).
Ruolo delle EVs nelle patologie
neurodegenerative
Quando uno stato di stress sfocia in una
patologia le cellule interessate rilasciano EVs
contenenti proteine, mRNA, miRNA e altri
RNA non codificanti i quali giocano un ruolo
diretto nella progressione e nella diffusione
della malattia. Le EVs, infatti, garantiscono
protezione dall’azione degradativa di proteasi e
4! di ! 9
RNAsi presenti nell’ambiente extracellulare,
permettendo così il trasferimento intercellulare
di tali molecole da cellule affette a cellule sane
(Funk et al., 2012).
L’origine delle EVs dai corpi multivescicolari
suggerisce che esse siano coinvolte nella
clearance di tossine e proteine mal ripiegate
attraverso il pathway di deposito lisosomiale.
Le patologie neurodegenerative, tra cui
Parkinson, Huntington, Alzheimer e Sclerosi
Laterale Amiotrofica, vengono chiamate anche
“proteino-patie” proprio perché caratterizzate
Figura 3: Esosomi umani veicolanti forme di proteine mutate.
(Rajendran et al., 2006).
- A-D: ippocampo di un cervello sano senza placche amiloidi e Alix
(marker esosomiale).
- B-E: ippocampo di un paziente PD con accumuli di neurofilamenti
H-Tau ma senza placche e Alix.
- C-F: ippocampi di pazienti con AD avanzato contenenti placche
amiloidi e neurofibrille H-Tau.
dall’accumulo di aggregati proteici tossici
(Zhang et al., 2009).
Molte di queste proteine sono state individuate
all’interno di EVs (fig. 3); ne sono un esempio
studi svolti da Fevrier e colleghi (2004) sul
ruolo degli esosomi nella trasmissione di prioni
infettivi derivati dal mal ripiegamento di
proteine prioniche. Allo stesso modo anche aβ,
tau, SOD-1, TDP-43, α-sinucleina e huntingtina
sono secrete attraverso EVs.
Nell’AD gli esosomi, oltre a fungere da
trasportatori del peptide aβ, sono stati
rintracciati anche all’interno di placche amiloidi
(Rajendran et al., 2006).
In uno studio del 2012, Yuamama e colleghi
hanno osservato che l’aggiunta di forme di aβ
solubili in presenza di EVs derivate da neuroni,
induceva la loro localizzazione nei lisosomi: in
tal modo venivano prevenute sia la formazione
di placche amiloidi sia la morte neuronale.
La proteina Tau, anch’essa correlata ad AD,
viene rilasciata in EVs e la forma iperfosforilata
(H-Tau) può essere rintracciata nel CSF
suggerendone un potenziale ruolo diagnostico
(Saman et al., 2012).
La proteina α-sinucleina è la maggiore
componente degli aggregati proteici chiamati
“Corpi di Lewy” che caratterizzano l’eziologia
di PD. Anch’essa è stata isolata nelle EVs
presenti in CSF e plasma sottolineando anche in
questo caso un probabile ruolo nella patogenesi
e come potenziale biomarker. A confermare
l’ipotesi, disfunzioni lisosomiali e dell’attività
autofagica in cellule che over-esprimono l’αsinucleina risultano in un incremento del
rilascio di quest’ultima dalle EVs. (AlzarezErviti et al., 2011).
Infine anche la SLA risulta essere caratterizzata
da ripiegamenti aberranti di svariate proteine
tra cui la superossido dismutasi 1 (SOD1) e la
TAR DNA-binding protein di 43 kDA
(TDP-43), entrambe componenti delle EVs. È
stato osservato che queste forme mal ripiegate
di SOD1 e TDP-43 si trasmettono in modo
analogo a quanto avviene nelle patologie
prioniche (Grad LI et al., 2014).
Un altro ambito in cui sono coinvolte le EVs è
il trasporto di proteine, mRNA, miRNA, DNA e
piccoli RNA non codificanti derivati da cellule
neoplasiche. Le vescicole che ne derivano
prendono il nome di oncosomi e ne sono state
identificate diverse tipologie a seconda del
tumore di origine. EVs derivate da gliomi
contenenti sia RNA codificante che non, quando
vengono inserite in culture di cellule endoteliali,
inducono cambiamenti nella loro espressione
genica (Li et al., 2013).
Gli studi di Roccaro e colleghi (2013) hanno
inoltre dimostrato come gli oncosomi non
promuovano la crescita tumorale unicamente
modificando l’espressione genica delle cellule
target, ma anche sopprimendo l’attivazione
della risposta immunitaria, evento tipico
dell’induzione pre-metastatica.
5! di ! 9
EVs nella neurorigenerazione e
nel riparo
Le EVs sembrano essere coinvolte in processi
neuroprotettivi e neurorigenerativi del Sistema
Nervoso.
A livello del SNC è stato dimostrato che le
cellule gliali producono esosomi con funzione
trofica e di supporto ai neuroni (Lopez et al.,
2012).
In particolare, gli oligodendrociti secernono
esosomi che conferiscono ai neuroni protezione
da stress ossidativo (fig. 4), carenze di ossigeno
e di glucosio, ma non intervengono nella
rigenerazione neuronale a seguito di un danno.
Questa neuroprotezione sembra essere mediata
dal trasferimento di enzimi contro lo stress, tra
cui Hsp70, SOD1 e catalasi, responsabili
dell’attivazione di una serie di pathways che
regolano la trascrizione genica (Fruhbeis et al.,
2013).
Figura 4: Ruolo neuroprotettivo degli esosomi rilasciati da
oligodendrociti (Fruhbeis et al., 2013).
In aggiunta, gli astrociti rilasciano esosomi
contro lo shock termico e la microglia secerne
esosomi con attività proteolitica [citato in Lopez
et al., 2012].
A livello del SNP, gli esosomi rilasciati dalle
cellule di Schwann dedifferenziate sembrano
avere un ruolo importante nell’incremento della
rigenerazione assonale sia in vitro, che in vivo.
Recentemente è stato dimostrato da Lopez e
colleghi che i livelli di crescita assonale variano
a seconda della posizione lungo l’assone in cui
vengono somministrati gliesosomi isolati dalle
cellule di Schwann (fig. 5).
Figura 5: Rigenerazione assonale in neuroni trattati con
esosomi da cellule di Schwann (Lopez et al., 2013).
Soltanto quando la somministrazione avviene
nelle regione distale assonale, si osserva
rigenerazione; mentre la somministrazione
congiunta di esosomi al corpo cellulare e
all’assone distale provocano lo stesso effetto
della sola somministrazione distale.
I coni di crescita di neuroni trattati con esosomi,
mostrano una diminuzione dell’attività della
RhoA GTPasi che si riflette nell’incremento
della polimerizzazione di actina richiesta per il
rimodellamento di filopodi e lamellipodi.
Inoltre, esosomi derivati da cellule mielinizzate
sembrano fornire supporto trofico ai neuroni, in
particolare intervengono nel mantenimento
dell’omeostasi e facilitano la ricrescita assonale.
Nello studio di Madison e colleghi del 2014
(fig. 6) sono state confrontate le differenze di
crescita neuritica tra colture di assoni di
controllo e assoni trattati con EVs purificate da
C2C12 (linea cellulare muscolare). È stato
dimostrato che EVs derivate da miociti
aumentano la sopravvivenza e la crescita
neuritica in linee cellulari di motoneuroni in
vitro.
Infine, gli studi di Pusic e collaboratori hanno
evidenziato che esosomi isolati da cellule
dendritiche stimolate con interferone γ (IFNγ)
favoriscono il processo di mielinizzazione sia in
6! di ! 9
Figura 6: EVs C2C12 incrementano la crescita neuritica di
motoneuroni (Madison et al., 2014).
vitro, che in vivo. L’attività pro-mielinizzante è
stata correlata al trasporto di una specifica
famiglia di miRNA (miR-219) agli
oligodendrociti. Questi miRNA sono stati
dimostrati necessari e sufficienti per la
produzione di mielina da parte degli
oligodendrociti, riducendo l’espressione di
inibitori del differenziamento come NeuroD1, e
di fattori promuoventi la proliferazione come il
recettore PDGFRα. Carenze in miR-219 sono
state riscontrate in lesioni da sclerosi multipla,
suggerendo un suo possibile ruolo nella
diminuzione del differenziamento dei
progenitori OPC durante il decorso della
malattia.
Conclusioni e prospettive
Le EVs, mediante il trasferimento orizzontale di
RNA regolatori e altre classi di biomolecole,
hanno la capacità di trasmettere complessi
segnali tra cellule neurali e aggiungono un
ulteriore livello di complessità alla
comunicazione nel SN.
Esse svolgono funzioni importanti durante lo
sviluppo e il mantenimento dell’omeostasi
neurale, sono correlate alla diffusione di
patologie neurodegenerative, ma sono anche
coinvolte in processi di neuroprotezione e
rigenerazione.
Le ultime ricerche si sono focalizzate
sull’utilizzo delle EVs come biomarkers di
patologie neurodegenerative e tumorali, in
quanto sono stabili nei fluidi biologici e
possiedono pathways molecolari caratteristici.
Inoltre, i ricercatori stanno valutando il loro
possibile utilizzo per trasferire proteine tra
cellule, come ad esempio mRNA che inducono
apoptosi e proteine che contribuiscono alla
regressione tumorale. Un altro vantaggio del
trattamento terapeutico con EVs, infine, è dato
dalle loro piccole dimensioni che permettono la
somministrazione di farmaci in grado di
attraversare la barriera emato-encefalica.
La comprensione dei processi alla base delle
interazioni cellulari, molecolari ed ambientali
delle EVs potrebbero essere fondamentali per
sviluppare nuove terapie basate sulla loro
capacità di modificare trasmissione,
progressione e remissione di alcune
neuropatologie.
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