Di Bonaventura - CI MED LAB - lezioni 3

Diagnosi di laboratorio
delle infezioni virali
G. Di Bonaventura, PhD
Università “G. D’Annunzio”, Chieti-Pescara
[email protected]
Diagnosi di laboratorio delle
infezioni virali

Presuppone un’adeguata diagnosi clinica:


Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette


corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere
lo spettro delle indagini da eseguire
corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico
Diagnosi di laboratorio indispensabile quando:






sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico
il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati
(forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie)
sia necessario seguire “particolari” categorie di pazienti (ad esempio,
immunodepressi)
si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati
si ricerchi l’agente eziologico di nuove o gravi patologie
si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata
popolazione
Diagnosi di laboratorio delle infezioni
virali
La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può
essere eseguita seguendo due approcci differenti:
 approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo
virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus
direttamente nel campione clinico:
 Isolamento virale (coltivazione)
 Ricerca di particelle virali (microscopia)
 Ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica,
immunofluorescenza)
 Ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare)
 approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo
sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei
pazienti la presenza di anticorpi contro specifici antigeni virali:
 Ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici
Isolamento e crescita virale
Coltivazione dei virus
E’ il GOLD STANDARD delle metodiche di diagnosi virologica.
I virus sono patogeni “intracellulari obbligati”,
quindi:
richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati (cioè: sensibili e
permissivi)
 Fagi (batteriofagi o virus batterici)
 Batteri
 Virus animali
 Animale
 Uova embrionate
 Coltura cellulare animale
 Virus vegetali
 Pianta
 Coltura cellulare vegetale
Isolamento virale: pro e contro



Permette di isolare, tipizzare e conservare il virus
Consente di isolare anche virus non sospettabili o
non conosciuti al momento dell’isolamento
Importante per HIV (diagnosi precoce in bambini nati
da madri sieropositive) e CMV (diagnosi in bambini
da madri con infezione in atto od immunodeficenti)
TUTTAVIA:



Richiede lunghi tempi di esecuzione
Non è applicabile a tutti i virus (HPV, EBV, HBV,
HCV, rotavirus)
Poco sensibile (soprattutto in caso di infezioni
paucivirali) e specifico
Coltivazione di batteriofagi
 Batteri seminati su agar
 colture, in brodo o agar, di batteri in fase
esponenziale
 Aggiunta di batteriofagi
 l’infezione si manifesterà con:
 formazione di “placche” (zone chiare sulla
piastra) osservate in colture cresciute su agar
 riduzione della torbidità, in colture in brodo
Coltivazione di batteriofagi
Coltivazione di virus animali
 Colture cellulari
 Monostrati di cellule animali
 Tecnica maggiormente usata per la coltivazione virale
 formazione di placche (aree localizzate di lisi e distruzione
cellulare)
 comparsa di caratteristici effetti citopatici (CPE)
 Animale
 Topo, coniglio, maiale
 Embrione di pollo (uova embrionate)
 Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)
Coltivazione di virus animali Colture
cellulari

Colture cellulari “primarie”
 digestione enzimatica (tripsina, collagenasi) di organi/tessuti
 crescono in monostrato (cellule epiteliali) od in sospensione
(linfociti)
 vita limitata (colture a termine)
 esempi: rene di scimmia (paramyxovirus, enterovirus,
adenovirus)

Linee cellulari diploidi o semicontinue





colture di singolo tipo cellulare
derivano dall’embrione umano
stabili (non si differenziano) fino a 100 generazioni
esempi: fibroblasti fetali umani (HSV, VZV, CMV, adenovirus)
Linee cellulari “continue” (a vita illimitata)
 cellule “trasformate” (cellule tumorali aneuploidi)
 possono essere mantenute indefinitamente
 esempi: cellule HeLa
○ Henrietta Lax, 1951 (cancro cervice uterina)
Metodica di isolamento virale
Effetto citopatico
(CPE o placca)
Monostrato cellulare
(esposto all’azione virale)
Rilevazione di antigeni virali
(virus a crescita lenta, virus CPE-negativi)
CPE in vitro ed in vivo: sincizio
 Sincizi: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, indotta
da virus, di singole cellule.
 Prodotti da: Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV
virus del morbillo su carcinoma
gastrico umano (A549)
Sincizio prodotto dal virus del morbillo.
Cellula gigante multinucleata (freccia) in
sezione istologica di campione bioptico di
polmone prelevato da adolescente
immunocompromesso con polmonite.
CPE: corpi di inclusione
Corpi di inclusione: cambiamenti
istopatologici delle cellule infettate
causati direttamente all’azione di
componenti virali o modificazioni
delle strutture cellulari in seguito
all’infezione.
 Corpi del Negri (rhabdovirus)
 Inclusioni di Cowdry di tipo A
(herpesvirus, varicella-zoster)
 Inclusioni ad “occhio di gufo”
(CMV)
CMV: inclusioni ad “occhio di gufo”
Colture cellulari
Effetto citopatico: placca
CPE in vitro (placca): vaiolo su rene di scimmia (BSC40)
Bassa molteplicità di infezione (MOI)
Placca singola
Alta MOI, 48 hr
Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
La ricerca e l’identificazione diretta del virus direttamente nel
campione clinico prevede l’utilizzo di metodiche rapide, in
grado di fornire una risposta al quesito diagnostico in poche
ore oppure, al più, in giornata
 Microscopia elettronica

La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente
utilizzata:

assorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale metallico
pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido fosfotungstico)
 colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto negativo)




diagnosi rapida (15 min) e specifica sulla base di caratteri
morfologici (forma, dimensioni, organizzazione)
scarsa sensibilità: 106-107 virioni/ml; necessità di arricchire il
campione prima di osservarlo (tranne che per campioni fecali o
lesioni da HSV, in cui si hanno 1011 virioni/ml)
aumentata sensibilità mediante utilizzo di anticorpi
(immunoelettron-microscopia)
elevati costi di gestione, richiesta di elevata expertise e scarsa
sensibilità ne limitano l’impiego routinario
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: microscopia elettronica
HIV
Ebola virus
SARS
HBV
Conteggio diretto delle particelle virali
mediante microscopia elettronica


La sospensione virale è posta su un retino per ME e colorato.
L’inclusione di una quantità conosciuta di sfere di latex
permette una stima quantitativa del virus
 Non è una tecnica standard
 Richiede un sufficiente numero di particelle
virali. Adatto per diagnosi di infezioni con
massiva eliminazione virale (Rotavirus)
 Aggiunta di anticorpi specifici per aumentare
la sensibilità (immunoelettromicroscopia)
 Sovrastima del titolo
Microfotografia di una goccia contenente 15 microsfere in
lattice e 14 unità di virus vaccinico (Poxvirus) (leggermente
più piccoli, forma a “mattone”).
(da: Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds,, 2001)
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
 Ricerca di antigeni virali
E’ necessario che gli antigeni virali siano presenti nel campione e che si
disponga di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici
 A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare
(cellule, feci, sangue-siero) possono essere applicate le seguenti tecniche:

Immunofluorescenza (IF): rivelazione “fluorescente” del complesso Ag-Ab
 Diretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo coniugato con
isotiocianato di fluorescina (o rodamina)
 Indiretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo 1ario che, a sua
volta, viene legato da un anticorpo 2ario coniugato (diretto verso Fc delle Ig
della specie in cui è stato prodotto l’anticorpo 1ario)
 Immunoperossidasi (IP): rivelazione “colorimetrica” del complesso Ag-Ab
 similare alla IF, sebbene la marcatura dell’anticorpo consiste nella perossidasi
di rafano che, in presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione
colorimetrica
 molto utile se effettuata su preparati colorati per l’istochimica
 Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione “colorimetrica” complex Ag-Ab
 “sandwich test”: anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad
una superficie plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione
direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo
anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig
 utilizzabile anche per antigeni “solubili”
 non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione

Immunofluorescenza (IF):
diretta vs indiretta
IFA: CMV in
leucociti
IFA: Coronavirus
Utile per la ricerca di antigeni virali presenti
nelle cellule epiteliali di sfaldamento delle
vie respiratorie (adenovirus, coronavirus) o
di occhio e cute (HSV, VZV) o l’antigene
precoce pp65 di CMV nei leucociti infetti
Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni virali. Nel test diretto, l’anticorpo
marcato con colorante fluorescente è applicato al campione contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in
eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza.
Nel test indiretto, l’antigene è rilevato mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con
un anti-anticorpo marcato con una sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è
umano, il secondo anticorpo sarà un anticorpo contro le Ig umane).
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: ricerca antigenica mediante IP
Particolarmente utile se applicata a tessuti integri contromarcati con
coloranti istochimici (definizione delle relazioni spaziali tra antigene
virale e strutture cellulari)
Ricerca di antigeni specifici
mediante ELISA
Ricerca immunoistochimica antigenica del
West Nile virus nel cervello di hamsters infetti.
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: ricerca antigenica per ELISA
Adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida
(sangue, liquor, siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle colture infette).
Utile per la diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici
(rotavirus), epatitici (HBV) e HIV. E’ la metodica più frequentemente impiegata
nei laboratori di virologia.
Ricerca di antigeni specifici
mediante ELISA
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi
 Ricerca di acidi nucleici



Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali
Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione)
Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus:
 difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus)
 a lenta crescita (CMV, VZV)
 ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica
 Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità
 Differenti tipologie di saggi molecolari:
 Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA)

Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e
rivelazione elettroforetica
 Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che
impiega una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di
amplificazione vs PCR)

Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bDNA, HC):

bDNA: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi
alcalina complementari alla molecola di bDNA)
 Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato
con sonda a RNA specifica per la sequenza in esame
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: PCR
Indagini virologiche: ricerca DIRETTA
Metodi rapidi: Hybrid capture (HPC)
Misurazione della carica virale
Misurazione della concentrazione
delle unità infettanti (virali)

Titolo virale (ufp/ml)
 Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la
formazione di placche (ufp) in cellule animali in coltura

Dose di coltura tessutale (TVD)
 Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare

Dose letale 50 (LD50)
 Numero di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie

Dose infettante (ID50)
 Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta
anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento
Misurazione delle unità infettanti
Metodo diretto: Plaque assay
1:100
1:10
1:10
1:10
1:10
1:10
virus
serial dilution
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
100.000
10.000
1.000
100
10
1
plate 1 ml
plaques (n)
Titolo = 1 x 107 ufp (unità formanti placca) / ml
Plaque assay
da: Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-5
Misurazione delle unità infettanti
Metodo indiretto: inoculazione di uova embrionate
da: Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg “Microbiology” 4th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig. 48-1
Misurazione delle unità infettanti
Metodo indiretto: inoculazione di uova embrionate
Formazione di “pock” indotte da cowpox
virus sulla membrana corion-allantoidea
(CAM) di embrioni di pollo.
CAM di embrioni sani di pollo (11 giorni)
vengono inoculate con cowpox e le uova
incubate per 3 gg a 37.5°C. La CAM
viene quindi rimossa dall’uovo e
fotografata.
Le immagini evidenziano la formazione di
pocks emorragici.
(da: Fields Virology, 4th ed, Knipe &
Howley, eds, Lippincott Williams &
Wilkins, 2001, Fig. 2-1)
Misurazione della concentrazione
delle unità infettanti (virali)

Titolo virale (ufp/ml)
 Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la
formazione di placche in cellule animali in coltura

Dose di coltura tessutale (TVD50)
 Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare

Dose letale 50 (LD50)
 Numero (titolo) di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie

Dose infettante (ID50)
 Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta
anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento
Calcolo di LD50
Conteggio indiretto di particelle virali:
Emoagglutinazione (HA)
virus
No virus
Emoagglutinazione
aggiungere 0.1 ml PBS a 0.1 ml di campione
 allestire diluizioni seriali tipo “2-fold”
(1/2, 1/4, 1\8, …)
 aggiungere 0.05 ml 1% RBC animali (maiale,
pollo)
 incubare a +4°C per 1-2 h

Test di emoagglutinazione
1:8
1:2
1:2
1:2
1:2
1:2
virus
serial dilution
8
16
32
64
128
256
mix with red
blood cells
side view
top view
Titolo = 32 unità HA/ml (max diluizione virale che causa emoagglutinazione)
Test di Emoagglutinazione: virus influenzale
Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti tipi di influenzavirus, numerati da 1 a 7, sono stati diluiti
serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo (RBC), ed incubati in ghiaccio per
1-2 hs. I pozzetti dell’ultima riga non contengono virus (ctrl negativo). Il Titolo (indicato nell’ultima colonna)
è l’ultima diluizione in grado di causare emoagglutinazione completa. (da: Fields Virology, 4th ed, Knipe &
Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)
Diagnosi infezione virale
Comparazione sensibilità metodiche quantitative
Tecnica
Quantità (per ml)
Conta al microscopio elettronico
1010 particelle EM
Saggio in uova embrioate
109 egg ID50
Saggio di formazione di placca
108 ufp
Saggio di emoagglutinazione
103 unità HA
Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4
Diagnosi sierologica delle
infezioni virali
Meccanismi di difesa immunitari
Risposta umorale (produzione anticorpale)

Tutte le proteine virali sono immunogene. Nel corso
dell’infezione virale vengono prodotte tutte le tipologie
anticorpali:
 IgM, che si manifestano precocemente (indice di
infezione in atto/recente) e solo nella “prima infezione” di
soggetto non immune
 IgG, che si presentano più tardivamente e sono
prontamente mobilizzate a seguito dei possibili successivi
contatti con l’antigene. “Controllo” virale a livello sierico.
Più efficaci delle IgM
 IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante
ruolo di “barriera” alla penetrazione virale delle mucose

Gli anticorpi non hanno tutti funzione protettiva:
 La migliore risposta anticorpale è quella sviluppata nei
confronti degli antirecettori (capsidici o di peplos)
Diagnosi sierologica
La prevalente componente proteica della
struttura virale rende il virione altamente
immunogeno
 La diagnosi sierologica si basa essenzialmente
sulla ricerca di IgM (indice di infezione in atto o
recente)
 Alternativamente:

 Sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di
infezione (primaria) in atto
 Aumento del titolo anticorpale (fase acuta vs
convalescenza): indice di infezione (riattivazione o
reinfezione) in atto
Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche
 SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche
attività derivanti dalla formazione dell’immunocomplex
○ Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un
caratteristico effetto citopatico. Rappresenta il “gold standard”,
sebbene richieda elevati costi e tempi di esecuzione
○ Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione: Abs specifici
in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus
(influenza, parainfluenza, morbillo)
○ Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs
specifici si forma un immunocomplesso che lega il
Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può
lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione
dell’immunocomplesso: Ag + eritrociti)
Titolo anticorpale: la più alta diluizione in grado di inibire …
Diagnosi sierologica
saggi di neutralizzazione/inibizione
emoagglutinazione
Saggio di inibizione della
emoagglutinazione
Virus
HA
8 wks
1 wk
Serum
dilution
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
-ve control
Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche
 SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot):
identificazione di Abs diretti verso singole e
specifiche proteine virali
○ separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante
○
○
○
○
○
elettroforesi
trasferimento Ags su membrana
esposizione al siero in esame
sistema di rilevazione colorimetrica dell’immunocomplex:
Abs anti-Ig umane marcati con enzima
aggiunta del substrato per l’enzima
rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)
Diagnosi sierologica
Western blot
Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche
 SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e
radiometrico):
○ adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o biglie di
polistirene)
○ aggiunta del siero in esame
○ rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2ario
anti-IgG umane marcato con:
 EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire
con idonei substrati (reazione colorimetrica, misurata allo
spettrotometro)
 RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo (125I),
segnale misurato con un contatore di raggi gamma
Il saggio EIA viene comunemente preferito perchè automatizzabile,
versatile, standardizzabile
Immunological detection
Immunoistochimica
bovine herpesvirus antigens
in endothelial cells
Immunofluorescenza
BHV-1 antigens in neuron
In trigeminal ganglion