universita` degli studi di pavia facolta` di scienze mm. ff. nn. farmacia

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA
FACOLTA’ DI SCIENZE MM. FF. NN.
FARMACIA E MEDICINA
DIPARTIMENTO DI FISICA NUCLEARE E TEORICA
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE
CORSO DI LAUREA INTERFACOLTA' IN BIOTECNOLOGIE INDUSTRIALI
STUDI PRELIMINARI PER L’APPLICAZIONE DELLA
BORON NEUTRON CAPTURE THERAPY (BNCT) ALLE
METASTASI DIFFUSE NEL POLMONE DI RATTO
Relatore:
Chiar.mo Prof. Saverio Altieri
Correlatori:
Chiar.ma Prof.ssa Rosanna Nano
Dott. James G. Bakeine
Tesi di Laurea Magistrale di
Marta Di Salvo
Anno Accademico 2007-2008
INDICE
Introduzione
3
Capitolo 1
7
La terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT)
1.1 Le basi della BNCT
1.2 La BNCT delle metastasi epatiche diffuse
1.2.1 Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico
1.2.2 Il follow up post operatorio
7
7
12
15
1.2.3 Discussione e conclusioni
17
19
Capitolo 2
21
La BNCT nel trattamento dei tumori polmonari diffusi
2.1 Cancro polmonare: stato attuale della ricerca
2.2 Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale
2.3 La BNCT nei tumori diffusi del polmone
2.4 Il modello animale
2.5 Misura della concentrazione di 10B nel polmone di ratto
2.6 Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello ..
21
21
25
27
29
31
35
Capitolo 3
37
Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di ratto
3.1 Trattamento BNCT in vitro
3.1.1 Efficienza di piastramento
3.1.2 Sopravvivenza delle cellule post-irraggiate
3.3 Studio in vivo
3.4 Caratterizzazione istologica della malattia polmonare metastatica
37
38
39
41
41
45
Capitolo 4
49
Conclusioni e sviluppi futuri
49
Bibliografia
52
1
2
Introduzione
Una terapia ideale per il trattamento dei tumori diffusi deve distruggere
selettivamente tutte le cellule tumorali senza creare danni al tessuto
normale; la terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT) è un trattamento
bimodale che presenta caratteristiche che si avvicinano a questo ideale; essa
è basata sull'effetto biologico indotto nei tessuti dalla reazione nucleare
10
B(n,α)7Li e la sua selettività dipende non solo dal campo neutronico con
cui si irraggia il tumore ma anche e soprattutto dalla diversa biodistribuzione dell'elemento 10B nelle cellule tumorali rispetto a quelle sane.
Sfruttando il differente metabolismo tra cellule tumorali e sane, l'accumulo
del boro produce una distinzione significativa tra le unità tissutali e dunque,
in seguito all'irraggiamento, un trattamento differenziato dei tessuti malati
rispetto a quelli normali [1,2]. Questa proprietà intrinseca del trattamento
acquista un particolare valore nei quadri clinici dei tumori multifocali
distribuiti sull'intero volume dell'organo e che, quindi, non sono trattabili
con le consuete tecniche radioterapiche.
La presente tesi si inserisce nello studio condotto (presso l'Università di
Pavia con finanziamenti MIUR e INFN) sulla fattibilità della BNCT dei
tumori diffusi, in particolare quelli polmonari; il carcinoma polmonare,
infatti, tra tutte le patologie oncologiche, presenta l'incidenza più alta a
3
livello mondiale e ha, d'altro canto, la peggior prognosi. Inoltre, le metastasi
che interessano il polmone sono quasi sempre letali perchè sono in forma
diffusa e chirurgicamente non operabili. La BNCT mostra una serie di
caratteristiche intrinseche che la rendono una terapia potenzialmente
radicale per questo tipo di patologie.
La ricerca condotta a Pavia in ambito BNCT ha riguardato il trattamento dei
tumori diffusi inoperabili; in passato il gruppo si è dedcato al trattamento
delle metastasi epatiche diffuse e più recentemente è passato studiare la
possibilità di estendere l’applicabilità della BNCT ai tumori polmonari
diffusi. Come primo step in quest’ultimo campo è stata affrontata la verifica
dell’assorbimento selettivo del boro nel tumore e la possibilità di creare un
campo di neutroni termici uniforme nel volume polmonare da irraggiare. Da
un lato è stato messo a punto un modello di ratto con metastasi polmonari da
adenocarcinoma del colon ed è stato studiato l’assorbimento del boro in
funzione del tempo, sia nei tessuti tumorali sia nel polmone sano; dall’altro
è stata studiata con metodi di Monte Carlo la distribuzione della dose di
radiazione
nel
torace
di
un
modello
antropomorfo.
Nel
lavoro
sull’assorbimento del boro e sulla sua biodistribuzione nel ratto con
metastasi polmonari, è stato dimostrato che si produce una concentrazione
di boro 4-5 volte più alta nel tumore rispetto al parenchima polmonare sano
dopo 4 ore dall’iniezione intraperitoneale di Borophenilalanina (BPA) [3,4].
4
Con calcoli Molte Carlo si è visto che irraggiando un modello di torace
umano con due fasci collimati e contrapposti (antero-posteriore e posteroanteriore) di neutroni epitermici [5,6] si ottiene in tutto il polmone una
distribuzione uniforme di neutroni termici; questo garantisce la possibilità di
colpire il tumore con la stessa efficacia indipendentemente dalla sua
posizione nell’organo. Questi risultati positivi ci hanno spinti a proseguire
nella ricerca, che è stata indirizzata allo studio dell’efficacia del trattamento
delle metastasi nell’animale per mezzo della linea cellulare DHD/K12/TRb
di adenocarcinoma del ratto. Si sta studiando la sopravvivenza di queste
cellule trattate con Borophenilalanina (BPA) e irraggiate con neutroni; lo
studio viene condotto sia in vitro sia nell’ animale. La tappa finale di questa
ricerca prevede l’irraggiamento nella colonna termica del reattore TRIGA
Mark II dell’Università di Pavia, di un certo numero di ratti con tumore e
trattati con BPA. Da questo punto di vista l’esperimento rappresenta la
prosecuzione degli studi condotti al MIT (Massachussets Institute of
Technology) di Boston dedicati allo studio degli effetti della BNCT nel
polmone sano di ratto.
Il lavoro descritto in questa tesi riguarda lo studio dell’efficacia della BNCT
nel tumore metastatico polmonare; sono stati condotti esperimenti sia in
vitro che in vivo-vitro. Cellule di
adenocarcinoma del colon
DHD/K12/TRb, in grado di produrre metastasi polmonari nel ratto, sono
5
state trattate con BNCT ed inoculate in ratti singenici BD-IX; è stata quindi
studiata l’efficacia del trattamento BNCT valutando la sopravvivenza dei
ratti e analizzando nell’animale la capacità proliferativa delle cellule trattate.
6
CAPITOLO 1
La terapia per cattura neutronica sul Boro
(BNCT)
1.1 Le basi della BNCT
La BNCT (Boron Neutron Capture Therapy) è una terapia oncologica basata
sull'irraggiamento con neutroni di bassa energia di un volume tumorale
dopo la somministrazione di un drogante borato in grado di accumularsi
selettivamente nelle cellule malate. L'isotopo 10 del boro non è radioattivo e
presenta una sezione d'urto estremamente elevata (3837 barn) per la cattura
di neutroni termici mediante la reazione 10B(n,α)7Li (fig.1).
Fig. 1 Rappresentazione schematica della reazione di cattura
neutronica sul 10B.
In seguito a questa reazione nucleare vengono emesse particelle α e ioni Li
ad alto Trasferimento Lineare di Energia (LET) e con range in tessuto di 7 e
7
4 µm, rispettivamente, confrontabili con le dimensioni lineari delle cellule;
queste particelle trasportano un’energia complessiva di 2.79 MeV che viene
rilasciata entro pochi µm dal punto di produzione.
Il razionale alla base della BNCT come terapia medica sta dunque nella
possibilità di depositare, mediante la radiazione prodotta dall'irraggiamento
del
10
B, una dose sufficientemente alta da indurre delle lesioni letali, quali
danni irreversibili al DNA e apoptosi, nella cellula tumorale che ha
accumulato il drogante.
Le particelle pesanti sono più efficaci delle radiazioni γ o degli elettroni nel
produrre danni biologici. Infatti gli effetti dell’irraggiamento di un tumore
sono legati non solo alla dose assorbita, che esprime a livello macroscopico
l’energia assorbita per unità di massa, ma anche ad almeno altri 2 parametri:
1) il modo di trasferire energia dalla radiazione al tessuto, espresso dal
LET, che rappresenta la densità lineare di energia ceduta lungo il
percorso della particella (si misura in KeV/ μm);
2) il contenuto di ossigeno nei tessuti irradiati; gli effetti biologici
solitamente diminuiscono quando si riduce il contenuto di ossigeno
nei tessuti e di questo bisogna tener conto quando si irraggiano
tessuti tumorali, nei quali il tenore di ossigeno è generalmente basso,
poiché sono scarsamente vascolarizzati.
8
Sperimentalmente si è osservato che le radiazioni ad alto LET come
particelle α e ioni pesanti, nel danneggiare le cellule, sono più efficaci delle
radiazioni a basso LET (elettroni, X , γ) e il loro effetto non risente della
scarsa ossigenazione. Questo fatto si può spiegare perché nel caso di
radiazioni ad alto LET gli effetti di danno sono legati alle elevate cessioni
locali di energia, che comportano più frequenti rotture del DNA delle cellule
colpite. E’ ovvio che la BNCT, in cui entrano in gioco particelle α e 7Li sia
più efficace delle terapie con elettroni o raggi γ.
I danni biologici, essendo legati alla dose, dipendono dal numero di reazioni
10
B (n,α) 7Li che avvengono nella cellula e quindi dalla concentrazione di
10
B e dall’intensità del fascio di neutroni termici. Poiché si vuole dare una
dose letale di radiazione solo alle cellule tumorali, risparmiando quelle sane,
è necessario che la concentrazione di
10
B nei tessuti tumorali sia maggiore
che nei sani. A tale scopo è importante la ricerca di composti veicolanti il
Boro, che entrino in modo preferenziale nelle cellule tumorali, permettendo
di raggiungere un rapporto tra la concentrazione di 10B in tessuti tumorali e
sani significativi per la terapia.
Se il veicolante del 10B fosse assorbito esclusivamente dalle cellule tumorali
si disporrebbe di una terapia totalmente selettiva, in grado cioè di
danneggiare solo il tessuto malato risparmiando completamente il
9
circostante sano (purchè una raggiunta una concentrazione minima di
soglia). Nella pratica questo purtroppo non avviene ed è dunque importante
raggiungere nei tessuti delle condizioni di deposito differenziale, che
ovviamente privilegino la componente istologica tumorale. Si osservi inoltre
che, data l'anatomia di un tumore, l'irraggiamento neutronico non potrà mai
interessare esclusivamente i volumi tumorali ma inevitabilmente interesserà
anche regioni istologicamente sane. Nella pratica medica della BNCT si
raggiunge quindi la selettività richiesta somministrando al tumore una dose
letale mantenendo la dose ai tessuti sani al di sotto di un valore di tolleranza
tipico di ogni tessuto.
L’indiscusso vantaggio della BNCT è la selettività che non trova
significativi rivali nelle altre tecniche radioterapiche, comprese quelle
all’avanguardia come l’adroterapia. Nella BNCT la selettività non dipende
dal campo di irraggiamento ma a dalla biodistribuzione del 10B, che, come è
stato dimostrato, può essere accumulato preferenziale nelle cellule tumorali
quando veicolato da appositi farmaci. Ancora, visto che l'accumulo di
10
B
interessa indipendentemente ogni singola cellula, con la BNCT si possono
trattare anche foci tumorali così piccoli da risultare invisibili alle normali
indagini diagnostiche, fornendo così anche ai pazienti in stadi estremamente
avanzati e con metastatizzazione capillare diffusa una speranza di cura e
sopravvivenza.
10
L'impiego della BNCT alla gamma più vasta possibile di patologie
neoplastiche dipende criticamente dai progressi riportati nei vari campi di
ricerca coinvolti, quali la fisica biomedica, la chirurgia e la radioterapia. A
monte è comunque imprescindibile la sintesi di nuovi droganti, in grado di
assicurare rapporti di concentrazione tumore/sano per il
10
B anche più
elevati di quelli attualmente ottenibili. I droganti attualmente impiegati per
la BNCT clinica sono il BSH (Sodium Dodecaborane (Na2B12H11SH) e il
BPA (BoroPhenylAlanine, C9H1210BNO4). Il primo risulta particolarmente
adatto al trattamento dei tumori cerebrali. Infatti, la cinetica di accumulo
della molecola prevede l'attraversamento della barriera emato-encefalica
solo nelle zone in cui la struttura è danneggiata dal tumore. Il meccanismo è
passivo e perciò non garantisce dei rapporti di concentrazione tra il tumore e
il sangue superiori a 2; inoltre il boro si va a depositare nello spazio
intracellulare,
rimanendo
relativamente
lontano
dal
nucleo
più
radiosensibile. Al contrario, la BPA entra nelle cellule mediante un
meccanismo attivo e si distribuisce nel nucleo cellulare e nel citoplasma in
modo uniforme. Il
meccanismo attivo assicura un considerevole
interessamento del sangue, che comunque presenta valori di concentrazione
tra la metà e un quarto di quella caratteristica del tumore, garantendo così
una buona selettività.
11
Gli studi attualmente in corso hanno come principio cardine lo sviluppo di
molecole in grado di rispondere specificatamente ad agenti espressi dalle
cellule tumorali, così da disporre di droganti dedicati alle singole linee
cellulari. La più interessante eccezione a questo approccio è rappresentata
dalla molecola GB-10 che esplica la sua selettività non tanto nel deposito
cellulare quanto in uno specifico effetto a carico dei vasi sanguigni propri
della massa tumorale [7].
Le altre possibili frontiere della ricerca in campo chimico sono le
nanotecnologie e l'impiego dei liposomi. Con le prime si tenta di costruire
una nanostruttura cava all'interno della quale depositare il boro. La
selettività potrebbe essere assicurata mediante l'impianto sulla superficie
della nanoparticella di recettori specifici per il tumore di volta in volta
trattato [8] . Un meccanismo analogo impiegherebbe i liposomi, che hanno
dimostrato capacità di trasporto del boro sia in esperimenti in vitro che in
vivo [9].
1.2 La BNCT delle metastasi epatiche diffuse
In questo paragrafo viene illustrata l’applicazione della BNCT
al
trattamento delle metastasi diffuse e multifocali insediate in organi che
possono essere sottoposti alla procedura di autotrapianto; il protocollo
12
originale messo a punto a Pavia è noto con l'acronimo TAOrMINA
(Trattamento Avanzato di Organi Mediante Irraggiamento Neutronico ed
Autotrapianto) ed è stato applicato per la prima volta al mondo su due
pazienti terminali [10,11].
Nel 1984 presso l’Università di Pavia fu avviato un grande programma
multidisciplinare di ricerca
con l’obbiettivo di applicare la BNCT al
trattamento delle metastasi epatiche diffuse e non operabili chirurgicamente.
Le fasi principali del trattamento prevedono la perfusione del fegato con
BPA, l’espianto dell’orgnao, l’irraggiamento all’interno di una postazione
del reattore nucleare e il successivo reimpianto nel paziente. Il programma è
stato sviluppato da una collaborazione fra la sezione pavese dell’Istituto
Nazionale di Fisica Nucleare (INFN), il Dipartimento di Fisica Nucleare e
Teorica e i Dipartimenti di Chirurgia e di Biologia Animale. L’applicazione
sui pazienti è stata preceduta da una lunga fase di studio in vitro ed in vivo
su un modello animale messo a punto dalla collaborazione.
Cellule neoplastiche della livnea DHD/K12/TRb da adenocarcinoma sono
state iniettate per via intrasplenica in ratti BD-IX inducendo così lo sviluppo
di metastasi epatiche. Con questo modello animale è stata dapprina
dimostrato l’assorbimento selettivo del boro nelle metastasi epatiche; come
carrier del boro è stata usata la 10BPA, una sostanza che penetra nelle cellule
13
cancerogene con un meccanismo di trasporto attivo, cosicchè la
concentrazione di 10B nelle cellule può essere più alta di quella presente nel
fluido interstiziale e nel mezzo di coltura [12-13]. Gli effetti della BNCT
sono stati studiati in vitro sulla suddetta linea cellulare. Dopo la crescita in
terreno di cultura contenente BPA le cellule sono state sottoposte ad
irraggiamento neutronico. Gli effetti in vitro sono stati studiati sulle cellule
seguendo la loro capacità proliferativa con il test dell’efficienza di
piastramento, una delle più comuni procedure per valutare la sopravvivenza
delle cellule dopo l’irraggiamento. La valutazione della sopravvivenza
dipende dalla dimostrazione che le cellule mantengono la capacità
proliferativa per formare colonie contenenti più di 50 cellule [14]. Gli
esperimenti sono stati fatti su cellule mantenute per 18 ore in un medium
contenente 10BPA in quantità tali da produrre una concentrazione di 20 ppm
di
10
B. Dopo l’irraggiamento neutronico (ad una fluenza di neutroni termici
di 7x1012 cm-2) le cellule sono state seminate in varie flasks di coltura e su
piastre Petri per l’osservazione a diversi intervalli di tempo: 1, 2, 5, 7, 9, 12,
15 e 21 giorni e per effettuare il conteggio delle cellule e l’analisi del DNA;
naturalmente nello studio sono stati osservati campioni di controllo (varie
combinazioni fra esposizione al boro e all’irraggiamento neutronico). Il test
dell’efficienza di piastramento è stato fatto seminando cellule in 5 piastre
Petri replicate per ciascuna concentrazione selezionata con un range che va
da 50 a 250 cellule per i campioni di controllo e da 1x105 a 5x105 per la
14
cellule trattate. Le cellule sopravvissute dopo il trattamento sono
visibilmente allungate, fenomeno dovuto a una mancata divisione cellulare e
quindi ad un aumento del contenuto di DNA. L’efficienza di piastramento
conferma gli effetti del trattamento ma evidenzia anche la presenza di una
subpopolazione di cellule resistenti pari a circa lo 0.05% delle cellule
trattate.
Il test di validazione preclinico in vivo è consistito nello svolgimento
dell’intera procedura della BNCT nel ratto con metastasi epatiche di colon
carcinoma. Risultati ottenuti [15-16] hanno dimostrato:
1) che il tessuto epatico sano non è stato danneggiato dal trattamento
BNCT;
2) la presenza di cellule fagocitarie di Kupffer;
3) la presenza di leucociti coinvolti nel processo di rimozione dei debris
cellulari.
1.2.1 Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico
Nel 2001, avendo ottenuto l’approvazione del Comtato Etico del Policlinico
S. Matteo e del Ministero della Salute, è stato dato l’avvio al programma
dell’applicazione clinica della BNCT su un fegato isolato[17]. La procedura,
applicata su 2 pazienti, comprendeva sostanzialmente tre fasi: la prima fase
15
chirurgica includeva la perfusione del fegato con una soluzione di
10
BPA;
nella fase radioterapeutica il fegato isolato veniva lavato e raffreddato,
trasferito nella colonna termica del reattore nucleare Triga Mark II e
irraggiato con una fluenza neutronica di 4x1012 cm-2 corrispondente ad un
tempo di irraggiamento di circa 10 minuti; in seguito, nella seconda fase
chirurgica, il fegato veniva reimpiantato nel paziente.
Ai controlli successivi all'operazione, il fegato del primo paziente mostrava
chiari segni di necrosi nelle zone che in diagnosi erano state classificate
come sedi metastatiche, anche laddove le metastasi erano state rilevate solo
con un’ecografia intra-operatoria (alcune metastasi erano troppo piccole per
essere individuate con le attuali tecniche di imaging dall’esterno del corpo).
Questo primo paziente è sopravvissuto per 4 anni senza mostrare segni di
recidive che sono poi purtroppo sopraggiunte sia in sede epatica che
extraepatica, portandolo alla morte un anno dopo la loro individuazione.
Il secondo caso, trattato nel 2003, ha presentato un decorso peggiore in
quanto il paziente è deceduto dopo un mese in seguito ad una trombosi
dell'arteria epatica. In questo caso le condizioni iniziali del paziente erano
davvero pesantemente debilitate ed era nota una cardiomiopatia che poteva
gravemente influenzare l'esito del trattamento. L'analisi postmortem del
fegato ha comunque confermato il potenziale curativo della tecnica
16
TAOrMINA, mostrando zone necrotiche in corrispondenza di tutte le
metastasi: sia quelle accertate dall’esterno che quelle accertate nell’esame
intraoperatorio. Considerando la concentrazione di
10
B nel tumore e nel
tessuto normale e quindi le dosi delle radiazioni assorbite, i quadri di questo
paziente sono buoni come lo sono stati per il primo; la durata della
procedura si è rilevata più breve nonostante le difficoltà insorte dalla
correzione chirurgica della suddetta anomalia vascolare.
1.2.2 Il follow up post operatorio
All’inizio il periodo post operatorio (cioè le prime tre settimane dopo la
BNCT) è stato molto simile in entrambi i pazienti che hanno mostrato
sintomi di insufficienza renale ed epatica e una precoce rabdomiolisi con
profonda astenia, inibizione dei tessuti maggiori e segni di indebolimento
celebrale. Queste manifestazioni cliniche sono apparse secondo una
sequenza definita e hanno mostrato una evoluzione simile, apparentemente
riconducibile a una sindrome. Possiamo attribuire ciò ad un grande aumento
dei
mediatori
tumorali,
probabilmente
citochine,
prodotte
come
conseguenza di una grande quantità di lisi cellulare. Dopo la BNCT in
questi noduli neoplastici si è osservata la presenza di aree necrotiche di
tessuto. Delle piccole aree di danno necrotico sono apparse nel fegato anche
17
quando nel periodo pre-operativo non erano state trovate metastasi. Questo
lascia supporre che sono state trattate anche neoplasie “nascoste” diffuse.
Il secondo paziente una volta operato ha mostrato delle complicazioni
Fig 2.: Aspetto macroscopico del fegato all’autopsia del secondo paziente 33
giorni dopo il trattamento. A sinistra, vista esterna della convessità e, a destra,
sezione coronarica lungo il lobo destro. Aree necrotiche biancastre multiple
sono diffuse sulla superficie parenchimale e all’interno dell’organo.
vascolari
che
consistevano
in
una
trombosi
dell’arteria
epatica,
un’insufficienza cardiaca con uno squilibrio liquido ed edema polmonare.
Mascroscopicamente sulla superficie del fegato sono state trovate masse
biancastre di varie forme e dimensioni. (Figg 2) La corrispondente
microscopia ha evidenziato masse necrotiche di tipo coagulativo con
scomparsa
dell’originale struttura istologica (Fig 3). Nella cicatrice
diaframmatica aderente al fegato sono state trovate infiltrazioni focali di
cellule di carcinoma del colon. Il normale tessuto epatico è stato sottoposto
a biopsia e non è stata trovata alcuna metastasi intraepatica.
18
Fig 3.: Sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina osservate in
campioni ottenuti dal secondo paziente. .
1.2.3 Discussione e conclusioni
Le considerazioni finali sono basate sui risultati ottenuti con le applicazioni
di una procedura interamente nuova con solo due pazienti..Si sono trovati
degli aspetti molto positivi in termini di efficienza oncologica. Altri aspetti
si sono rilevati meno favorevoli, discutibili e che richiedono miglioramenti.
Iniziando dagli aspetti positivi l’esperienza clinica
conferma l’efficacia
della BNCT nel distruggere le popolazioni di cellule tumorali e l’alta
selettività di questo annientamento. Nessun altro tipo di terapia
antineoplastica può essere equiparabile. Questa dichiarazione è basata sui
risultati dell’indagine macroscopica e sulla valutazione microscopica del
19
fegato nel secondo paziente. La presenza delle cellule neoplastiche
multifocali nei noduli irraggiati testimonia un processo che permette la
graduale eliminazione delle popolazioni cellulari, in cui è rallentata la
capacità proliferativa dovuta al danno di radiazioni. La locazione di queste
cellule alla periferia delle masse necrotiche neoplastiche può essere
facilmente espiantata. L’attivo ruolo dei fagociti in seguito all’irraggiamento
con BNCT aumentano e si osservano numerose cellule di Kupffer nell’atto
di fagocitare detriti cellulari. Anche in termini di tempo di sopravvivenza si
sono riscontrati dati eccezionali poichè si sono ottenuti 44 mesi di buona
qualità di vita nel primo paziente, se messo a confronto con il tempo medio
di sopravvivenza di 4-10 mesi previsti dalla letteratura medica [18,19].
Un’altra affermazione che si è riscontrata è la prova del basso impatto della
radiazione neutronica sul tessuto normale epatico. Nonostante le diffuse
fibrosi epatiche che si sono riscontrate in entrambi i pazienti, la funzione
epatica, come valutato dal GEC, è migliorata nel primo paziente dopo la
BNCT (73% vs 63% pre-operazione). I disordini clinici e biochimici
osservati durante le tre settimane del periodo pre-operativo sono
un’espressione di una “sindrome post-irraggiamento”, che può essere
mediata dal rilascio di una grande quantità di citochine.
20
CAPITOLO 2
La BNCT e il trattamento dei tumori polmonari diffusi
I risultati positivi ottenuti nel trattamento mediante BNCT delle metastasi
epatiche diffuse ci hanno spinti a studiare la possibilità di estendere questa
tecnica al trattamento dei tumori diffusi del polmone.
In questo caso
abbiamo esplorato anche la possibilità di effettuare il trattamento
irraggiando il torace con fasci esterni di neutroni, ossia senza fare ricorse
all’espianto degli organi.
2.1 Cancro polmonare: stato attuale della ricerca
Ogni anno, in tutto il mondo, il cancro viene diagnosticato a circa 10.9
milioni di persone e, nello stesso lasso di tempo, si stimano 6.7 milioni di
decessi per cause oncologiche. Ciò significa che circa il 12% dei decessi di
qualsiasi natura ha come causa una forma di cancro. Questa frazione varia
tra le diverse regioni del globo: si ha un minimo del 4% in Africa ed un
massimo del 23% nel Nord America, mentre l'Europa si caratterizza con un
19% di frequenza.
21
A livello mondiale e prescindendo dalla distinzione tra i sessi, gli studi
epidemiologici attuali danno come carcinoma maligno più comune quello
polmonare, con circa 1.4 milioni di nuovi pazienti ogni anno, equivalenti al
12.8% di tutti i nuovi casi diagnosticati (Fig. 4). Il 58%dei casi di questo
tumore compete ai paesi economicamente più sviluppati [20]. Statistiche
molto recenti, risalenti al 2006 e riferite alla sola area europea, danno invece
come più frequente il carcinoma alla mammella (13.5% di tutti i casi
diagnosticati), seguito da quello al colon retto (12.9%) e, infine, da quello
polmonare (12.1%) [21].
Fig. 4: tumori più comunemente diagnosticati escluso il NMSC1, stime
mondiali nel 2002
1
NMSC = Non Melanoma Skin Cancer
22
Nel 2002, l'incidenza del carcinoma polmonare tra la popolazione maschile
italiana è risultata la più alta tra quelle di tutti i più comuni tumori, mentre
tra le donne è stata solo quarta, preceduta dal carcinoma mammario, del
colon retto e dell'utero [22] (Fig. 5). Queste incidenze sono in accordo con
l'aspetto noto e globale che il carcinoma polmonare predilige i pazienti
maschi, anche se nei Paesi occidentali da alcuni anni si sta assistendo ad un
lento ma costante aumento della vulnerabilità femminile.
Fig. 5: frequenza e mortalità dei tumori più comuni nella popolazione italiana
al 2002
Per quel che riguarda la correlazione cancro-età, l’intervallo di tempo
statisticamente più
23
fragile risulta essere quello tra 55 e 65-70 anni che, vista l'aspettativa di vita
media nei Paesi sviluppati di 75.8 anni, fa del cancro al polmone una
malattia a considerevole impatto sociale ed economico. Di nuovo e sempre
per i Paesi tecnologicamente trainanti, da qualche anno si sta osservando un
aumento del numero di pazienti afferenti alle fasce più giovani.
Nonostante le numerose innovazioni sia sul piano diagnostico che su quello
terapeutico che hanno portato ad un incremento della sopravvivenza e della
qualità di vita dei pazienti, quello polmonare rimane il carcinoma con
peggior prognosi su scala globale, in grado di rendere conto del 18% di tutti
i decessi imputati al cancro (Fig. 6). In questo senso non c'è disaccordo con
le ultime statistiche europee che imputano al tumore polmonare il 19.7% dei
morti per cancro. Per l'esito tipicamente infausto della malattia è certamente
determinante il fatto che molti carcinomi polmonari vengono diagnosticati
in uno stadio già avanzato. Inoltre, molti pazienti sono fumatori abituali e
perciò presentano ulteriori danni cardiaci e polmonari che pregiudicano
l’impiego delle più efficaci e adottate opzioni terapeutiche, quali la
resezione chirurgica e le terapie multimodali. La più alta percentuale di
sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi si riscontra tra i pazienti statunitensi
(14%), mentre in Europa il valore è più basso (8%) ma comunque in
accordo con la media caratteristica dei Paesi tecnologicamente sviluppati.
24
Fig.6 : mortalità dei più comuni tumori, stime mondiali al 2002
2.2 Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale
La radioterapia è la tecnica più usata nei casi di carcinoma polmonare non
resecabile chirurgicamente, grazie alla sua capacità di eradicare grosse e
localizzate masse tumorali dalla regione toracica. Sebbene i primi impieghi
nella pratica medica siano stati molto stimolanti, ben presto sono emersi i
limiti di questa tecnica: una inaccettabile fallibilità a livello sistemico (stadi
avanzati metastatizzati) e un povero controllo locale, di norma positivo solo
nel 20-40% dei casi. Di fatto tutte le ricadute successive a cicli di
radioterapia possono essere ricondotte o ad una non perfetta circoscrizione
della sede del tumore primario o alla deposizione nella stessa di una dose
25
inadeguata, o a tutte e due le cause. D'altro canto, non si deve pensare che
per migliorare il controllo locale si possa semplicemente aumentare la dose
impartita al tumore; infatti questa via è fortemente limitata dai gravi effetti
collaterali sui tessuti sani, come polmoniti ed esofagiti, la cui incidenza,
come quella del controllo del tumore, aumenta proporzionalmente con
l'aumento della dose totale assorbita. I futuri sviluppo nel campo della
radioterapia devono quindi concentrarsi su due aspetti fondamentali: il
deposito della dose più alta e geometricamente accurata possibile nella sede
tumorale e la salvaguardia dei tessuti sani, in altre parole, la
massimizzazione del rapporto di dosi tra regioni istologicamente normali e
quelle interessate dalla malattia.
Nella pratica, la radioterapia può venire somministrata mediante fasci di
radiazioni di diversa natura: fotoni (tipicamente nella regione X) che
rappresentano la pratica radiogena più tradizionale, particelle cariche
leggere (elettroni) oppure pesanti (protoni o ioni di masse superiori, ad
esempio ioni carbonio o ferro), come ancora particelle neutre (neutroni).
Due aspetti sono di fondamentale importanza per capire i differenti benefici
e/o svantaggi
delle tecniche che impiegano le diverse radiazioni: la distribuzione di dose
nei tessuti in funzione dello spessore attraversato e l'efficacia biologica,
quantificata attraverso il parametro di Efficacia Biologica Relativa (RBE).
26
2.3 La BNCT nei tumori diffusi del polmone
La selettività della BNCT, come già detto in precedenza, è determinata dalla
microdistribuzione del
10
B, piuttosto che dalla conformazione del campo
neutronico impiegato per il trattamento. Questo conferisce alla terapia una
spiccata indipendenza dall’anatomia del tumore e libera i terapisti dalla
necessità di conoscere in dettaglio la conformazione della massa da trattare
per progettare il più sicuro piano di irraggiamento. Questa proprietà della
BNCT è ancora più rilevante quando si ha a che fare con una forma
tumorale diffusa, il cui caso più eclatante è certamente quello della
metastatizzazione secondaria.
Il progetto WIDEST, finanziatio dall’INFN e attivato presso l'Università di
Pavia, si inserisce in questo contesto ed ha come obiettivo lo studio della
fattibilità della BNCT per il più largo spettro possibile di tumori maligni
diffusi. Incoraggiati dagli esiti positivi dei trattamenti condotti sulle
metastasi epatiche, nel 2005 è stato avviato un progetto di ricerca sui tumori
diffusi del polmone. A livello mondiale il carcinoma al polmone è la più
comune causa di morte di uomini e donne e il 14% del tasso di
sopravvivenza a 5 anni è rimane immutato da anni. Per questa ragione è
essenziale una nuova proposta e la validazione di una nuova terapia e nel
2005 è stato avviato il progetto WIDEST per iniziare uno studio sulla
27
fattibilità di una terapia mediante BNCT utilizzando l’esperienza e le
conoscenze dei gruppi che avevano già lavorato sulla ricerca del fegato. La
filosofia alla base del trattamento del polmone è identica a quella adottata
per il fegato, ma la realizzazione pratica richiede un cambiamento completo
di prospettiva. Se nel fegato si poteva evitare completamente l'irraggiamento
indesiderato di organi adiacenti facendo ricorso all'espianto, nel caso del
polmone si preferisce non percorrere questa strada in quanto l'asportazione
dell'organo
implicherebbe
dei
pericoli
maggiori
per
il
paziente,
principalmente legati al collasso che l'organo subirebbe immediatamente
dopo l'estrazione dalla sede toracica. Per questo si preferisce effettuare
l'irraggiamento dall'esterno dell'intera regione toracica. E’ possibile
irraggiare il polmone con dei fasci di neutroni epitermici, che
nell'attraversare i primi strati dei tessuti biologici subiscono la
termalizzazione necessaria ad innescare le reazioni di cattura nella sede
tumorale, oltre a garantire un deposito di dose decisamente più blando dei
tessuti superficiali. Inoltre, la struttura spugnosa dell'organo e la bassa
densità (tre volte inferiore a quella del fegato), implicano una minima
attenuazione del campo neutronico, garantendo così degli ottimi livelli di
omogeneità delle grandezze di campo. In verità, per via del diametro medio
di un polmone umano, l’optimum di omogeneità viene raggiunto
prevedendo l'irraggiamento con due fasci contrapposti antero-posteriore e
postero-anteriore.
28
L'attività del gruppo di ricerca di Pavia, dopo aver studiato con simulazioni
Monte Carlo la distribuzione della dose in fantocci antropomorfi, ha
concentrato i suoi sforzi nell'elaborazione di un modello animale con cui
poter testare in vivo sia l'accumulo del drogante borato che l'irraggiamento
neutronico.
2.4 Il modello animale
Per ottenere campioni polmonari metastatici e tessuto polmonare normale
abbiamo utilizzato ratti BDIX con metastasi polmonari indotte da cellule di
colon adenocarcinoma [23].
Per indurre le metastasi negli animali è stata
usata la linea cellulare DHD/K12/TRb di colon carcinoma. La linea
cellulare è stata ottenuta da un colon adenocarcinoma indotto da 1,2
dimetilidrazina in ratti singenici BDIX, selezionata e clonata per la sua
capacità di indurre tumori progressivi e metastatici nell’ospite [24].
Le cellule possono essere mantenute a confluenza per molto tempo senza
apparenti cambiamenti nella biologia cellulare, compresa la tumorigenicità.
La linea cellulare cresce a confluenza cellule poligonali monostratificate in
fiaschette per tessuto di coltura in Ham's F10 medium con aggiunta di 10%
siero fetale di vitello. In una prima fase le metastasi erano indotte in ratti
29
BDIX (maschi, peso 250 g) con iniezione intrasplenica di 1.5 x 105 cellule
di colon-carcinoma in anestesia generale. Dopo l’iniezione veniva effettuata
la splenoctomia.
In questo modo l’intervallo di tempo tra l’iniezione
cellulare e la comparsa delle metastasi tumorali del polmone era troppo
lunga: 20-27 giorni. Inoltre in alcuni animali le metastasi intaccavano solo il
fegato mentre i polmoni rimanevano sani.
Fig.7.: Immagine del torace di un ratto 10 giorni dopo l’iniezione di cellule
D/K12/Trb .Lo spread metastatico è visibile su tutta la superficie polmonare e
in entrambi i polmoni.
Per ottenere un modello più efficiente è stata utilizzata una tecnica
chirurgica per indurre il tumore. Le cellule tumorali sono state iniettate via
vena cava inferiore, con la stessa dose di 1.5 x 105 cellule. Tutti i ratti
30
sottoposti a questo trattamento hanno dato risultati positivi: 10-12 giorni
dopo i polmoni presentavano delle visibili metastasi macroscopiche (Fig.7).
2.5 Misura della concentrazione di 10B nel polmone di ratto
Per la misura della concentrazione del boro è stato utilizzato il modello
animale descritto nel paragrafo precedente. La metodologia di induzione
delle metastasi polmonari ci ha permesso di somministrare il BPA dopo10
giorni dall’iniezione di cellule tumorali. La soluzione di BPA 0.14 M è stata
preparata combinando BPA (10B enriched, L-isomer) con un eccesso di
fruttosio 10% molare in acqua. Il pH è stato portato a 9.5-10 con NaOH, e
dopo pochi minuti il pH è stato riportato a7.4 con HCl [25]. Sono stati
studiati due metodi di infusione: intra-venosa e intra-peritoneale. Alcuni
ratti sono stati usati per testare l’efficacia di amministratione del metodo, ed
è stata scelta la via intra-peritoneale perché era più facile da realizzare e con
buoni risultati riguardanti i valori della concentrazione di boro.
Sono stati trattati
circa 50 ratti i cui risultati sono stati utilizzati per
costruire la curva della farmacocinetica del BPA e per studiare la
distribuzione spaziale del boro nel tessuto polmonare. I ratti sono stati
sacrificati a intervalli regolari dopo l’infusione della BPA; dopo il sacrificio
31
dei ratti gli organi sono stati congelati in azoto liquido e poi tagliati con un
criostato Leyca allo spessore di 10 μm e colorati con ematossilina ed eosina.
Le fettine di tessuto sono state organizzate in coppia o in triplette a seconda
del tipo di analisi. Le fettina sono state tagliate e messe in coppia per
l’imaging del boro, e ciascuna di queste consisteva in un primo campione
spesso 60 μm direttamente depositato su una pellicola sensibile per la
autoradiografia neutronica, e un secondo spesso 10 μm depositato su un
vetro per l’analisi morfologica utilizzando il metodo do colorazione
standard di ematossilina-eosina. Per l’analisi quantitativa una fettina spessa
60 μm è stata depositata su un dischetto di mylar per essere irraggiato nella
Colonna Termica del reattore, una seconda fettina è stata preparata per
l’analisi morfologica, e una terza fettina di nuovo spessa 60 μm è stata
depositata su una pellicola per la neutronigrafia.
Le tecniche perfezionate dal gruppo di Pavia riguardano l'imaging della
distribuzione del
10
B (autoradiografia neutronica) e la sua quantificazione
nei campioni di tessuto prelevati dal ratto (spettrometria α). La
neutronigrafia consente di ottenere immagini della biodistribuzione di 10B in
scala di grigi. L'immagine risulta dallo sviluppo in soluzione di NaOH di
una pellicola di nitrato di cellulosa (CN85, LR115) o di policarbonato
(CR39) che ha la proprietà di essere sensibile alle particelle ad alto LET ma
trasparente alla luce e ai raggi γ. Lo sviluppo mette in evidenza le tracce
32
lasciate dalle particelle α prodotte nella reazione di cattura sul 10B. Infatti,
per ottenere una neutronigrafia è necessario irraggiare con neutroni un
campione di tessuto previamente depositato sulla pellicola. La valenza della
neutronigrafia per la quantificazione delle concentrazioni di 10B nei tessuti è
doppia. Innanzitutto la radiografia mette in evidenza per semplice confronto
l'accumulo selettivo del boro da parte del tessuto tumorale. Come detto,
l'immagine radiografica si presenta come una scala di grigi, in cui le zone
più scure derivano da un flusso elevato della radiazione ad alto LET e sono
quindi in corrispondenza di regioni tissutali in cui l’accumulo del 10B è stato
considerevole. Confrontando la radiografia con il relativo esame istologico è
evidente la corrispondenza tra le zone scure della prima e quelle
riconosciute come cancerose della seconda.(Fig.8)
Fig 8: confronto tra l’esame istologico (sinistra) e l’autoradiografia neutronica
(destra) di due sezioni successive di tessuto polmonare (40 μm tra le due)
33
In secondo luogo, la neutronigrafia può essere impiegata per stimare
quantitativamente le concentrazioni di drogante riscontrate nei campioni. In
tal caso, i tempi di irraggiamento e sviluppo devono essere stabiliti in
funzione della qualità delle tracce indotte dalle particelle, che devono essere
ben separate per consentirne il conteggio. A questo punto, si stima la
concentrazione di boro acquisendo in modo digitale le immagini e
analizzandole con un opportuno software. Un ulteriore impiego della
neutronigrafia è quello di strumento ausiliario alle tecniche analitiche
propriamente quantitative, volte anche loro alla determinazione delle
concentrazioni di
10
B. Tutte queste tecniche soffrono del problema del
campione misto, ossia del fatto che un campione di tessuto malato non
presenta mai una composizione omogenea, ma necessariamente alterna
regioni di parenchima sano ad altre occupate dalle metastatasi. Inoltre, entro
la medesima regione tumorale l'istologia e la relativa funzionalità cambiano
profondamente, passando, ad esempio, da cellule proliferanti a nuclei di
necrosi. In questi casi, la concentrazione di 10B risultante dalle analisi è da
intendersi come un valore medio. Questa stima è spesso molto lontana dal
valore vero relativo tanto al parenchima sano quanto al tumore. Pertanto, per
separare i contributi dei due tipi tissutali si deve conoscere la frazione di
volume totale occupata dal tumore e dal tessuto sano. Per ottenere questi
pesi si analizza in modo digitale l'immagine istologica, aiutandosi con la
34
corrispondente neutronigrafia per meglio selezionare le aree interessate dal
tumore.
L'altra tecnica impiegata a Pavia per misurare i livelli di boro nei tessuti dei
campioni polmonari è la spettrometria α. In questo caso, si determinano le
concentrazioni a partire dallo spettro energetico delle particelle cariche
emesse nella reazione di cattura (n,α) sul
10
B. Si deve dunque irraggiare
una fettina di tessuto polmonare all'interno della colonna termica e
raccogliere le particelle cariche grazie ad un opportuno rivelatore posto di
fronte al campione (rivelatore a Si). La descrizione di questa tecnica non è
oggetto di questa tesi.
2.6 Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello animale
Lo studio di farmacocinetica, condotto a Pavia ha coinvolto ad oggi una
popolazione complessiva di 50 ratti, senza tener conto del gruppo di
controllo che non è stato sottoposto ad alcun tipo di trattamento e da cui si è
potuto studiare il background naturale di 10B dei tessuti. Da questi controlli
si è ottenuta una concentrazione di fondo inferiore a 0.5 ppm, compatibile
con l'analogo risultato ottenuto nella ricerca sul fegato. Questo primo studio
sul modello animale ha chiarito l'andamento temporale dei tassi di
10
B nei
tessuti sano e tumorale, oltre al rapporto relativo tra i due che rappresenta la
35
discriminante per la fattibilità della BNCT per il polmone. In particolare, le
misure di concentrazione sono state effettuate sacrificando gli animali dopo
1, 2, 4, 6 e 8 ore dall'infusione del BPA.(Fig.9)
Fig 9: concentrazioni di 10B nelle metastasi e nel tessuto polmonare sano e
relativo rapporto in funzione del tempo trascorso dalla somministrazione del
BPA.
Dal secondo grafico riportato in figura 9, si può osservare come il rapporto
R(t) = CT(t) / CH(t) sia massimo e pari circa a 4.5 dopo 4 ore dall'infusione
del drogante (CT(t): concentrazione di
concentrazione di
10
10
B nel tumore all'istante t, CH(t):
B nel parenchima sano all'istante t). Osserviamo in
conclusione che è in corso un ampliamento della statistica relativa a questi
valori, mediante il trattamento di altri ratti.
36
CAPITOLO 3
Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di
ratto
In questo capitolo viene descritta la parte sperimentale della tesi. Il lavoro è
consistito nella realizzazione di un test in vivo-vitro di efficacia del
trattamento BNCT del tumore metastatico polmonare usando cellule
DHD/K12/TRb trattate con BNCT e inoculate in ratti BDIX. I risultati di
questo lavoro saranno utili in seguito per testare meglio l’efficacia della
BNCT in questo tipo di trattamento costruendo una curva di sopravvivenza
di ratti BDIX; dopo l’ induzione delle metastasi polmonari i ratti sarebbero
sottoposti al trattamento BNCT completo (infusione di una soluzione di
BPA e irraggiamento presso il reattore Triga Mark II in modo da esporre la
zona toracica ad un flusso neutronico adeguato) e poi sarebbe costruita la
curva di sopravvivenza.
Cellule DHD/K12/TRb sono state incubate in medium contenente BPA e in
seguito irraggiate in vitro ad una prestabilita dose neutronica. Dopo
l’irraggiamento le cellule sono state inoculate in ratti BDIX per valutare la
loro capacità di indurre metastasi polmonari. Sono stati studiati tre gruppi di
37
ratti: un gruppo A a cui sono state inoculate cellule preventivamente
sottoposte a trattamento BNCT in vitro (irraggiamento neutronico di cellule
contenenti boro), un gruppo B in cui sono state inoculate cellule sottoposte
ad irraggiamento neutronico in vitro in assenza di boro; e un gruppo di
controllo C in cui sono state inoculate cellule non sottoposte ad alcun
trattamento. Dopo ogni irraggiamento una quota delle cellule è stata
utilizzata per valutarne la sopravvivenza attraverso il test di piastramento.
3.1 Trattamento BNCT in vitro
La linea cellulare utilizzata, come già specificato, è la DHD/K12/TRb
selezionata e clonata per la sua capacità di indurre tumori progressivi e
metastatici in animali singenici [26]. Le cellule sono state fatte crescere in
mezzo di coltura HAM F10 (50:50 v/v) arricchito con il 10% di siero fetale
di vitello (FBS), una piccola quantità di glucosio DMEM e l’1% di
gentamicina come protezione batterica. Per sottooporre le cellule a
trtattamento BNCT queste sono state incubate per 4 ore in un mezzo di
coltura con aggiunta di BPA (10B al 95%)
ad una concentrazione
di
80μg/ml; prima dell’irraggiamento neutronico sono state sciacquate in PBS
per rimuovere ogni traccia di BPA non assorbito. La solubilizzazione della
BPA avviene in fruttosio 6M (2ml); il pH viene portato al valore di 7.5
aggiungendo NaOH ed eventualmente HCL. Le cellule vengono poi
sottoposte ad irraggiamento con neutroni termici nel reattore TRIGA Mark
38
II dell’Università di Pavia alla potenza di 250 KW per 10 minuti. Il flusso
neutronico termico nella posizione di irraggiamento era di 1 . 1010 cm-2 s-1.
Le cellule irradiate senza arricchimento di Boro sono state prese come
controllo.
3.1.1 Efficienza di piastramento
Una cellula che sopravvive ad un trattamento con radiazione è quella che
mantiene una capacità proliferativa illimitata, mentre quella che fallisce i
propri tentativi di proliferazione è ritenuta annientata, nonostante essa possa
dividersi o possa rimanere intatta nella popolazione cellulare. Il bilancio
della sopravvivenza delle cellule dopo l’irraggiamento viene fatto
verificando la loro capacità di produrre un largo numero di progenie, cioè di
produrre una colonia. Una delle più comuni procedure per testare la
sopravvivenza cellulare è il saggio di piastramento in vitro.
Le cellule vengono incubate in un medium appropriato a 37°C.
L’attaccamento delle cellule sulla superficie delle piastre tessutali e quelle
che mantengono la capacità proliferativa crescono formando discrete
colonie di cellule. Dopo un certo numero di giorni di incubazione, che
dipendono dal tasso di crescita della cellula, i piatti sono prelevati
dall’incubatore e le colonie sono fissate e colorate in modo da essere
facilmente contate. (fig. 10).
39
Fig.10. Test di efficienza di piastramento. Capsule Petri seminate con 100
cellule della linea di colon carcinoma DHD/K12/TRb, fissate e colorate con blu
di Toluidina dopo 8 giorni di coltura. Esempi di cellule di controllo (n=68, A) e
di cellule trattate con boro e irraggiate con neutroni, le quali hanno ricevuto
una dose di 0.5 Gy (n=30, B) e che hanno quindi una sopravvivenza di 30/68 =
44%.
Le cellule che non mantengono la capacità proliferativa in seguito
all’irradiazione possono ancora dividersi poche volte, ma formano solo delle
minuscole colonie “abortive”. Se una colonia contiene più di 50 cellule
(cioè deriva da una singola cellula da almeno sei cicli di divisione) è di
solito in grado di avere una crescita continua e si può ritenere che derivi da
una cellula sopravvissuta. L’efficienza di piastramento (PE) di una
popolazione cellulare è calcolata dividendo il numero delle colonie formate
per il numero delle cellule piastrate. Con questa tecnica può essere costruita
una curva della sopravvivenza cellulare in funzione della dose assorbita in
40
seguito agli irraggiamenti; si può così studiare l’efficacia della BNCT su
questo tipo di cellule [27].
3.1.2 Sopravvivenza delle cellule post irraggiate
Le cellule dopo essere state incubate per 4 ore in terreno di coltura arricchito
con 80 ppm di 10B sono state irraggiate in un campo di neutroni termici per
10 minuti a 250 kW; la dose di radiazioni assorbita dalle cellule è di 34Gy.
Le cellule irraggiate e quelle non irraggiate, utilizzate come controllo, con e
senza arricchimento di Boro, sono state piastrate in 5 Petri ripetute per
ciascuna concentrazione selezionata con vaschette con un range che va da 1
x 106 a 5 x 106 cellule irraggiate con l’arricchimento di Boro e da 50 a 250
in tutte le altre rimanenti condizioni studiate. Abbiamo ottenuto un PE di
0.05± 0.01% (SD) di cellule arricchite con boro e irraggiate, contro il PE di
94.4 ± 1% di cellule arricchite con il boro e non irraggiate, e un PE di 3 ±
0,5% per cellule irraggiate ma senza boro.
3.3 Studi in vivo
Una parte delle cellule irraggiate come descritto nel paragrafo precedente è
stata usata per verificare la loro capacità di proliferazione una volta
41
inoculate nel ratto attraverso la vena cava inferiore. Una popolazione di 30
ratti è stata suddivisa in 3 gruppi da 10; al primo gruppo (A) sono state
inoculate 1.5 milioni di cellule DHD/K12/TRb dopo essere state trattate in
terreno di coltura con BPA ed esposte ai neutroni come detto sopra; al
secondo gruppo (B) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule sottoposto
allo stesso irraggiamento delle precedenti ma senza esposizione al
10
B; al
terzo gruppo (C) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule che però non
avevano subito alcun trattamento (controllo). Ad intervalli di 1 mese
dall'inoculo delle cellule, un animale per ogni gruppo veniva sacrificato; gli
animali che morivano prima della data prefissata venivano sottoposti ad
autopsia e il polmone era analizzato come negli altri casi.
Una volta sacrificato l’animale, il polmone veniva prelevato e conservato in
formalina al 10%. Dopo fissazione in paraffina dai campioni di polmone
venivano ricavate fettine di tessuto depositate su vetrino, trattate con eosinaematossilina e analizzate al microscopio ottico. La metodica di colorazione
“ematossilina-eosina” prevedeva:
1) 15 minuti in Ematossilina
2) 20 minuti in acqua di fonte corrente
3) passaggio in acqua distillata
4) 40 secondi in Eosina
42
5) Successiva scala alcolica per 2-3 minuti in ogni alcool a partire da
alcool 70°, alcool 80° alcool 95°, assoluto, assoluto/xilolo ed infine
xilolo.
Per l’osservazione al microscopio ottico i preparati venivano montati con
“Entellan”.
Un’ altra popolazione di 30 ratti suddivisa con le stesse modalità di prima in
tre gruppi A, B e C (10 animali in ogni gruppo) è stata sottoposta a follow
up per determinare la loro sopravvivenza. Tutte le procedure chirurgiche
sono state portate a termine in anestesia generale in condizioni asettiche
secondo il Commettee Sperimentale ed Etico degli Animali dell’Università
di Pavia.
I dati di sopravvivenza dei 3 gruppi sono stati riportati nel grafico di
Kaplan-Meier (Fig.11).
43
Fig.11. Il grafico di Kaplan-Meier rappresenta la sopravvivenza dei ratti nei
tre gruppi analizzati. Al 4 mese di follow up la sopravvivenza del gruppo A
(n=10) era del 90%, paragonata allo 0% del gruppo C ( n=10) (p<0.001).
Dal grafico si osserva che tutti gli animali in gruppo C sono morti entro un
mese; mentre oltre il’90% dei ratti in gruppo A, ossia quelli inoculati con
cellule trattate con BNCT, a di 4 mesi erano ancora vivi. L’efficacia del
trattamento BNCT risulta evidente anche quando si confronta la percentuale
di sopravvivenza di questo gruppo con quella del gruppo B dei ratti
irraggiati con neutroni ma in assenza di B.
44
3.4 Caratterizzazione istologica della malattia polmonare metastatica in
funzione del tempo
Per valutare la presenza del tumore metastatico e la sua evoluzione a livello
tessutale il polmone è stato espiantato e sottoposto ad esame istologico. I
polmoni dei ratti del gruppo A (inoculati con cellule sottoposte a trattamento
BNCT) sacrificati dopo un mese dal trattamento. A livello macroscopico
(fig.12a) si osservano polmoni integri di colore rosa come da tessuto sano; il
polmone presenta una struttura anatomica di dimensioni normali e ben
identificabile. Si nota, dall’istologia, un ispessimento del parenchima dato
anche dall’invasione di cellule infiammatorie, risultato che indica una forte
reazione immunitaria, con parecchie aree di enfisema e atelettasia. Inoltre, è
stata constatata l’assenza del tumore (fig. 12b).
45
Fig 12 (a.b) immagini rappresentative dopo un mese dal trattamento di ratti
che erano satati inoculati con cellule trattate in vitro con la BNCT(gruppo A),
le quali mostrano l’assenza di metastasi e la corrispondente istologia mostra
cambiamenti nel tessuto quali atelettasia ed enfisema. Fig 1 (c,d) immagini
rappresentative dopo un mese dal trattamento di ratti (Gruppo C) che erano
satati inoculati con cellule non trattate, la cui istologia mostra la presenza di
palle metastatiche. (istologia mag. x10)
Tutti i campioni osservati non presentano cellule neoplastiche organizzate
sotto forma di ammassi rotondeggianti. Si osservano invece nella maggior
parte dei camiponi ampie aree di tessuto enfisematoso dovuto alla
dilatazione degli alveoli polmonari con atrofia e scomparsa dei setti
alveolari. Rispetto al tessuto polmonare normale si osservano grossi spazi
otticamente vuoti delimitati da setti alveolari marcatamente distesi. Si
46
osservano inoltre ampie aree di tessuto ispessito con infiltrato di cellule del
sistema infiammatorio. Tale osservazione è da considerarsi un quadro tipico
di atelettasia, che consiste in diminuzione del contenuto aereo del polmone
con collasso degli alveoli. Le pareti degli alveoli si avvicinano l’una all’altra
così da dare l’impressione che il tessuto polmonare sia più ricco di cellule
del solito. I capillari sono in genere dilatati.
Le fig.12c) e (d) si riferiscono a ratti inoculati con cellule non sottoposte a
trattamento BNCT (gruppo C). Tutti questi ratti sono morti entro un mese.
Come si vede nella fig.12c), a livello polmonare, si osservano
macroscopicamente numerose aree di colore biancastro e di piccole
dimensioni ampiamente diffuse su tutto il parenchima polmonare. Tali
polmoni presentano un aumento di volume e un colore rossastro che indica
iperemia. All’esame istologico (fig. 12d) si osservano due ampie aree
neoplastiche di forma rotondeggiante localizzate nel parenchima polmonare.
Tutti gli animali che avevano avuto questo trattamento presentavano
all’esame istologico lo stesso quadro: presenza di numerose cellule
neoplastiche infiltranti il parenchima polmonare, per lo più ammassate sotto
forma di aree rotondeggianti capsulate. Il restante parenchima polmonare
presentava quadri di enfisema o aree con alveoli normali.
47
Sono stati inoltre analizzati e presi in esame i polmoni degli animali del
gruppo B; in questo caso le cellule erano state semplicemente irraggiate con
neutroni senza aver subito l’esposizione alla BPA; in pratica queste cellule
non erano state trattate con BNCT. Sono stati analizzati ratti sacrificati a 1 e
a 4 mesi dall’inoculo delle cellule. L’istologia dei ratti del gruppo B
sacrificati dopo 1 mese presenta aree più o meno compromesse da
ispessimenti a livello alveolare e da atelettasia, ma non sono state
identificate cellule tumorali che si organizzino sotto forma di aree
rotondeggianti. Nei ratti dello stesso gruppo B, sacrificati dopo 4 mesi
dall’inoculo, all’esame istologico si notava una sostituzione totale del
parenchima polmonare con cellule neoplastiche invadenti gli alveoli; si
osserva la presenza di tessuto collagene avvolgente le aree neolplastiche di
forma rotondeggiante che si formano in diversi punti del parenchima; le
strutture di aree neoplastiche in alcuni punti sono ben localizzate sotto
forma di noduli sferiformi. E’ stato dedotto che in questo gruppo di ratti lo
attecchmentoi neoplastico avviene dopo almeno 2 mesi dall’inoculo; ossia il
semplice irraggiamento neutronico delle cellule in assenza di boro ha
l’effetto di ritardare l’attecchimento del tumore.
48
CAPITOLO 4
Conclusioni e sviluppi futuri
In questa tesi sono stati riportati i risultati di esperimenti che preludono ad
un test di efficacia della BNCT in vivo in un modello animale di metastasi
polmonari, come esempio di tumore polmonare diffuso.
Gli studi in vitro hanno messo chiaramente in evidenza come la BNCT porti
ad una inibizione significativa della sopravvivenza delle cellule tumorali
della linea DHD/K12/TRb del carcinoma del colon nell’animale.
Le cellule tumorali trattate in vitro con la BNCT vedono significativamente
ridotta la capacità di indurre metastasi nel modello animale di ratto.
Nel caso delle cellule irraggiate solo con i neutroni e in assenza di boro
supponiamo che il danno prodotto a livello di DNA risulti parziale e quindi
suscettibile di riparazione da parte di alcune cellule. Il numero ridotto di
cellule sopravvissute produce una tardiva comparsa delle metastasi; perciò
49
l’irraggiamento con soli neutroni da un punto di vista terapeutico non
presenta un reale vantaggio
Nonostante i risultati presentati siano preliminari, possono essere fatte due
osservazioni in questa fase iniziale dello studio:
a) un numero insignificante ma non trascurabile di cellule tumorali
sono resistenti alla BNCT sotto ideali condizioni di irraggiamento ad
una dose neutronica predefinita di rilevanza clinica; queste cellule
sono in grado di mantenere la loro capacità di indurre una patologia
metastatica al polmone in un modello animale, come è evidente in
un animale del gruppo A che ha sviluppato metastasi;
b) è stata osservata una struttura polmonare caratterizzata da atelettasia
ed enfisema in animali inoculati con cellule irraggiate, anche in
assenza di esposizione da radiazione diretta dell’animale; questo
suggerisce che i debris cellulari e quindi i prodotti dell’apoptosi
associata introducono nell’interstzio vascolare polmonare una
risposta infiammatoria e dei processi di guarigione con il risultato
finale di un danno strutturale al tessuto polmonare normale,
indipendente dall’irraggiamento. Questo scenario clinico può essere
riprodotto in pazienti sottopposti alla terapia con BNCT dove la
morte di cellule tumorali all’interno delle metastasi polmonari
diffuse, in mancanza di una pulizia del tessuto devitalizzato, può
50
provocare simili reazioni infiammatorie acute aggravando perciò una
già anticipata polmonite.
In un prossimo futuro si spera di ottenere informazioni più complete
attraverso un test in vivo nello stesso modello animale usato in questo
lavoro di tesi. Dopo aver indotto le metastasi polmonari in un gruppo di
ratti, si pensa di sottoporre questi ratti ad irraggiamento neutronico dopo la
perfusione di BPA-Fruttosio E’ già stato realizzato un sistema che
permetterà di irraggiare i ratti nella colonna termica del reattore in modo da
esporre al flusso neutronico solo la zona toracica e proteggendo il resto del
corpo dell’animale. Si spera di ottenere utili informazioni sulla possibilità di
applicare la BNCT al trattamento dei tumori polmonari diffusi attraverso lo
studio della sopravvivenza della popolazione di ratti trattati e attraverso
l’analisi degli effetti indotti nell’animale dal trattamento.
51
BIBLIOGRAFIA
[1]
J.A.Coderre,
J.C.Turcotte,
K.J.Riley,
P.J.Binns,
O.K.Harling,
W.S.Kiger, Boron Neutron Capture Therapy: Cellular Targeting of High
Linear Energy Transfer Radiation, Technology of Cancer Research &
Treatment ISSN 1533-0346, vol 2, nr 5 (2003)
[2] R.F.Barth, J.A.Coderre, M.Graca H.Vicente and T.E.Blue, Boron
Neutron Capture Therapy of Cancer: Current Status and Future Prospects,
Clin. Cancer Res. 11(11), 3987-4002 (2005)
[3] S. Bortolussi, S. Altieri, P.Bruschi, F. Fossati, A Facoetti, R. Nano, A.
Clerici, C. Ferrari, A. Zonta, C. Zonta, A. Marchetti, E. Solcia, G. J.
Bakeine, O. Salvucci Boron Uptake Measurements in Rat Lung Tumours in
Y. Nakagawa, T. Kobyashi, H. Fukuda (Editors), Advances in Neutron
Capture Therapy (Takamatsu, Japan 2006) pp 91-94.
[4] S. Bortolussi. Boron Neutron Capture Therapy of disseminated tumours.
Scientifica Acta. 2007;1: 123-128.
52
[5] S.Altieri, S.Bortolussi, P.Bruschi, P.Chiari, F.Fossati, A.Facoetti,
R.Nano, A.Clerici, C.Ferrari, A.Zonta, C.Zonta, A.Marchetti, E.Solcia,
J.J.Bakeine,O.Salvucci, “Boron Uptake Measurements in metastatic
Tumours in RatLung", in Y.Nakagawa,T.Kobayashi, H.Fukuda, eds.
Advances in NeutronCapture Therapy. pp 91-94, Takamatsu, Japan (2006)
[6] S.Altieri,S.Bortolussi, P.Bruschi, P.Chiari, F.Fossati, A.Facoetti,
R.Nano,A.Clerici, C.Ferrari, A.Zonta, C.Zonta, A.Marchetti, E.Solcia,
J.J.Bakeine,O.Salvucci, Monte Carlo Dose Calculations for BNCT
treatment of Diffuse Human Lung Tumours, in Y.Nakagawa,T.Kobayashi,
H.Fukuda, eds. Advances in Neutron Capture Therapy. pp 91-94,
Takamatsu, Japan (2006)
[7] V.A Trivillin, E.M Heber, M.E Itoiz, O.Calzetta, H.Blaumann ,
J.Longhino, A.Schwint, Therapeutic success of Boron neutron Capture
Therapy (BNCT) mediated by a chemically non- selective boron agent in an
experimental model of oral cancer: a new paradigm in BNCT radiobiology,
Rad .Res. 166, 387-396, 2006
[8] C-W. Lu, Y.Hung, Bifunctional magnetic silica nanoparticles for highly
efficient human stem cell labeling, Nano Letters, 7, 149-154, 2007
53
[9] Q.Wei, E.B. Kullberg, L.Gedda, Trastuzumab-coniugated boroncontaining liposomes for tumor-cell targeting: development and cellular
studies, Int. J. Onc. 23, 1159-1165, 2003
[10] A.Zonta,U.Prati, L.Roveda, C.Ferrari, S.Zonta, AM Clerici, C.Zonta,
T.Pinelli, F.Fossati, S. Altieri, S. Bortolussi, P.Bruschi, R. Nano, S.Barni,
P.Chiari and G.Mazzini, Clinical lessons from the first applications of
BNCT on unresectable liver metastases, Journal of Physics, Confer Series
41 (2006) 484-495
[11] T.Pinelli, S.Altieri, P Bruschi, F.Fossati,A.Zonta, C.Ferrari, U.Prati,
L.Roveda, S.Barni, P.Chiari, R.Nano, TAORMINA: La ricerca, le
Applicazioni Precliniche e l’inizio del Trattamento del Fegato Umano, in
FNT/T 2002/07
[12] A.Zonta,U.Prati, L.Roveda, C.Ferrari, P. Valsecchi, F. Trotta,
A.DeRoberto, C.Rossella, G.Bernardi, C.Zonta, P.Marchesi, T.Pinelli,
S.Altieri, P.Bruschi, F.Fossati, S.Barni, P.Chiari, R.Nano, La terapia per
cattura neutronica (BNCT) dei tumori epatici, in Boll Soc Med Chir Pavia
2000; 114: 123-144, Comunicazione all’adunanza del 19 ott 2000
54
[13] Pinelli T, Altieri S, Fossati F, Zonta A, Cossard D, Prati U, Roveda L,
Ricevuti G and Nano R 1996 Development of a method to use boron
neutron capture therapy for diffused tumors of liver (Taormina project)
Neutron Capture Therapy for Cancer: Proc. 6thInternational Symposium
(Kobe, Japan, 31 Oct-4 Nov 1994) ed Y Mishima (New York:Plenum) pp
783-94
[14] Gray J W, Dolbeare F and Pallavicini M G 1990 Quantitative cell-cycle
analysis Flow cytometry and sorting ed M R Melamed et al (New York:
Wiley-Liss) chapter 23 pp 445-67
[15] Hill P R 1992 Cellular basis of radiotherapy The basic science of
oncology ed I F Tannock and R P Hill (New York: McGraw-Hill) chapter
15 pp 259-75
[16] Nano R, Barni S, Chiari P, Pinelli T, Fossati F, Altieri S, Zonta C, Prati
U, Roveda L and Zonta A 2004 Efficacy of boron neutron capture therapy
on liver metastases of colonadenocarcinoma. Optical and ultrastructural
study in the rat Oncology Reports 11 149-53
494
[17] Roveda L, Prati U, Bakeine J, Trotta F, Marotta P, Valsecchi P, Zonta
A, Nano R, Facoetti A, Chiari P, Barni S, Pinelli T, Altieri S, Braghieri A,
55
Bruschi P, Fossati F and Pedroni P 2004 How to study boron distribution in
liver metastases from colorectal cancer J. Chemoth. 16 (Suppl. 5) 15-8
[18] Pinelli T, Zonta A, Altieri S, Barni S, Braghieri A, Pedroni P, Bruschi
P, Chiari P, Ferrari C, Fossati F, Nano R, Ngnitejeu Tata S, Prati U,
Ricevuti G, Roveda L and Zonta C 2002 Taormina: from the first idea to the
application to the human liver Research and development in Neutron
Capture Therapy: Proc. 10thInternational Congress on Neutron Capture
Therapy (Essen, Germany, 8-13 Sept 2002) ed W. Sauerwein et al
(Bologna:Monduzzi) pp 1065-72
[19] Jaffe BM, Donegan WL, Watson F and Spratt JS Jr 1968 Factors
influencing survival in
patients with untreated hepatic metastases Surg. Gynecol. Obstet. 127 1-11
[20] Bengmark S and Hafström L 1969 The natural history of primary and
secondary malignant tumors of the liver I. The prognosis for patients with
hepatic metastases from colonic and rectal carcinoma by laparotomy
Cancer 23 198-202
[21] http://info.cancerresearchuk.org
56
[22] J Ferlay, P.Autier, M.Boniol, M.Heanue, M.Colombet, P.Boyle,
Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2006, Ann Oncol,
18(3) 581-592 (2007), Epub 7, 2007
[23] Ian F. Tannock, Richard P. Hill, The Basic Science of Oncology,
Second Ed, McGrowHill, 1992
[24] T.Pinelli, S.Altieri, F.Fossati, A.Zonta, C.Ferrari, U.Prati, L.Roveda,
S.Ngnitejeu Tata, S.Barni, D.M Ferguson, Operative modalities and Effects
of BNCT on liver metastases from colon adenocarcinoma, in:
M.F.Hawthorne,K.Shelly, R.J.Wiersema, eds. Frontiers in Neutron Capture
Therapy. New York:Kluwer Academic, Plenum Publishers, 1427-40 (2001)
[25] Caignard A.Martins M.S. et al:Interaction between two cellular
bubpopulation of rat colon carcinoma when inoculated to the singenic
host.Int J Cancer, 36 :273-279, 1985
[26] J.A.Coderre, E.E.Elowitz, M.Chadha, R.Bergland, J.Capala, D.D.Joel,
H.B.Liu, D.N.Slatkin and D.A. Chanana, Boron neutron capture therapy of
glioblastoma multiforme using the p-borophenylalanine-fructose complex
and epithermal neutrons: tryal design and early clinical results, J. NeuroOncol. 33, 141-152 (1997)
57
[27] http://www-dep.iarc.fr
[28] C. Ferrari, A.M. Clerici, C. Zonta, L. Cansolino, A. Boninella, S. Altieri, F.
Ballarini, Bortolussi S., P. Bruschi, S. Stella, J. Bakeine, P. Dionigi, A. Zonta;
2008; Boron Neutron Capture Therapy of Liver and Lung Coloncarcinoma
Metastases: an in vitro Survival Study; Rivista: A new option against cancer. 13th
International Congress on Neutron Capture Therapy Firenze, 2-7 Novembre 2008,
Roma: ENEA, p. 331-336
[15] Chiaraviglio D, De Grazia F, Zonta A, Altieri S, Braghieri A, Fossati F,
Pedroni P, Pinelli T, Perotti A, Specchiarello M, Perlini G and Rief H 1989,
Evaluation of selective boronabsorption in liver tumors, Strahlenther Onkol.
165 170-2
[17] Pinelli T, Altieri S, Fossati F, Zonta A, Ferrari C, Prati U, Roveda L,
Ngnitejeu Tata S, Barni S, Chiari P, Nano R and Ferguson DM 2001
Operative modalities and effects of bnct on liver metastases of colon
adenocarcinoma. A microscopical and ultrastructural study in the rat
Frontiers in Neutron Capture Therapy: Proc. 8thInternational Symposium
(Los Angeles, Ca, USA, 13-18 Sept 1998) ed MF Hawthorne et al (New
York: Kluwer Academic/Plenum Publishers) pp 1427-40
58
[20] Nano R, Barni S, Gerzeli G, Pinelli T, Altieri S, Fossati F, Prati U,
Roveda L and Zonta A 1997 Histiocytic activation following neutron
irradiation of boron-enriched rat liver metastases Ann. NY Acad. Sci 832
274-8
[33] S. Altieri, S. Bortolussi, P Brushi, F. Fossati, K. Vittor, R. Nano, A.
Facoetti, P. Chiari, J. Bakeine, A. Clerici, C. Ferrari, O. Salvucci. Boron
absorption imaging in rat lung metastases from colon adenocarcinoma. J.
Phys.: Conf Ser. 2006; 41:123-126.
[34] J.L. Kiger, W.S. Kiger, III, H. Pateal, P.J. Binns, K.J. Riley, J.W.
Hopewell, O.K Harling and J.A Coderre. Effects of boron neutron capture
therapy on the normal lungs of rats. J. Applied radiation and isotopes. 2004;
61: 969-973.
[35] G.J. Bakeinea*, M. Di Salvob, S. Bortolussib,c, S. Stellab,c, P. Bruschib,
A. Bertolottid, R. Nanod, A Clericie, C. Ferrarie, C. Zontae, A. Marchettif,
Saverio Altierib,c “Feasibility study on the utilization of Boron Neutron
Capture Therapy (BNCT) in a rat model of diffuse lung metastases”,
accepted by Appl Radiat Isot
59