INDICE
Saggi Biologici ..................................................................................................................................... 4
Funghi fitopatogeni .......................................................................................................................... 4
Isolamento di funghi fitopatogeni. ............................................................................................... 4
Purificazione delle colture di funghi e di oomiceti ...................................................................... 5
Identificazione e caratterizzazione di funghi ed oomiceti. .......................................................... 6
Caratterizzazione morfologica ..................................................................................................... 6
o Induzione della formazione di sporodochi di Fusarium. ..................................................... 7
o Induzione della sporificazione di Pyrenochaeta .................................................................. 7
o Induzione della produzione di sporangi di Phytophthora .................................................... 7
o Semi di peperone .................................................................................................................. 7
o Filtrato di terreno non sterilizzato ........................................................................................ 7
Caratterizzazione intraspecifica ................................................................................................... 8
Caratterizzazione molecolare ....................................................................................................... 8
Conservazione dei funghi e degli oomiceti .................................................................................. 9
Tubi con terreno agarizzato solidificato (a becco di flauto) ........................................................ 9
Olio minerale................................................................................................................................ 9
Acqua ........................................................................................................................................... 9
Silica-gel .................................................................................................................................... 10
Liofilizzazione ........................................................................................................................... 10
Azoto liquido.............................................................................................................................. 10
Essiccazione su carta da filtro .................................................................................................... 11
Batteri fitopatogeni ........................................................................................................................ 11
Isolamento di batteri fitopatogeni. ............................................................................................. 11
Purificazione e preparazione delle colture di batteri .................................................................. 12
Identificazione e caratterizzazione di batteri ............................................................................. 13
Caratterizzazione morfologica ................................................................................................... 13
Caratterizzazione biochimica e nutrizionale .............................................................................. 13
Caratterizzazione fisiologica ...................................................................................................... 13
Caratterizzazione sierologica ..................................................................................................... 13
Caratterizzazione molecolare ..................................................................................................... 14
Conservazione dei batteri ai fini diagnostici .............................................................................. 15
Terreno nutritivo ................................................................................................................ 15
Acqua ................................................................................................................................. 15
Conservazione a -80 °C ..................................................................................................... 15
Essiccazione su carta da filtro ............................................................................................ 16
Liofilizzazione ................................................................................................................... 16
Virus e viroidi fitopatogeni ............................................................................................................ 16
Isolamento di virus e viroidi e prove di patogenicità ................................................................. 16
Purificazione di virus e viroidi ................................................................................................... 17
Purificazione dei virioni ............................................................................................................. 17
Estrazione della doppia elica di RNA (dsRNA) ........................................................................ 18
Identificazione e caratterizzazione di virus e viroidi ................................................................. 18
Saggio sierologico. ..................................................................................................................... 19
ELISA diretta (DAS-ELISA) ..................................................................................................... 19
ELISA indiretta (TAS-ELISA) .................................................................................................. 19
Saggi molecolari ........................................................................................................................ 20
Ibridazione molecolare ....................................................................................................... 20
Amplificazione genica ....................................................................................................... 20
Conservazione di virus e viroidi ................................................................................................ 21
Microrganismi del Suolo ................................................................................................................ 22
ISOLAMENTO .......................................................................................................................... 22
Isolamento di funghi e batteri .................................................................................................... 24
Isolamento delle comunità dei batteri azotofissatori aerobi....................................................... 25
1. Metodo di coltura diretta da suolo (indicato per Azotobacter) .......................................... 25
2. Isolamento su substrati solidi o semisolidi ........................................................................ 25
Isolamento delle comunità dei rizobi ......................................................................................... 25
Le comunità fungine colturabili del suolo ................................................................................. 26
I funghi endofiti ......................................................................................................................... 26
RICONOSCIMENTO DEI MICRORGANISMI COLTIVABILI ............................................ 27
Riconoscimento dei funghi ........................................................................................................ 27
Riconoscimento dei rizobi ......................................................................................................... 27
CONSERVAZIONE .................................................................................................................. 28
Funghi tellurici ........................................................................................................................... 28
Batteri azotofissatori liberi ......................................................................................................... 29
Rizobi ......................................................................................................................................... 29
MICRORGANISMI NON COLTIVABILI: ISOLAMENTO E CONSERVAZIONE ............. 29
Conservazione del genoma del suolo ......................................................................................... 30
Microscopia ........................................................................................................................................ 30
Microscopio ottico ............................................................................................................................. 31
Microscopi ottici e affini ............................................................................................................ 32
Monoculari e Binoculari ............................................................................................................ 32
Microscopio semplice a luce trasmessa ..................................................................................... 33
Microscopio semplice a luce riflessa ......................................................................................... 33
Microscopio composto a luce trasmessa .................................................................................... 33
Microscopio composto a luce riflessa ........................................................................................ 34
Stereomicroscopio ...................................................................................................................... 34
Microscopio polarizzatore.......................................................................................................... 36
Microscopio a contrasto di fase ................................................................................................. 36
Microscopio ad interferenza....................................................................................................... 37
Ultramicroscopio ........................................................................................................................ 37
Microscopio a fluorescenza ....................................................................................................... 37
Microscopio confocale ............................................................................................................... 38
Microscopio nell'ultravioletto .................................................................................................... 39
Uso del microscopio ottico ........................................................................................................ 39
Regole per l’uso del microscopio............................................................................................... 40
Osservazioni al microscopio elettronico ........................................................................................ 40
Microscopio Elettronico a Trasmissione ( M.E.T.) ................................................................... 40
Microscopio elettronico a scansione (S.E.M.) ........................................................................... 42
Funzionamento ........................................................................................................................... 42
Il microscopio ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope) ....................................... 44
Allestimento di preparati biologi per l’osservazione al microscopio elettronico ...................... 47
Preparazione dei campioni ......................................................................................................... 47
Preparazione campione per l’osservazione al SEM ................................................................... 48
Fissazione ................................................................................................................................... 48
Disidratazione ............................................................................................................................ 48
Montaggio .................................................................................................................................. 49
Metallizzazione .......................................................................................................................... 50
Applicazioni della microscopia elettronica ................................................................................ 51
Limiti .......................................................................................................................................... 51
Saggi sierologici ................................................................................................................................. 51
2
ELISA ............................................................................................................................................ 51
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima) ...... 51
Metodo diretto ............................................................................................................................ 52
Metodo indiretto ......................................................................................................................... 53
Innovazioni................................................................................................................................. 53
Saggi molecolari ................................................................................................................................ 54
Northern Blot ................................................................................................................................. 54
Fasi del protocollo ...................................................................................................................... 54
Denaturazione ............................................................................................................................ 54
Elettroforesi ................................................................................................................................ 54
Trasferimento su membrana....................................................................................................... 55
Ibridizzazione ............................................................................................................................. 55
Visualizzazione .......................................................................................................................... 55
Southern Blot ................................................................................................................................. 55
Procedura ................................................................................................................................... 55
Microarray...................................................................................................................................... 56
Produzione ................................................................................................................................. 57
Array per fotolitografia .............................................................................................................. 57
Spotted microarrays ................................................................................................................... 58
Microarray di oligonucleotidi .................................................................................................... 59
Microarray di genotipi ............................................................................................................... 59
Frequenza degli SNPs ................................................................................................................ 60
Potenzialità degli SNPs .............................................................................................................. 60
Individuazione degli SNPs ......................................................................................................... 60
Microarray e bioinformatica ...................................................................................................... 61
Analisi statistica ......................................................................................................................... 61
Relazione tra gene e probe ......................................................................................................... 61
Protein microarray...................................................................................................................... 61
Lista di aziende che operano nel campo dei microarray ............................................................ 61
3
Saggi Biologici
I principali protocolli di analisi per l’identificazione dei principali agenti patogeni animati (che
hanno, tra l’altro, la capacità di moltiplicarsi o riprodursi) delle piante da orto sono:
Isolamento.
Identificazione, caratterizzazione e conservazione di funghi, batteri, virus e viroidi fitopatogeni.
Inoculazioni meccaniche su piante erbacee indicatrici.
Gli agenti patogeni ch si prenderanno in considerazione sono:
i funghi fitopatogeni con alcuni particolari riferimenti agli Oomycetes;
i batteri fitopatogeni;
i virus e viroidi,
Funghi fitopatogeni
Isolamento di funghi fitopatogeni.
L’isolamento avviene attraverso metodi di laboratorio che differiscono in relazione alla matrice di
origine. In particolare:
Isolamento da ospite vegetale: se il fungo sporula sul tessuto ospite, si può ottenere una coltura
pura prelevando i conidi, le spore o altri propaguli dal tessuto e trasferendoli su un idoneo
substrato di crescita agarizzato. Se non sono visibili fruttificazioni sull’ospite, il campione viene
lavato sotto acqua corrente, disinfettato con NaClO o H2O2 o con altri disinfettanti e lasciato
asciugare sotto cappa.
Tabella 1 - Principali terreni agarizzati (per 1 L di H2O
distillata) impiegati per l’isolamento e la
crescita di funghi fitopatogeni.
Tabella 2 – Principali substrati selettivi
per il genere Phytophthora.
I terreni di coltura per Phytophthora
vanno conservati al buio, in frigorifero
ed utilizzati possibilmente entro 7 giorni.
Bisogna ricordare che la pimaricina è
fotolabile, risente delle alte temperature
e perde buona parte della sua efficacia
dopo 7 giorni.
4
Una volta asciutto, al margine della zona lesionata vengono prelevate piccole porzioni di tessuto
che sono poi poste su idoneo substrato di crescita (tabella 1), al quale possono essere aggiunti
antibiotici, come ad esempio penicillina o ampicillina (100 mg/L), per sfavorire la crescita di
eventuali contaminanti batterici.
In alternativa, i frammenti prelevati vengono blandamente sterilizzati con una soluzione di
ipoclorito di sodio all’1% per 1 minuto, quindi risciacquati con acqua distillata sterile. Una volta
asciutti, vengono posti su substrato agarizzato in piastre. La disinfezione superficiale dei
frammenti di tessuto ospite può anche essere eseguita per flambage, passando velocemente sulla
fiamma frammenti di tessuto corticale/legnoso prelevati al margine di lesioni prodotte su organi
delle piante.
Isolamento da terreno: i funghi presenti nel terreno possono essere isolati con la tecnica delle
diluizioni. Si lascia asciugare il terreno in ambiente ben areato. Una volta che il terreno si è
asciugato, si setaccia in modo da ottenere una polvere abbastanza fine. Si prelevano 3 differenti
quantità di terreno (0,5-1-2 g) che vengono disperse in altrettante provette contenenti 100 mL di
acqua distillata sterile e agar tecnico (0,05%). Il campione è posto ad agitare per circa 20 minuti,
quindi 1 mL della sospensione viene distribuito tal quale in piastre contenenti agar-acqua. dalla
sospensione madre vengono fatte diluizioni seriali (generalmente 10:1, 10:2, 10:3) che sono poi
distribuite anch’esse su agar-acqua ovvero su terreni di coltura molto poveri (Czapeck dox agar).
Per ciascuna diluizione si effettuano almeno 3 repliche. Dopo 5-6 giorni di incubazione a 20-25
°C si sceglierà la concentrazione migliore (ossia quella in cui sono visibili non più di 30-40
colonie distribuite sulla piastra). Dalle colonie vengono quindi effettuati i trasferimenti su PDA.
Una metodica spesso utilizzata per l’isolamento di oomiceti, in particolare per isolare specie di
Phytophthora dal terreno o dalle radici di piante in condizioni di deperimento, è la tecnica del
baiting. Questa tecnica permette di aumentare la possibilità di isolamento di questi patogeni
notoriamente difficoltoso, anche in presenza di sintomi conclamati e di sfavorire lo sviluppo di
contaminanti.
Nel caso più comune di un campione di terreno, questo viene ripartito in più contenitori (3-5
beker da 50 mL), avendo cura di integrare il terreno anche con frammenti di radici. Ai campioni
viene aggiunta acqua distillata sulla cui superficie vengono poste foglie di azalea o camelia o
quercia (o altro opportuno materiale vegetale). I campioni vengono incubati a temperatura
ambiente, lontano da luce diretta, fino alla comparsa dei sintomi sulle foglie (solitamente 3-5
giorni) che non devono essere a diretto contatto con il terreno o con le radici. Le foglie sono,
quindi, tagliate alle estremità, risciacquate con acqua distillata, l’acqua in eccesso viene fatta
asciugare e le foglie vengono ridotte in piccole porzioni (3 x 3 mm) e messe in piastre con
substrato selettivo (tabella 2). Le piastre vengono incubate al buio a temperatura ambiente
ovvero in termostato a circa 20-25 °C. Le colonie che si sono sviluppate sono successivamente
trasferite su substrati di crescita come PDA, CMA, CPA, V8A (tabella 1) per l’identificazione.
Purificazione delle colture di funghi e di oomiceti
La formazione di organi di moltiplicazione o riproduzione di molti funghi è favorita dalla
incubazione a temperature di circa 22-25 °C con luce alternata (fotoperiodo di 12 h di luce). Per
eliminare eventuali contaminazioni da batteri si possono prelevare piccole porzioni di micelio da
colonie provenienti da un primo isolamento da tessuto ospite o comunque da infezione naturale e
trasferirle su terreno di coltura addizionato con antibiotici, solitamente streptomicina o ampicillina
(100 mg/L) oppure può essere preparato del PDA acidificato aggiungendo 10 ml/L di acido lattico
al 25% da conservare al buio poiché l’acido lattico è fotolabile.
L’identificazione e lo studio, sia di tipo tradizionale sia molecolare, di un microrganismo fungino o
di un oomicete, normalmente viene effettuato su isolati portati in purezza, ossia su colonie
pr·ovenienti da un solo propagulo (conidio, sporangio, ifa, spora, ecc.).
·
indice
5
Per avere colture monosporiche, dalle colonie ottenute da isolamento diretto, si prelevano
frammenti di• micelio e si trasferiscono su idoneo substrato di crescita che ne favorisca la
sporificazione, incubandoli in idonee condizioni di temperatura e luce. Quando il fungo è
sufficientemente cresciuto una piccola porzione sporificante viene prelevata, trasferita in una
provetta contenente acqua distillata sterile, agitata per diffondere e separare i propaguli nel mezzo
liquido e versata su una piastra contenente agar-acqua (1,2%). La sospensione viene, quindi,
distribuita in modo da coprire uniformemente l’intera piastra e lasciata 10-20 minuti a riposare.
Successivamente, si elimina l’eccesso di acqua e si mette ad incubare per una notte a temperatura
ambiente. Dalla piastra con le spore o i conidi germinati, operando allo stereomicroscopio ottico, si
taglia un quadrato o un triangolo di agar intorno al singolo propagulo germinato (la germinazione è
indice di vitalità) che si preleva con una lancetta e si trasferisce in una piastra contenente substrato
di crescita.
Esistono numerosi substrati di coltura per l’accrescimento dei funghi. Bisogna tenere presente che i
funghi crescono meglio su substrati ricchi di carboidrati, ma per lunghe conservazioni, un terreno
particolarmente ricco può ridurre la scorificazione nonché la vitalità stessa dell’isolato.
Molti funghi crescono bene su PDA, che essendo un terreno particolarmente ricco, favorisce la
crescita del micelio, ma non la sporificazione del fungo, inoltre è sconsigliato come substrato per la
conservazione dei funghi, poiché può causare mutazioni nel fungo stesso. L’agar-carota come altri
substrati poco ricchi, invece, è un terreno che favorisce la formazione di spore ed è generalmente
consigliato per la conservazione. Similmente all’agar-carota può essere utilizzato l’agar farina di
mais (CMA).
Per alcune specie di Phytophthora si possono effettuare colture monosporangiche inducendo la
produzione di sporangi su PCA o utilizzando altri mezzi che stimolano la sporificazione.
Nel caso di organismi che non formano propaguli, è necessario effettuare una coltura monoifale. Si
preleva una porzione del micelio dalle piastre d’isolamento, lo si mette su agar-acqua (1,2%) e si
incuba al buio a 22-25 °C. In questo caso bisogna ricorrere a substrati poveri, che permettono una
crescita lassa dell’organismo (ife ben distanziate le une dalle altre) per favorire il prelievo. Quando
sono chiaramente distinguibili le ife, si taglia una porzione di una singola ifa, che viene trasferita in
Piastra, su un idoneo substrato di crescita.
Identificazione e caratterizzazione di funghi ed oomiceti.
L’identificazione di un fungo è innanzitutto effettuata osservando al microscopio ottico le
caratteristiche morfologiche dell’isolato, il che permette una prima assegnazione a determinati
gruppi tassonomici. La prima osservazione al microscopio comprende anche la tipologia di micelio,
che per la maggior parte dei funghi è settato, con l’eccezione dei zigomiceti (Mucor mucedo,
Rhyzopus) il cui micelio è cenocitico (senza setti) e nastriforme. Anche gli oomiceti (Phytophthora,
Pythium) presentano un micelio cenocitico. Segue un’identificazione della specie, che può essere
effettuata sia mediante osservazione al microscopio ottico (talora anche al microscopio elettronico),
sia utilizzando altri metodi, ad esempio molecolari. È buona norma accompagnare le tecniche
molecolari, ove possibile, ad una descrizione morfologica (es. morfologia della colonia, tipologia
dei conidi e della conidiogenesi). Per quelle specie che producono solo micelio, l’attribuzione ad
una determinata specie può avvenire con metodi molecolari in associazione ad informazioni morfocolturali.
Caratterizzazione morfologica
Morfologia della colonia
L’aspetto della colonia in piastra a volte può essere osservato su substrati specifici, che vengono
indicati per quel particolare genere, es. PDA o Komada per Fusarium oppure substrati contenenti
particolari sostanze. Alcuni caratteri morfologici, come ad esempio il micelio fioccoso,
•
indice
6
compatto, stellato, a rosetta, il margine della colonia intero o frastagliato, nonché il colore delle
colonie possono essere aspetti indicativi o caratteristici per l’identificazione della specie.
Parametri ambientali, quali temperatura e luce, sono fattori fondamentali per la crescita dei
funghi e possono giocare un ruolo importante anche per la determinazione della specie. I funghi
cosiddetti imperfetti o mitosporici sono così definiti perché si presentano nelle forme di
moltiplicazione agamica. Essi però fanno quasi sempre parte di un ciclo che comprende la
riproduzione (forma perfetta) e la formazione di organi come aschi (ascomiceti), basidi
(basidiomiceti), oospore (oomiceti). Le strutture moltiplicative comprendono le cellule
conidiogene, i conidiofori, gli acervuli, i picnidi, gli sporodochi, i sinnemi o coremi, gli sclerozi,
che possono essere osservate al microscopio ottico e utilizzate nell’identificazione. Delle spore o
dei conidi vanno rilevate la morfologia e le dimensioni. Per gli Oomiceti le strutture più
importanti per l’identificazione, oltre alle caratteristiche delle colonie e del micelio sono quelle
degli sporangi e rami sporangio fori implicati nella moltiplicazione e dei gametangi (anteridi e
oogoni) implicati nella riproduzione. Di seguito si descrivono alcune tecniche comunemente
utilizzate per favorire la formazione di strutture moltiplicative di alcuni funghi e oomiceti.
o Induzione della formazione di sporodochi di Fusarium: si ricorre a l substrato agar-foglie di
garofano, CLA acronimo di carnation leaf agar. Per ottenere agar-foglie di garofano, si
pongono 1 o 2 frammenti di foglia di garofano (precedentemente sterilizzati) in piastre Petri e
si versa lentamente l’agar acqua al 2% . Si pongono porzioni di micelio in piastre di CLA in
prossimità dei frammenti delle foglie di garofano. Le piastre vengono incubate a 25 °C sotto
luce nera o luce di Wood (ultravioletto vicino-nUV) ovvero a luce bianca alternata (12 h di
luce) in termostato con un intervallo termico di 20-25 °C a seconda della specie di Fusarium.
o Induzione della sporificazione di Pyrenochaeta: il micelio cresciuto su PDA acidificato viene
trasferito su agar acqua e incubato per 3 giorni al buio, poi trasferito su 2xV8 agar (V8 con
doppia concentrazione) ed incubato con un fotoperiodo di 18 h o ad illuminazione continua a
21 °C. Normalmente la formazione di strutture riproduttive avviene dopo 3-4 settimane.
o Induzione della produzione di sporangi di Phytophthora: si ricorre al substrato costituito dalla
soluzione di Petri. Si pongono dei piccoli tasselli di micelio (10 x 10 mm) nella soluzione di
Petri (tabella 3) e si incubano a 12-20 °C, alla luce bianca continua. Dopo 3-4 giorni, la
soluzione viene sostituita con acqua distillata e gli sporangi si osservano nell’arco delle 24 h
al binoculare o preparando vetrini da osservare al microscopio ottico.
Tabella 3 – Soluzione Petri.
o Semi di peperone: si utilizzano semi di peperone sani e freschi, vengono lavati in acqua
corrente per circa 1 ora, risciacquati in acqua distillata sterile e fatti asciugare su carta bibula
sotto cappa. Successivamente si pongono circa venti semi su una colonia di Phytophthora di
circa 5-6 giorni e si incuba a temperatura ambiente e illuminazione naturale per 24 ore. I semi
vengono, quindi, trasferiti su agar acqua e coperti con un velo di acqua di fosso. Dopo 48 ore
s·i può osservare al binoculare la formazione di sporangi.
o Filtrato di terreno non sterilizzato: si pone un quadratino di micelio (1×1 cm) in una piastra
Petri contenente un soluzione ottenuta da estratto di terreno o filtrato di terreno. Dopo circa 5·
indice
7
7 giorni di incubazione a temperatura ambiente e luce continua si possono osservare gli
sporangi. Il filtrato di terreno viene preparato miscelando 200 g di terriccio e 500 mL di acqua
deionizzata e lasciando in agitazione per 30-60 minuti. La sospensione viene,
successivamente, filtrata con carta bibula.
Caratterizzazione intraspecifica
Alcuni organismi fitopatogeni possono presentare una specificità nei confronti di un determinato
ospite o gruppo di specie ospiti affini. Questo carattere può non essere accompagnato da differenze
morfologiche, vale a dire che la caratterizzazione morfologica permette la definizione di un
organismo fino al rango di specie, mentre raggruppamenti sub-specifici possono essere identificati
ricorrendo a tecniche di differenziazione patogenetica. La caratterizzazione intraspecifica può
includere la conoscenza dei gruppi di anastomosi (AG) per Rhizoctonia oppure dei gruppi di
compatibilità vegetativa (VCGs) per Fusarium e Sclerotinia. A tale scopo, gli isolati da
caratterizzare sono appaiati in coltura duale con gli isolati cosiddetti “tester” dei vari gruppi di
anastomosi o dei diversi VCGs. Dall’analisi micro e macroscopica di avvenuta plasmogamia, si può
assegnare l’isolato ad un particolare gruppo intraspecifico. Le cosiddette “forme speciali” sono
raggruppamenti sub-specifici che risultano morfologicamente indistinguibili, ma differiscono per la
patogenicità verso una specie ospite o un gruppo di specie ospiti. Anche le “razze fisiologiche” sono
in grado di infettare un gruppo o singole varietà od ibridi. Per la distinzione di forme speciali o di
razze all’interno di una forma speciale è necessario inoculare, su ospiti o serie di ospiti o varietà
specifiche (dette “differenziali”), gli isolati fungini. In base alla reazione sintomatica sulle diverse
entità genetiche, l’isolato viene associato ad una data forma speciale o ad una determinata razza.
Caratterizzazione molecolare
Numerosi protocolli molecolari sono utilizzati a scopo diagnostico determinare specie fungine. I
metodi utilizzati si basano sull’impiego della PCR (reazione a catena della polimerasi) e di
marcatori molecolari, specifici se esistenti, o universali come gli ITS (internal transcribed spacer)
del DNA ribosomale, nello specifico ITS6 e ITS4 per gli oomiceti, ITS5 e ITS4 per i funghi
filamentosi, oppure geni di proteine che contengono sequenze altamente conservate come il fattore
di elongazione (TEF1-alfa), la calmodulina, la beta-tubulina, la poligalatturonasi, gli istoni (H3 e
H4) (tabella 4).
Tabella 4. Principali primer utilizzati attraverso l’analisi di sequenza nell’identificazione di
funghi e oomiceti.
8
Il fattore di elongazione permette, in alcuni casi, di identificare fino a livello di forma speciale.
Di recente introduzione, per la diagnosi anche quantitativa (ad esempio la quantità di inoculo
presente) di funghi e di oomiceti, è la tecnica della real-time PCR, basata sull’utilizzo di
oligonucleotidi marcati con opportuni fluorofori, la quale registra il livello di fluorescenza
liberato durante l’amplificazione in rapporto al numero di cicli della PCR. Il sistema TaqMan, in
particolare viene utilizzato come metodo di diagnosi anche verso organismi da quarantena ed è
impiegato, ad esempio, per il rilevamento di Phytophthora rmorum.
Conservazione dei funghi e degli oomiceti
Solo i funghi saprotrofi e necrotrofi possono essere conservati in collezione, in quanto quelli
biotrofi possono vivere unicamente sui tessuti delle piante ospiti in quanto parassiti obbligati.
Solitamente, vengono sottoposte a conservazione colture monoconidiche/monosporiche, oppure
colture monoifali nel caso di funghi che non sporificano in piastra.
Qui di seguito vengono illustrati alcuni metodi comunemente utilizzati per la conservazione di tali
organismi.
Tubi con terreno agarizzato solidificato (a becco di flauto)
Una piccola porzione di una coltura fungina viene prelevata con un’ansa o ago sterile e trasferita
in tubo contenente un substrato di crescita agarizzato. Esistono diversi substrati che possono
adattarsi alle esigenze delle specie fungine. Tra i più utilizzati vi è l’agar-farina di mais (CMA),
l’agar-carota e l’estratto di carote e patate. Una volta trasferiti in tubo, gli isolati vengono
incubati al buio ad una temperatura compresa tra i 20 e 25 °C. Raggiunto lo sviluppo di 2 cm di
raggio, gli isolati fungini vengono trasferiti in frigorifero per la conservazione a 5-8 °C.
Rivitalizzazione: si preleva una piccola porzione di micelio della coltura cresciuta in tubo, e si
trasferisce in piastra con terreno di coltura. Il metodo della conservazione in tubo non è
indicato per il mantenimento a lungo termine.
Vantaggi: è un metodo economico e non richiede una strumentazione particolare, inoltre la
rivitalizzazione è facile.
Svantaggi: può indurre variabilità genetica, perdita di patogenicità o di caratteristiche
biochimiche, fisiologiche e morfologiche. Si possono facilmente avere contaminazioni anche da
acari.
Olio minerale
L’olio minerale viene sterilizzato a 121 °C per 15 minuti con due passaggi successivi a distanza
di 24 ore.
Le colture cresciute in tubo a becco di flauto contenente substrato agarizzato vengono coperte
con uno strato di olio minerale sterilizzato e conservate a 5-8 °C, assicurandosi che tutto il
micelio sia coperto dallo strato di olio minerale per 1 cm oltre il margine del substrato stesso.
Rivitalizzazione: si preleva una piccola porzione di micelio della coltura cresciuta in tubo e la
si poggia su un supporto sterile (una piastra Petri) cercando di eliminare quanto più possibile
l’olio minerale, quindi si trasferisce su piastra con terreno di crescita. Generalmente è
necessario effettuare un secondo trasferimento.
Vantaggi dell’olio minerale: l’olio minerale assicura una più lunga conservazione delle colonie,
diminuendo il disseccamento dell’agar e una protezione da eventuali contaminazioni da acari. È
un metodo economico e non richiede particolari attrezzature, inoltre assicura una lunga vitalità a
molte specie di funghi ed oomiceti, sebbene sia più laborioso del precedente metodo e possa
presentare contaminazioni da specie di Penicillium ed altri funghi ubiquitari.
Acqua
Porzioni di micelio fungino (circa 5 x 5 mm) vengono messe in provette contenenti acqua
distillata sterile e conservate a temperatura ambiente o a 5-8°C per i funghi ed a 10 °C per gli
oomiceti.
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Il metodo è p·articolarmente indicato per questi ultimi.
Rivitalizzazione: si prelevano uno o più tasselli che possono essere anche suddivisi che
vengono posati su terreno di coltura.
Vantaggi dell’acqua: il metodo assicura una buona vitalità, è indicato soprattutto per organismi
filamentosi che non sono in grado di sopravvivere con altri metodi di conservazione (es. Pythium
e Phytophthora).
È un metodo economico, non richiede particolari attrezzature e preserva da contaminazioni
soprattutto da acari.
Silica-gel
È un metodo indicato per funghi che sporificano in coltura. Le provette in vetro vengono
riempite con granuli di silica-gel e sterilizzate a secco per 3 ore a 180 °C.
Si pipettano 2 ml di una sospensione al 10% di latte scremato (sterilizzato per 10 min a 115120°C) nella piastra in cui è cresciuto il fungo. Quindi si aggiungono 2 mL di acqua distillata
sterile.
Dopo accurato mescolamento, si pipetta pochissimo liquido contenente i propaguli fungini nella
provetta, ovvero Eppendorf da 1,5 mL, con il silica-gel. I funghi in silica-gel vanno conservati a
5 °C.
Rivitalizzazione: alcuni cristalli di silica-gel vengono messi in piastre Petri contenenti PDA o
altro substrato. Si aggiungono 0,5-1mL di acqua distillata sterile per lavare i cristalli e si
incuba a 20-25 °C per 24-48 ore.
Vantaggi del silica-gel: è un metodo economico, semplice e non richiede particolari attrezzature.
Le colture si mantengono stabili per molti anni.
Svantaggi: non è applicabile agli oomiceti, od a funghi che presentano spore con una struttura
complessa. C’è inoltre la possibilità di introdurre contaminanti.
Liofilizzazione
Viene preparata una sospensione contenente il 10% di latte scremato in polvere e il 5% di
inositolo, sterilizzata a 115 °C per 10 min. I tubi per la liofilizzazione vengono sterilizzati a 180
°C per 3 ore.
Si pipettano 2 mL di sospensione di latte-inositolo nella piastra in cui è cresciuto il fungo, si
spande bene la soluzione e si pipetta nei tubi da liofilizzazione.
I tubi vanno tenuti preventivamente per 24 ore a -80°C, successivamente si procede con la
liofilizzazione vera e propria.
Dopo tale procedimento, i campioni vengono conservati a 5 °C.
Rivitalizzazione: si apre il tubo contenente il fungo liofilizzato e si aggiunge 1 mL di acqua
distillata sterile, si attende 20-30 min quindi si inocula su PDA o altro substrato e si incuba a
20-25 °C.
Vantaggi della liofilizzazione: il metodo protegge da contaminanti ed assicura una lunga vitalità
delle colture.
Svantaggi: alcuni isolati fungini non sopravvivono al processo di liofilizzazione o possono
verificarsi danni genetici.
Il processo di liofilizzazione è inoltre un processo complesso e richiede elevati costi per le
attrezzature, nonché personale esperto.
Azoto liquido
Nella piastra contenente il fungo si versa un’aliquota di glicerolo al 10% (sterilizzato a 121 °C
per 10 min) o di dimetilsolfossido (DMSO) al 10% (non sterilizzato).
Si spande la soluzione e si gratta delicatamente la superficie della coltura.
Con una pipetta si preleva la mistura e la si mette nelle provette per azoto liquido.
Le provette vanno tenute per 20-30 min a -80 °C e successivamente immerse in azoto liquido in
appositi contenitori.
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indice
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Rivitalizzazione: si prende la provetta dall’azoto liquido, si lascia per alcuni minuti a 37 °C,
quindi si versa il contenuto in piastra con PDA o altro substrato e si incuba a 20-25 °C.
Vantaggi: le colture sono mantenute in condizioni controllate per lunghi periodi e sono esenti da
possibili contaminazioni esterne. La maggior parte dei funghi sopravvivono bene a questo tipo di
conservazione.
Svantaggi: è un metodo dispendioso, per le necessarie attrezzature e per personale addestrato.
Inoltre è richiesto un continuo rifornimento di azoto liquido per rimboccare il contenitore
dell’azoto.
Essiccazione su carta da filtro
Un disco di carta da filtro (n. 1 Qualitative, Whatman, UK), sterilizzato in stufa a 180 °C per 3
ore, del diametro di 70 mm è posto al centro di una piastra Petri di 90 mm di diametro con PDA
o altro substrato. Dal margine di una coltura in attiva crescita (circa 7 giorni) vengono tagliati dei
quadratini di 9 mm2 e posti al bordo della carta da filtro (circa 4 colonie per piastra). Tutto viene
poi incubato a 20-25 °C al buio. Quando il filtro è completamente coperto dal micelio del fungo,
si pone ad essiccare. Questo avviene prelevando delicatamente il filtro che viene messo
all’interno di una piastra Petri sterile di 90 mm di diametro vuota la quale, successivamente,
viene posta in un essiccatore a campana collegato ad una pompa da vuoto. L’essiccatore contiene
silica-gel preventivamente sterilizzato in stufa per 3 ore a 180 °C. Quando le colonie fungine sul
filtro appaiono completamente essiccate (24-48 ore), il filtro viene rimosso dalla piastra
operando in condizioni di sterilità (sotto cappa) e, molto velocemente, viene tagliato in piccole
strisce, a loro volta ritagliate in quadratini (circa 3 x 3 mm) che vengono stoccati in contenitori di
vetro sterili della capacità di 10 mL. I contenitori, ben chiusi, sono posti immediatamente in
freezer a -20 °C.
Rivitalizzazione: quadratini dell’isolato fungino vengono prelevati e messi su piastre con PDA
o altro substrato. Le piastre vengono incubate a 20-25 °C al buio.
Vantaggi: è un metodo che permette di conservare molti isolati in poco spazio. È relativamente
economico.
Svantaggi: il processo di essiccazione va seguito costantemente per individuare il momento
giusto per fermare il processo, poiché una eccessiva essiccazione provoca la morte del fungo.
Batteri fitopatogeni
Isolamento di batteri fitopatogeni.
Due sono le tecniche più comunemente utilizzate: la macerazione e l’immersione in acqua o
tamponi sterili.
Macerazione: per isolare i batteri dai tessuti vegetali, piccole porzioni di tessuto (2-3 × 2-3 mm)
al margine del sintomo vengono prelevate con bisturi sterile e macerate dentro mortai contenenti
1-3 mL di acqua distillata o tampone fosfato (tabella 5) sterili. Il tessuto finemente triturato così
ottenuto si lascia decantare per 20 minuti. Poi, vengono allestite tre diluizioni seriali decimali.
Tabella 5 – Tamponi utilizzati in fase di isolamento.
Aliquote (100 μL) di tali sospensioni, compreso il tal quale, vengono distribuite uniformemente,
mediante apposite anse ad ‘L’, in piastre contenenti il terreno di crescita (tabella 6). Le piastre
vengono poste in termostato a temperatura compresa tra 25 e 28 °C.
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Tabella 6 – Composizione dei principali terreni agarizzati per 1
litro di acqua distillata) impiegati per l’isolamento o per
la crescita dei batteri fitopatogeni.
Immersione in acqua o tamponi sterili: Un’altra tecnica di isolamento è l’immersione di piccole
porzione di tessuti, allo stadio iniziale del sintomo, in 1,5 mL di acqua distillata o tampone
fosfato o soluzione fisiologica (tabella 5) sterili. Dopo aver lasciato il tessuto per 30-45 minuti in
immersione, aliquote (100 μL) della sospensione e delle diluizioni decimali vengono strisciate su
piastre di substrati idonei (tabella 6).
Purificazione e preparazione delle colture di batteri
L’isolamento su terreno di coltura determina l’accrescimento di colture miste di specie batteriche
saprofite e specie fitopatogene (figura 1). Al fine di identificare le colonie batteriche fitopatogene è
necessario ottenerle in coltura pura.
Le singole colonie vengono trasferite con apposite anse dalla piastra di isolamento a una nuova
piastra contenente il terreno di coltura (figura 2). Il terreno di crescita batterica può essere un
substrato generico quale l’agar nutritivo (NA), oppure un substrato che metta in evidenza
determinate caratteristiche della specie, come il terreno B di King, che permette di evidenziare la
presenza di colonie fluorescenti, o l’NSA sul quale è possibile rilevare caratteristiche colonie a
forma convessa (cosiddette levaniformi).
Figura 1 - Coltura mista di batteri su piastra
dopo incubazione per 48 ore a
26-28 °C.
Figura 2 - Coltura pura di Pseudomonas
syringae.
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Identificazione e caratterizzazione di batteri
Caratterizzazione morfologica
La morfologia di una colonia, ovvero l’attenta osservazione della forma, colore, elevazione,
superficie, margine, consistenza, ed odore delle colonie, può suggerire, indicativamente, il genere a
cui appartiene l’isolato. Inoltre, è necessario eseguire osservazioni al microscopio ottico in contrasto
di fase delle cellule batteriche per accertare la loro forma e aggregazione, nonché per verificare se
siano Gram-positive o Gram-negative.
Caratterizzazione biochimica e nutrizionale
Mediante l’esecuzione dei saggi biochimici è possibile verificare se un isolato batterico possiede
determinati enzimi in grado di metabolizzare particolari composti organici.
La presenza dei vari enzimi può essere rilevata in diversi modi, secondo la loro specifica attività.
Per esempio, l’azione della levanosaccarasi su saccarosio provoca la polimerizzazione del fruttosio
che viene escreto dalla cellula in grande quantità, determinando la formazione di colonie
levaniformi, tipica di alcune pseudomonadi e di Erwinia amylovora.
La produzione di enzimi pectinolitici, da parte di specie di Pseudomonas o Pectobacterium agenti
di marciume, viene messa in evidenza ponendo su fettine di patata la colonia batterica che ne
provoca il rammollimento (attività pectinolitica su patata). L’attività di altri enzimi viene rilevata
mediante l’aggiunta nel terreno di crescita del substrato dell’enzima e di un indicatore di pH
(qualora la reazione catalizzata dall’enzima provochi una variazione di pH) che determina un
cambiamento del colore del mezzo di coltura, che testimonia la presenza dell’enzima (es. arginina
deidrolasi).
Talvolta, in seguito alla reazione enzimatica, si formano dei prodotti che rendono scuro il mezzo di
coltura (es. idrolisi dell’esculina, dell’arbutina, della tirosina).
È possibile, inoltre, eseguire saggi nutrizionali per verificare se un batterio è capace di utilizzare un
determinato composto organico (carboidrato, aminoacido, acido organico) come unica fonte di
energia.
Tali saggi vengono di solito eseguiti inoculando il batterio indagato in un substrato minimo
contenente una sola fonte di carbonio o azoto, in presenza di un indicatore di pH. Se il batterio è in
grado di utilizzare la fonte saggiata per la crescita, si avrà una variazione del pH e di conseguenza,
un cambiamento del colore del mezzo.
Sono, inoltre, disponibili dei sistemi che permettono di verificare contemporaneamente la capacità
di un isolato di utilizzare diversi composti organici. Il sistema API 150, formato da 150 microtubi
seriali contenenti vari composti organici e un indicatore di pH, permette di saggiare la capacità di
un ceppo batterico di usare come unica fonte di energia uno o più dei 49 carboidrati, 49 aminoacidi
e 49 acidi organici diversi.
Il Biolog è un sistema analogo con il quale è possibile saggiare l’assimilazione di 95 composti
organici diversi mediante un lettore ottico collegato a un computer che registra i risultati ottenuti e li
confronta con una banca dati relativa a batteri fitopatogeni noti.
Caratterizzazione fisiologica
Al fine di identificare una specie batterica può essere utile rilevare alcune caratteristiche
fisiologiche, come la crescita a diverse temperature (es. 4 °C o 37 °C), la tolleranza a diverse
concentrazioni di NaCl (es. 2,5 e 7%) o di sali di tetrazolio, la capacità di produrre tossine o la
capacità, caratteristica tipica di Pseudomonas syringae pv. syringae, di produrre proteine che
catalizzano la formazione di nuclei di ghiaccio.
Caratterizzazione sierologica
Le analisi sierologiche possono fornire ulteriori informazioni per l’identificazione delle specie
batteriche, sono, inoltre, affidabili, rapide e abbastanza sensibili.
Esse si basano sulla disponibilità di anticorpi specifici, ovvero proteine di difesa, dette
immunoglobuline, prodotte dagli animali (mammiferi) quando vengono introdotte nel loro corpo
sostanze, chiamate antigeni, quali possono essere le cellule batteriche o parti di esse.
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La reazione antigene-anticorpo può avvenire anche all’esterno del corpo dell’animale, ovvero in
vitro, e può essere resa visibile in vari modi a secondo della tecnica impiegata.
Una tecnica sierologica maggiormente utilizzata nella diagnosi batterica è l’immunofluorescenza:
gli anticorpi vengono coniugati con un composto chimico, di solito isotiocianato di fluorescina, che
emette fluorescenza sotto la luce ultravioletta. L’anticorpo coniugato, quindi, riconosce e si lega
all’antigene specifico, rappresentato in questo caso da una porzione superficiale della parete della
cellule batterica.
I preparati, sia l’estratto vegetale infetto, sia la sospensione batterica, vanno posti su idonei vetrini,
e dopo la colorazione di immunofluorescenza, sono osservati al microscopio ottico fornito di
lampada epifluorescente a vapori di mercurio. Qualora la reazione risulti positiva, i batteri in esame
risulteranno fluorescenti al microscopio.
Un’altra tecnica sierologica impiegata è l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Tale
metodo viene eseguito in apposite piastre di polistirene contenenti 96 pozzetti, nei quali, al
preparato in esame, viene aggiunto l’anticorpo specifico coniugato con un enzima (fosfatasi
alcalina), in presenza del suo substrato (p-nitrofenil-fosfato). In seguito alla reazione antigeneanticorpo e alla conseguente reazione enzimatica, i campioni positivi, che rimangono legati ai
pozzetti, assumono una caratteristica colorazione gialla.
Caratterizzazione molecolare
Allo scopo di identificare e caratterizzare le specie batteriche fitopatogene, sono di grande utilità le
tecniche molecolari, in quanto specifiche, sensibili e affidabili, le quali danno risultati in tempi più
brevi rispetto ai saggi tradizionali.
La maggior parte dei protocolli molecolari si avvalgono dell’amplificazione, mediante PCR
(reazione a catena della polimerasi), di sequenze specifiche del genoma batterico. Il prodotto di
questa amplificazione può essere un unico “amplicone” di una determinata dimensione, che
individua una determinata specie batterica.
Diversi protocolli diagnostici, utilizzati in fitobatteriologia, si basano sull’amplificazione di
specifici gen·i coinvolti nell’espressione della risposta di ipersensibilità o di patogenicità,
appartenenti al cluster genico hrp (hypersensitive response and pathogenicity). Ad esempio, i geni
hrpW e hrpL sono stati utilizzati come bersaglio per il rilevamento, rispettivamente, di
Pseudomonas avellanae e di Pseudomonas syringae pv. papulans.
Alternativamente, possono essere utilizzati come bersagli “target” per l’identificazione geni
codificanti per prodotti di virulenza. Ceppi di Pseudomonas syringae pv. syringae possono essere
identificati per la presenza di un frammento del gene syrB coinvolto nella produzione di tossine.
l’amplificazione specifica del gene pel, codificante l’enzima pectato liasi, permette di identificare
alcune sottospecie appartenenti al genere Pectobacterium. Altri primers, disegnati sulle sequenze
dei geni ribosomiali (16S, 23S, 5S), sono utilizzati sia a scopo diagnostico, sia in studi di
tassonomia batterica.
Inoltre, sono disponibili dei primer universali che, amplificando delle sequenze geniche ripetute e
conservate, generano dei profili elettroforetici, formati da frammenti di DNA di diverso peso
molecolare.
Le sequenze caratteristiche presenti nei batteri fitopatogeni appartengono a tre famiglie:
REP (Repetitive Extragenic Palindromic),
ERIC (Enterobacterial Repetetive Intergenic) e
l’elemento BOX (tabella 7).
Il confronto dei profili elettroforetici di diversi ceppi batterici, eventualmente elaborati mediante
analisi statistiche, può fornire informazioni sia per l’identificazione della specie, sia per stabilire
relazioni tassonomiche tra i vari ceppi.
Di recente introduzione per la diagnosi di fitobatteri, la “real-time PCR”, basata sull’utilizzo di
oligonucleotidi marcati con opportuni fluorofori, registra il livello di fluorescenza liberato durante
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l’amplificazione proporzionalmente al numero di cicli della PCR. Il sistema TaqMan, in particolare,
è stato utilizzato per il rilevamento di Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e Ralstonia
solanacea rum in tuberi di patata.
Tabella 7 - Primer universali per l’ottenimento di profili molecolari utili per
l’identificazione di batteri.
Conservazione dei batteri ai fini diagnostici
Esistono diversi metodi per mantenere in purezza i ceppi batterici, che differiscono tra di loro per la
durata del periodo di conservazione. Quest’ultimo, tuttavia, non dipende solo dal metodo utilizzato,
ma anche dalle caratteristiche della specie. Quando si procede alla conservazione di un ceppo è
opportuno ottenere la coltura batterica da conservare da una singola colonia pura, ciò al fine di
assicurare il mantenimento di una coltura geneticamente uniforme.
Terreno nutritivo
Quando occorre conservare degli isolati batterici per un periodo di tempo di 2-4 settimane, le
colonie possono essere strisciate in piastre o, alternativamente, in tubi contenenti agar nutritivo
(NA) con l’aggiunta dello 0,1% di glucosio e fatte crescere in termostato per 24-48 ore a 25-28
°C. Gli isolati vengono poi conservati a circa 5 °C.
Rivitalizzazione: si preleva con l’apposita ansa una colonia batterica mantenuta in piastra o
tubo e si striscia su un substrato di crescita.
Vantaggi: è un metodo economico che non richiede una strumentazione particolare.
Svantaggi: vi può essere pericolo di variabilità genetica, perdita di patogenicità o di
caratteristiche biochimiche, fisiologiche e morfologiche. Vi può essere un rischio di
inquinamento.
Acqua
Si prepara una sospensione batterica alla concentrazione di 1 x 108 u.f.c./ml (unità formanti
colonie/ml), da colture cresciute per 24/48 ore su agar nutritivo, si versa in un tubo contenente
acqua distillata sterile e si conserva a 5°-10°C. Il tempo di conservazione è molto variabile e
dipende dalle caratteristiche della specie.
Rivitalizzazione: si agita bene il tubo, si prelevano 100 μL della sospensione batterica e si
distribuiscono uniformemente su un substrato di crescita.
Vantaggi: è un metodo economico che non richiede una strumentazione particolare.
Svantaggi: il metodo presenta il rischio di contaminazione dei tubi. è consigliabile
solo per conservazione di breve durata.
Conservazione a -80 °C
Le colonie batteriche cresciute su NA per 24-48 h vengono sospese in 10-20 ml di brodo
nutritivo (NB) e fatte crescere con agitazione (200 rpm) per 24-48 h alla temperatura ottimale per
la specie da conservare. Si aggiunge poi un volume di glicerolo fino a raggiungere la
concentrazione del 15-20%. Si suddivide la sospensione batterica così ottenuta in aliquote da 1
mL in tubi sterili. Per favorire un graduale congelamento, si pongono i tubi a -20 °C per trenta
minuti e poi si trasferiscono a -80°C. Questo tipo di conservazione permette di mantenere gli
isolati batterici per tempi più lunghi (1-2 anni).
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Rivitalizzazione: si prelevano i tubi dal congelatore, si preleva dalla superficie un poco di
sospensione batterica congelata e si sospende in brodo nutritivo o si distribuisce su terreno di
coltura. Per non compromettere la vitalità della restante coltura, occorre evitare di farla
scongelare durante il prelievo.
Vantaggi: permette di mantenere i batteri per tempi relativamente lunghi.
Svantaggi: occorre un’adeguata strumentazione (congelatore a -80°C, gruppo elettrogeno).
Essiccazione su carta da filtro
Preparare tubi sterili contenenti 0,5 ml di soluzione acquosa di peptone al 5% più gelatina al 3%,
e 0,5 ml di soluzione di glucosio all’8%. In tali tubi sospendere nuovamente le colonie batteriche
cresciute per 48 ore su terreno di coltura. Versare con pipette sterili la sospensione su strisce (5
mm x 30 mm) di carta Whatman n. 1, fino a completa imbibizione. Porre le strisce di carta
imbibite su un supporto metallico o di vetro ed appoggiare tale supporto su un foglio di carta da
filtro disposto sopra uno strato di silica gel essiccato dentro capsule Petri di vetro. Deporre le
capsule in un essiccatore per 3-5 giorni. Dopo l’essiccazione conservare le strisce avvolte in fogli
di alluminio riposti in contenitori di vetro con silica gel come indicatore di umidità. Tutto il
materiale utilizzato deve essere sterile.
Rivitalizzazione: le strisce di carta vengono poste su piastre contenenti l’opportuno terreno di
crescita.
Vantaggi: è un metodo che permette di conservare molti isolati in poco spazio.
Svantaggi: il processo di essiccazione è lungo.
Liofilizzazione
Questo metodo permette di conservare i batteri per lunghi periodi, oltre 10 anni, fino anche a 50
anni a seconda della specie batterica, senza alterare le loro caratteristiche. Dopo 24-48 ore di
crescita su NA una singola colonia della coltura batterica pura viene prelevata, risospesa in una
soluzione acquosa di saccarosio (7%) e peptone (7%) e incubata per 25-48 ore alla temperatura
ottimale. La sospensione batterica viene suddivisa in aliquote da 2 mL in flaconcini da
penicillina (da 10 mL) sterili o, alternativamente, possono essere utilizzate fiale monouso. Le
colture vengono, quindi, mantenute per 24 ore a -80 °C. Successivamente, si procede con
l’essiccazione, sotto vuoto, nel liofilizzatore. I batteri liofilizzati sono conservati a 5°C (Fig.
3.22).
Rivitalizzazione: i batteri liofilizzati assumono un aspetto polverulento. Per renderli vitali si
aggiunge un’aliquota di brodo nutritivo o acqua distillata sterile e, una volta disciolta
completamente la polvere, si trasferiscono 100 μL della sospensione in una piastra contenente
l’opportuno terreno di crescita, distribuendo uniformemente il liquido su tutta la piastra con
l’apposita ansa.
Vantaggi: è un metodo sicuro per mantenere a lungo gli isolati proteggendoli dai
contaminanti.
Svantaggi: occorre un’adeguata apparecchiatura (congelatore a -80°C, liofilizzatore).
Virus e viroidi fitopatogeni
Isolamento di virus e viroidi e prove di patogenicità
A differenza di funghi e batteri, non è mai possibile ottenere una coltura pura di virus e viroidi
vegetali, in quanto parassiti obbligati endocellulari.
È possibile tuttavia il mantenimento in vivo, ossia il trasferimento del virus o viroide dal campione
vegetale ad indicatori erbacei o arborei. cioè a specie di piante anche spontanee, che possono essere
agevolmente allevate in serra, a rapido accrescimento e che rispondono con una sintomatologia
specifica e costa·nte all’infezione di virus e viroidi diversi. La possibilità di utilizzare indicatori ha
per fondamento l’assunto che una della proprietà comuni a tutti i virus e viroidi è quella di essere
trasmissibili per succo o per innesto (patogeni generalizzati o sistemici). Una buona parte di essi
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può essere trasmessa meccanicamente sugli indicatori, ma per altri è necessario far ricorso a vettori
o a i·nnesto.
Sono note serie più o meno standard di ospiti vegetali atti alla identificazione ed al mantenimento in
vivo della maggior parte dei virus e viroidi. Spesso si tratta di specie erbacee spontanee o di essenze
arbustive o legnose impiegate come portainnesti ma, in un saggio biologico, questa gamma di ospiti
dovrebbe sempre includere la specie da cui l’entità infettiva è stata isolata in natura al fine di
mantenere le stesse condizioni cellulari che assicurino il mantenimento delle caratteristiche
biologiche e molecolari del virus o viroide da tenere in collezione.
In genere la trasmissione meccanica o per succo comporta lo strofinamento con un dito o con una
spatola, sulla superficie fogliare delle piante di saggio, previamente cosparsa di polvere abrasiva
(celite o carborundum), del succo estratto da porzioni di tessuto infetto, triturato in un mortaio in
presenza di opportune soluzioni tampone che si oppongono a variazioni di pH dell’estratto cellulare
(in genere un tampone fosfato) o all’azione di enzimi (ribonucleasi, polifenolossidasi) presenti nel
succo cellulare e in grado di inibire l’infettività dei virus. Per la trasmissione per innesto si utilizza
preferenzialmente l’innesto a scaglia o chip budding. Questo tipo di innesto si applica in particolare
alle piante arboree, in luogo di quello alla maiorchina. Lo scudetto, una gemma fornita di una
porzione di legno, deve avere uno spessore nella parte inferiore, di circa 3 mm e una lunghezza di 23 cm. Il taglio nel portainnesto deve consentire l'incastro dello scudetto alla base. Dopo una
settimana dall’innesto la pianta viene cimata e, dopo 10 giorni, va tagliata poco sopra la gemma
innestata, per favorire il manifestarsi dei sintomi.
Bisogna tenere conto di diversi fattori che possono influenzare la valutazione del risultato del
saggio:
Controlli: è bene includere sempre da 3 a 5 indicatori della stessa specie vegetale da utilizzare
come controllo negativo.
Presenza di inibitori: i succhi cellulari di alcune specie contengono potenti inibitori che
impediscono il trasferimento dell’infezione per inoculazione per succo. Ad esempio, il succo di
una specie da saggio comunemente usata (Chenopodium quinoa) contiene alcuni di questi
inibitori. È bene, quindi, inoculare per ultimi gli individui di questa specie, onde evitare il
trasferimento degli inibitori nell’estratto adoperato per l’inoculazione. Per lo stesso motivo, le
piante vengono sciacquate con acqua dopo lo strofinamento con il succo infetto.
Tempi di risposta: sono più o meno noti e caratteristici per la specie o il gruppo virale (5-10
giorni per le lesioni locali, 14-20 giorni per l’infezione sistemica). Nel caso di marze e talee è
frequente il ricorso alla forzatura, con temperatura ed umidità elevate, per accelerare la comparsa
di sintomi.
Età e stadio vegetativo dell’indicatore.
Condizioni di allevamento: costituiscono uno dei punti più critici per l’esecuzione del saggio.
Proprio per questo motivo le piante indicatrici vengono coltivate in ambienti controllati,
generalmente serre termo-condizionate o fitotroni, in cui la temperatura, l’illuminazione e
l’umidità sono impostate per garantire la replicazione dei virus e dei viroidi (Fig. 3.8).
Purificazione di virus e viroidi
I virus e viroidi vegetali non sono organismi coltivabili, quindi è possibile ottenere solamente o una
purificazione delle particelle virali (virioni), non applicabile ai viroidi in quanto privi di
rivestimento proteico, o una purificazione degli acidi nucleici virali o viroidali, sia mediante
estrazione della doppia elica di RNA (dsRNA), sia mediante estrazione dell’acido nucleico nella sua
forma originaria (ssRNA, ssDNA, dsDNA).
Purificazione dei virioni. È possibile ottenere la purificazione delle particelle nucleo-proteiche
virali integre e infettive mediante protocolli che prevedono l’utilizzo di solventi per la
chiarificazione del materiale vegetale (100-200 g circa di foglie inoculate di pianta indicatrice) e
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cicli di centrifugazione differenziale e ultracentrifugazione isopicnica su gradienti. Le
caratteristiche bio-chimiche delle diverse specie virali richiedono l’utilizzo di tamponi di estrazione
e cicli di centrifugazione specifici.
Estrazione della doppia elica di RNA (dsRNA). È il primo approccio molecolare alla diagnosi
virologica. La tecnica consiste nell’isolare, da un estratto di acidi nucleici totali di un campione di
tessuto, RNA bicatenari (dsRNA) prodotti dalla replicazione virale. Per isolare il dsRNA sono
necessarie grandi quantità di tessuto polverizzato con azoto liquido. Nel caso di possibile infezione
da virus, è necessario partire da 30 g di tessuto. Dopo il passaggio in un tampone di estrazione
composto fondamentalmente da fenolo, l’acido nucleico proveniente dai tessuti della pianta viene
messo in contatto con una soluzione a base di cellulosa che cattura gli acidi nucleici e non i residui
cellulari. Lavaggi con etanolo consentono la successiva eluizione selettiva degli acidi nucleici.
Per quanto riguarda i virus, l’isolamento del RNA avviene grazie ad una serie di digestioni
enzimatiche, la prima con DNasi, la seconda con la proteinasi K, a cui segue una seconda pulizia
con fenolo e una precipitazione alcolica dell’acido nucleico. Il risultato si visualizza grazie ad una
corsa elettroforetica su gel di acrilamide.
Per quanto riguarda i viroidi, il protocollo di estrazione dell’acido nucleico a singola elica (ssRNA)
è più rapido e prevede l’utilizzo di soli 5 g di materiale verde.
Per l’isolamento dell’RNA viroidale si sfrutta la circolarità dell’acido nucleico del viroide. Questa
caratteristica, infatti, rende l’RNA del viroide unico a confronto con il contenuto di acidi nucleici
del tessuto vegetale. L’RNA viroidale si isola con una doppia corsa elettroforetica su gel di
acrilamide, la prima di tipo normale, la seconda con un gel denaturante in cui tutti gli RNA lineari
vengono persi nella corsa e si trattengono solo quelli circolari.
L’isolamento di dsRNA virali dalla pianta permette di stabilire la presenza di un’infezione virale ma
non di identificare l’agente infettante responsabile. Al contrario, nel caso dei viroidi è possibile
anche la caratterizzazione, sia sulla base del peso molecolare del viroide, sia con un saggio di tipo
Northern blot (vedi ibridazione molecolare).
Identificazione e caratterizzazione di virus e viroidi
La caratterizzazione di un virus o di un viroide può avvenire grazie all’uso di diverse tecniche. Per
quanto riguarda i virus si possono usare sia i saggi sierologici, sia quelli molecolari, mentre per i
viroidi possono essere utilizzati solo saggi molecolari.
La caratterizzazione ceppo-specifica dei virus può essere perseguita siero logicamente, utilizzando
un anticorpo monoclonale in grado di legarsi ad epitopi caratteristici del capside di un solo ceppo
virale.
Se si intende, invece, utilizzare l’amplificazione genica per identificare e caratterizzare un virus, si
può procedere con un attento disegno di primers specifici che consentano di distinguere la specie
all’interno di un genere tassonomico o di un ceppo nell’ambito della stessa specie virale. Spesso,
però, le differenze nucleotidiche nei genomi di due ceppi sono troppo esigue per essere in grado di
discriminare l’appartenenza con il solo uso di primer specifici.
Si può ricorrere, allora, al sequenziamento di una porzione di genoma, oppure si può ricorrere a
tagli con enzimi di restrizione sui prodotti di amplificazione che, a seconda della sequenza
nucleotidica, danno un “motivo” di segmenti diversi consentendo, quindi, tramite il confronto di
essi, di risalire al ceppo di origine della sequenza (polimorfismo da lunghezza dei frammenti di
restrizione, RFLP).
Molto importante nella caratterizzazione del virus è la scelta della porzione del genoma da
analizzare. Le differenze maggiori all’interno dei ceppi si trovano in genere sui geni che codificano
per la proteina capsidica, mentre, se si tenta di fare una discriminazione per famiglie, può essere più
utile lavorare su geni più conservati come l’RNA polimerasi RNA dipendente.
Per quanto riguarda i viroidi, la caratterizzazione avviene quasi esclusivamente mediante
sequenziamento di tutta la sequenza nucleotidica del genoma, che, essendo molto piccola, rende
molto efficace lo studio dei diversi polimorfismi.
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Saggio sierologico.
Base della diagnosi sierologica è la capacità degli anticorpi prodotti dal sistema immunitario di
organismi animali di reagire in vitro ed in maniera specifica con quegli stessi antigeni che ne
hanno stimolato la formazione. Da molti anni l’ELISA (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay)
è il metodo immunoenzimatico più comunemente usato per la diagnosi delle malattie virali delle
piante.
L’ELISA è un saggio su fase solida in cui un anticorpo specifico agisce in successione, prima
intrappolando e poi rilevando la presenza dell’antigene bersaglio (particella virale) mediante
l’impiego di un enzima (ad es. fosfatasi alcalina) capace di produrre il viraggio di colore di un
opportuno substrato.
Per l’individuazione e la caratterizzazione di isolati virali è possibile utilizzare sia l’ELISA
diretta, sia quella indiretta.
ELISA diretta (DAS-ELISA): le fasi schematiche di un protocollo di ELISA diretta (DASELISA) possono essere riassunte come segue (Clark e Adams, 1997):
Sensibilizzazione della piastra con le IgG specifiche (100-200 mL)
Incubazione a 37°C per 2-3 ore
Lavaggio con tampone specifico
Caricamento del campione estratto in tampone (100-200 mL)
Incubazione a 4 °C O/N
Lavaggio con tampone specifico
Caricamento delle IgG coniugate con un enzima (100-200 mL)
Incubazione a 37 °C per 2-3 ore
Lavaggio con tampone specifico
Viene caricato il substrato dell’enzima
Si osserva il viraggio del colore del substrato tramite lettore fotometrico (figura 3).
Figura 3 - Reazione colorimetrica in piastra ELISA, la cui assorbanza dei pozzetti
si misura con l’apposito fotometro.
ELISA indiretta (TAS-ELISA): per l’ELISA indiretta lo schema è fondamentalmente analogo,
ma il primo reattivo (anticorpo intrappolante) è un anticorpo prodotto in un animale (es.
capra/topo/pollo), cui viene fatta seguire l’azione di un anticorpo specifico per lo stesso antigene
(virus) ma prodotto in un animale diverso (es. coniglio) la cui presenza viene rilevata mediante
un terzo tipo di anticorpo coniugato con l’enzima, specifico per il secondo (in questo caso anticoniglio) e definito “coniugato universale”.
Il metodo TAS-ELISA presenta due vantaggi:
risolve il problema della minor reattività degli anticorpi coniugati rispetto a quelli nativi verso
uno stesso antigene,
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usando un “coniugato universale” supera la necessità di preparare tanti coniugati per quanti
so·no i sieri che si prevede di impiegare.
Per entrambi i metodi l’intensità del colore che si ottiene dopo il viraggio dipende dalla
concentrazione dell’antigene.
L’ELISA è un metodo di diagnosi indicato per saggiare un elevato numero di campioni, ma
presenta una sensibilità da 100 a 10.000 volte inferiore al saggio molecolare.
Saggi molecolari
Come per i funghi e i batteri, anche per virus e viroidi sono stati messi a punto numerosi protocolli
molecolari (Makkouk e Kumari, 2006) ai fini diagnostici e di caratterizzazione per i virus e viroidi
vegetali. in particolare sono stati sviluppati sia protocolli di ibridazione molecolare sia di
amplificazione genica. Entrambi questi protocolli necessitano della conoscenza, anche parziale,
della sequenza nucleotidica del genoma del patogeno che si intende identificare, in quanto il
disegno dei primer per l’amplificazione genica e delle sonde per l’ibridazione molecolare sono
subordinati alla presenza di sequenze nucleotidiche complete o parziali in banca dati.
Ibridazione molecolare
L’ibridazione molecolare si basa sull’interazione tra le basi azotate che compongono gli acidi
nucleici, che consente il riconoscimento specifico di un determinato bersaglio (“target”)
molecolare grazie all’utilizzo di una sonda (“probe”) opportunamente prodotta.
Esistono diverse possibilità nella realizzazione di un protocollo di ibridazione molecolare:
o Il modo in cui la molecola bersaglio è immobilizzata su un supporto solido.
o Il tipo di molecola scelta come sonda (cDNA o cRNA).
o Il tipo di marcatura scelta (chimica o radioattiva).
La preparazione del campione target può essere effettuata in molti modi, in genere l’acido
nucleico target viene immobilizzato su un supporto tipo nitrocellulosa o membrana di nylon. Si
può utilizzare direttamente il succo di un campione vegetale, imprimendo una parte del tessuto
sul supporto solido oppure possono essere applicati sulla membrana direttamente gli estratti di
acidi nucleici ottenuti dal trattamento dei tessuti vegetali. Una volta preparato e opportunamente
attivato, il supporto solido viene messo in contatto con la sonda, in genere diluita in una
soluzione detta di ibridazione. L’evidenziazione dell’avvenuta ibridazione si ottiene mediante
esposizione di una lastra radiografica su cui compaiono delle macchie scure in corrispondenza
dei campioni infetti.
Nel caso dei virus la scelta della sequenza da usare come sonda si basa sul tipo di utilizzazione
della tecnica. Sequenze molto conservate all’interno dei genomi virali possono essere utili nella
produzione di sonde genere o sonde famiglia-specifiche. Zone del genoma più variabili possono
essere utilizzate in una sorta di caratterizzazione ceppo-specifica.
Nel caso dei viroidi, generalmente, viene usata tutta la sequenza genomica completa come sonda.
La sonda può essere prodotta come RNA o DNA marcato a singolo filamento complementare al
target o DNA marcato a doppio filamento. in questo caso è opportuno denaturare la sonda prima
di utilizzarla. Ad oggi il sistema più utilizzato è la marcatura con UTP-digossigenato. Questo
metodo è allo stesso tempo sicuro (non sono presenti composti radioattivi) e molto sensibile.
Amplificazione genica
Prima di poter effettuare l’amplificazione genica è necessario estrarre l’acido nucleico totale
(mediante kit commerciali) dal campione vegetale costituito da foglie, nervature, tessuto
sottocorticale, frutto, ecc., a seconda del patogeno.
·
indice
20
L’RNA viroidale viene generalmente ottenuto mediante estrazione di tipo fenolico o su matrice
silicea di acidi nucleici. Ormai da anni la tecnica della PCR (reazione a catena della polimerasi) è
diventata di uso comune con diverse metodologie e varianti che si basano tutte sulla replicazione
esponenziale (amplificazione) di un segmento specifico di DNA in presenza di polimerasi stabili
(Taq) ed inneschi di reazione sintetizzati specificatamente sul RNA/DNA bersaglio del virus o
viroide che si vuole identificare. Tutti i viroidi e la maggior parte dei virus vegetali hanno un
genoma formato da RNA. In questo caso è prima necessario procedere alla sintesi di un
filamento di DNA complementare (cDNA) mediante una retro-trascrizione, per mezzo di un
enzima di retro-trascrittasi (AMV o MMLV), utilizzando come innesco un primer specifico
complementare alla sequenza target o primer randomizzati. Successivamente si può procedere
all’amplificazione genica vera e propria, mediante oligo-specifici (sia complementari sia
omologhi) a seconda del virus o viroide.
Figura 4 – Termociclizzatore e vaschetta per
l’elettroforesi.
Figura 5 – Visualizzazione dei prodotti di
amplificazione dopo corsa elettroforetica, trattamento con bro
muro di etidio ed osservazione
al transilluminatore.
Il risultato di un’amplificazione in PCR può essere visualizzato mediante elettroforesi (figura 4)
in gel di agarosio ad una concentrazione dell’1-1,5% (figura 5).
Conservazione di virus e viroidi
A differenza di funghi e batteri, non è mai possibile ottenere una coltura pura di virus e viroidi
vegetali da conservare in collezione.
È possibile tuttavia il mantenimento in vivo, ossia il trasferimento del virus o viroide dal campione
vegetale ad indicatori erbacei o arborei, che possono essere agevolmente allevati in serra. Questo
sistema di conservazione in vivo è estremamente oneroso, richiede esperienza e disponibilità di
strutture di mantenimento specifiche.
Generalmente si preferisce, quando le proprietà fisico-chimiche del virus lo consentono, conservare
gli isolati virali direttamente nelle matrici vegetali trovate infette (foglie, frutti, bacche, tessuto
sottocorticale) oppure macerate in azoto liquido. I campioni opportunamente etichettati possono
essere conservati tal quali a -20 °C ovvero, per periodi molto più lunghi, a -80 °C. In caso di
necessità, è possibile macerare il campione congelato, sospeso in un opportuno tampone di
macerazione, e inoculare il succo ottenuto su piante ospiti erbacee per consentire la replicazione ed
il rinnovamento delle particelle virali. Nel caso di virus che temono la conservazione a freddo o che
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siano· particolarmente instabili è possibile procedere ad una loro purificazione partendo da tessuto
infetto. I virioni purificati sono conservati in apposite provette a -20°C in presenza di glicerolo al
30-50%. Gli isolati viroidali sono, invece, conservati sotto forma di RNA sospeso in etanolo.
Un’altra tecnica di conservazione di agenti virali o viroidali è la disidratazione o la liofilizzazione di
tessuti infetti. Per il primo sistema di conservazione, le matrici vegetali infette vengono sminuzzate
e poste su carta da filtro all’interno di una capsula Petri contenete granuli di calcio cloruro. Le
capsule vengono chiuse ermeticamente e conservate a 4 °C. Dopo alcuni mesi i tessuti disidratati,
vengono trasferiti in idonei contenitori chiusi e conservati a basse temperature (4 °C).
La liofilizzazione (freeze-drying), la tecnica maggiormente diffusa, prevede un primo passaggio di
congelamento dei tessuti (-20 °C) o dell’estratto di succo grezzo e, successivamente, la
disidratazione spinta sotto vuoto (48-36 ore) nel liofilizzatore.
Per la scelta del metodo di conservazione si deve tenere conto delle caratteristiche fisiche-chimiche
dei virioni e delle finalità lavorative. Ad esempio, alcuni virus, in particolare quelli filamentosi,
subiscono con il congelamento a -20°C alterazioni nella struttura proteica terziaria del capside e nei
legami genoma/capside per cui il materiale spesso non mantiene le capacità infettive o le
caratteristiche strutturali per una sicura identificazione sierologica.
Microrganismi del Suolo
Il suolo è l’ambiente naturale, costituito da materiali minerali ed organici, che sulla superficie della
Terra garantisce la vita agli organismi viventi. Recentemente è stato definito “la zona critica” della
terra meritando un’attenzione particolare grazie al suo ruolo chiave negli equilibri ambientali, a
sostegno dell’intera vita del nostro pianeta. Mantenere in collezione i microrganismi del suolo
rappresenta una necessità irrinunciabile soprattutto nel caso di studi ambientali per comprendere
quali pressioni realmente possano intervenire da parte dell’uomo o di eventi ambientali sul suolo,
quali i cambiamenti climatici, la deforestazione, le colture OGM o la stessa agricoltura intensiva.
Alcuni ceppi microbici o fungini possono essere utilizzati come biomarcatori e, quindi, fungere da
eccellenti bioindicatori ambientali.
Il suolo rappresenta una miniera di geni perlopiù inesplorata e dallo studio e dalla caratterizzazione
dei microrganismi ivi presenti è possibile individuarne sia le funzioni sia le potenziali applicazioni
in molti processi biotecnologici, che spaziano dalla bioenergia alla biofertilizzazione, dal
biorecupero alla biodegradazione.
Oggi si è in grado, attraverso appropriati indicatori microbiologici, biochimici e molecolari, di
definire la qualità e la salute di un suolo, prevederne ed arginarne processi di degradazione, fino alla
desertificazione, nonché calibrare correttamente gli interventi di fertilizzazione con una gestione
integrata delle sostanze nutritive, sulla base della conoscenza del ciclo e del bilancio dei diversi
elementi, quali ad esempio l’azoto. Su questo principio si possono basare tutti gli studi che rientrano
nel tema della metagenomica del suolo.
Realizzare una collezione di microrganismi del suolo risulta più complesso della raccolta in
collezione di altri microrganismi di interesse agrario, in quanto è noto dalla bibliografia che solo
l’1% dei microrganismi che vivono nel suolo sono coltivabili e quindi isolabili, caratterizzabili e
conservabili in collezione.
Di seguito sono descritte le modalità per la messa in collezione di batteri e funghi tellurici, inoltre
vengono anche descritti elementi necessari a fornire una base per l’inserimento nella collezione dei
microorganismi non colturabili come genoma del suolo, nella prospettiva della creazione di un
database per il metagenoma suolo degli ambienti italiani.
ISOLAMENTO
L’isolamento dei microrganismi del terreno avviene attraverso metodi di laboratorio che
differiscono in relazione alle caratteristiche dei microrganismi stessi.
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Tabella 8 – Scheda di campionamento.
La preparazione del campione di suolo: il campione può essere prelevato con sgorbie, trivelle, pale
o campionatori a martellamento con cilindro o pistone, facendo attenzione a mantenere il più
possibile il campione integro.
Per ciascun sito di prelievo, viene generalmente compilata un’apposita scheda (tabella 8).
La scheda dovrebbe fornire al potenziale utente della collezione informazioni utili alla collocazione
del microrganismo nell’ambiente di raccolta, al fine di consentire comparazioni ovvero
rappresentare uno strumento di riferimento.
23
La registrazione dei dati generali costituisce l’elemento base per l’identificazione del campione e
dovrà seguire un criterio concordato ed omologato con un protocollo dettagliato e specifico da
raccogliere in una piccola guida.
In questa parte dovranno essere annotate l’oggetto, il numero e il nome dei campioni, la data del
rilievo, il nome del rilevatore e la località con le relative coordinate GPS. Molto importante sarà
anche l’accuratezza della descrizione del sito considerando come importanti caratteristiche ad
esempio l’esposizione ai venti, la pendenza del suolo, la rocciosità e la quota sul livello del mare.
Risulterà anche fondamentale per l’interpretazione dei dati raccolti la registrazione di alcuni
elementi come la profondità del prelievo, la presenza di falda, l’umidità e la presenza di radici,
nonché i principali dati climatici.
Infine per meglio caratterizzare l’organismo studiato sarà necessario specificare l’uso del suolo
come ad esempio la coltura in atto e la gestione colturale abituale, se forestale (specificare la specie
o la consociazione), prato-pascolo, incolto o altro (fruizione turistica, riserva naturale, giardino
pubblico, ecc), nonché la vicinanza a centri urbani, a strade e autostrade, a siti industriali, a ferrovie.
Ogni informazione utile a ricostruire l’evolversi dell’ecosistema. Ad esempio sarebbe interessante
conoscere, nel caso si considerasse un terreno incolto, se e da quanto tempo è incolto oppure se
precedentemente hanno insistito coltivazioni, boschi, ecc., nonché il colore del suolo, la presenza di
croste superficiali, l’affioramento di materiali particolari come metalli, plastiche, laterizi, residui
organici di vario genere. ·Al fine di costituire un campione medio rappresentativo, il
campionamento viene effettuato in maniera randomizzata lungo un percorso a X o a W che non
tenga conto delle zone anomale e dei bordi della parcella, prelevando almeno 5 sottocampioni. Il
campione di terreno viene, quindi, liberato dai residui colturali superficiali presenti. È necessario
utilizzare guanti monouso, in modo da non provocare contaminazione con microrganismi estranei, e
si utilizzano per la raccolta del campione sacchetti sterili di almeno 2 litri di capacità qualora si
vogliano riunire subito i sottocampioni. La profondità del prelievo è di norma compresa tra 0 e 20
cm, anche se condizioni particolari della parcella (ad es. aratura) o particolari tipi di terreno (ad es.
suolo con copertura forestale) possono richiedere diverse profondità o la suddivisione di una
profondità in diversi campioni in relazioni ai diversi strati.
Per il bulk soil (cioè per il terreno non permeato dalle radici) si campiona a debita distanza dalla
vegetazione.
Per la rizosfera si preleva un pane di terra contenente la pianta con la massima parte dell’apparato
radicale, nel caso di pianta erbacea, mentre nel caso di piante arboree si effettuano prelievi di suolo
ad una distanza dalla pianta e ad una profondità che variano a seconda dello sviluppo radicale della
specie studiata. Una volta prelevato, il campione si mantiene a 4 °C attraverso un contenitore da
trasporto refrigerato fino all’arrivo in laboratorio, preferibilmente entro la giornata stessa del
prelievo.
Isolamento di funghi e batteri
Per la valutazione dei funghi e dei batteri colturabili, si mette il suolo, parzialmente sminuzzato, a
seccare all’aria in vasche di materiale inerte in luogo buio e areato per non più di 5-6 giorni. I
campioni vengono poi setacciati con vagli con pori di dimensione di 2-4 o più mm, a seconda delle
esigenze.
Nel caso dell’isolamento di batteri dalla rizosfera, si rimuove il pane di terra dalle radici e si preleva
l’apparato radicale della pianta con il suolo adeso per uno spessore non superiore ai 2 mm. si
recupera il suolo tramite sbattimento, in agitatore orbitale a 200 oscillazioni min-1 per 30 minuti, di
5 g di radici spezzettate in frammenti di 1 cm ca., insieme a suolo, in presenza di 25 mL di tampone
fosfato salino PBS pH 7,4. si eliminano le radici e si recupera il suolo rizosferico con una
centrifugazione a 5.000 rpm per 15 minuti a RT (temperatura ambiente) in varie Eppendorf.
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Isolamento delle comunità dei batteri azotofissatori aerobi
Vengono utilizzati i seguenti metodi:
1. Metodo di coltura diretta da suolo (indicato per Azotobacter):
Una piccola aliquota di suolo (30-50 g), vagliato come precedentemente indicato, viene
impastato con una quantità pari all’1% di Na-piruvato e acqua sterile in un mortaio di
porcellana.
L’impasto viene trasferito in capsule Petri con una spatola sterile, avendo cura di “lisciare”
convenientemente la superficie dell’impasto, che non deve toccare il coperchio della piastra al
fine di evitare condizioni di anaerobiosi. Dopo incubazione a 30 °C per 3-7 giorni si
evidenziano le colonie di Azotobacter, di aspetto lucido e consistenza viscosa a causa della
sintesi di esopolisaccaridi. Per gli isolamenti viene adottato il metodo secondo Beijerinck per
le Azotobacteriaceae (Beijerinck, 1901): 20 ml di brodo nutritivo vengono distribuiti in beute
da 100 ml sterilizzate, inoculate con 0,3-0,5 g di terreno e incubate per 2-7 giorni a 30 °C.
Prelevato il film caratteristico della crescita di questi batteri e diluito in 10 mL di acqua
sterile, 100 μL di questa diluizione vengono ulteriormente diluiti in provette Eppendorf
contenenti 1,9 ml di acqua sterile, fino a raggiungere la quinta diluizione. 100 μL di ciascuna
diluizione vengono strisciati su piastre contenenti il terreno di coltura ed incubate a 30 °C.
Questo ulteriore passaggio in un mezzo solido privo di azoto si rende necessario per
allontanare gli eventuali ceppi contaminanti, la cui crescita in mezzo liquido, avvertibile dal
forte odore di butirrato, può essere resa possibile dall’azoto fissato prodotto da Azotobacter.
Allo sviluppo delle colonie, queste vengono strisciate su capsule Petri di 10 cm di diametro, con
terreno RM e incubate per 24 h a 30 °C. I substrati usati sono quelli originali di Beijerinck 1901.
2. Isolamento su substrati solidi o semisolidi:
Gli isolamenti si ottengono a partire da 10 g di suolo vagliato, messo ad agitare in beute di
vetro sterili da 250 ml contenenti 90 ml di tampone fosfato pH 7,2 (0,8 g K2HPO4 + 0,2 g
KH2PO4) per 30 minuti in shaker orizzontale oscillatorio a 120 rpm. Questa sospensione viene
considerata una diluizione 10-1. Vengono poi effettuate successive diluizioni seriali in
tampone fosfato e 100 μL delle diluizioni 10-3, 10-4 e 10-5 vengono strisciati su substrati solidi
o inoculati in 4,9 mL di substrato semisolido.
I substrati solidi sono realizzati con l’aggiunta di 15 g/l di Agar mentre per i semisolidi
vengono aggiunti 5 g/L di Agar. Fra i substrati più usati si ricordano:
Substrato di Rennie (Rennie, 1981) generale per Diazotrofi liberi aerobi.
Substrato Nfb (Krieg e Döbereiner, 1984) per le specie di Azospirillum.
Isolamento delle comunità dei rizobi
I rizobi sono batteri capaci di instaurare una simbiosi mutualistica con le radici di piante
leguminose, in quanto i batteri si riforniscono dei carboidrati prodotti dalla pianta mediante
fotosintesi, mentre le piante si riforniscono di azoto assimilabile (ammoniaca) prodotto dai batteri
per riduzione dell’azoto atmosferico (azoto molecolare).
Questi batteri sono presenti in tutti i terreni e la loro capacità di adattamento a condizioni estreme
(es. terreni salini, terreni semidesertici, ecc.) rende gli studi su questa specie batterica molto
interessanti. Particolare attenzione viene data alla selezione e all’impiego di ceppi dotati di
maggiore efficienza azotofissatrice. L’isolamento dei rizobi avviene generalmente dai tubercoli
radicali. In caso di isolamento diretto dal suolo, campioni rappresentativi di terreno vengono
prelevati e posti in vasi all’interno dei quali vengono successivamente seminati semi di leguminose,
opportunamente disinfettati in superficie. Quando le piante hanno raggiunto un sufficiente sviluppo,
si procede alla raccolta dei tubercoli. In caso di isolamento dei rizobi da campioni di seme, questi
ultimi vengono posti direttamente in vasi contenenti agriperlite sterile e, dalle piante che si
sviluppano, vengono prelevati i tubercoli per l’isolamento. Operativamente, l’isolamento dai
tubercoli radicali avviene come segue:
ogni singolo tubercolo o gruppo di tubercoli viene disinfettato in superficie con soluzione
acquosa sterile contenente il 2% circa di ipoclorito di sodio, per un tempo di 2 minuti.
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dopo lavaggio con acqua bidistillata sterile (SDDW) per 2-3 volte, il tubercolo viene schiacciato
in tubi Eppendorf sterili in presenza di 200 μL di SDDW.
l’omogenato ottenuto viene strisciato, con un’ansa, su piastre di YEM-agar (composizione per
litro:
o mannitolo 7,5 g;
o KH2PO4 0,5 g;
o MgSO4 0,2 g;
o NaCl 0,1 g;
o estratto di lievito 0,4 g;
o pH 7,2;
o incubazione a 28 °C per 4-6 giorni.
da ognuna delle piastre di isolamento viene prelevata e purificata, per almeno due volte, una
singola colonia.
avvenuto l’isolamento in purezza, si procede alla conservazione dei ceppi.
Le comunità fungine colturabili del suolo
Le comunità fungine dei suoli hanno caratteristiche molto diverse e non possono essere valutate con
un solo metodo.
Si riportano di seguito i metodi utilizzati per 2 comunità fungine, individuate come rappresentative
per lo studio dei suoli agrari.
Per valutare le comunità dei funghi colturabili del suolo con il metodo delle diluzione seriali su agar
acqua, si parte dai campioni essiccati all’aria, come descritto nel punto precedente sulla
preparazione dei campioni.
Il suolo così preparato viene vagliato con setaccio a 4 mm. Appena il campione di suolo è pronto si
procede alla valutazione delle comunità fungine. Si prepara la soluzione madre 10-1 a partire da 3 g
di suolo in tubi Falcon di 40 ml agitando alla massima velocità con vortex per 1 min. Dalla
soluzione 10-1 si ottengono le diluizione successive 10-2, 10-3, da cui si preleva 1 mL che viene
aggiunto a 49 mL di agar acqua raffreddato a 40 °C, addizionato con 200 mg/L di streptomicina
fosfato e 2 g/L di Oxgal.
La soluzione di suolo in agar acqua ottenuta viene distribuita in più piastre Petri in modo da creare
un film sottilissimo di suolo incluso in agar che viene incubato a 24 °C per 3 giorni.
La diluizione più rappresentativa viene scelta per la conta del numero di propaguli espressi per
grammo di suolo.
Per la valutazione qualitativa le colonie fungine vengono classificate in funzione della forma.
Almeno 30 colonie per forma vengono trasferite da agar acqua ad un substrato nutritivo come PDA
per:
1. verificare la corrispondenza della specie con il simbolo di identificazione.
2. per la successiva identificazione.
I funghi endofiti
Per la valutazione dei funghi con comportamento endofita, la raccolta dei campioni di suolo avviene
con i criteri generali di raccolta del suolo precedentemente indicati. Tuttavia, in questo caso
vengono raccolti almeno 5 kg di suolo per campione, che vengono parzialmente asciugati all’aria in
ambiente fresco e sminuzzati grossolanamente a mano o con piccoli attrezzi. In funzione della
specie ospite oggetto di studio, il suolo viene distribuito in vasi di 8-10 cm di diametro o in
contenitori multifori con diametro minimo di 5 cm.
Per le colture da seme, le piantine ottenute in sterilità vengono trapiantate nei vasi con il suolo
campione, per le piante da frutto si possono utilizzare piantine micro propagate.
Coltivando le piantine per 2 mesi in serra, si ottiene una buona colonizzazione radicale del
campione.
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Dopo questa fase, le radici vengono delicatamente liberate dai residui di suolo, lavate sotto acqua
corrente per almeno 10 minuti, disinfettate con una soluzione di ipoclorito di sodio all’1% per 1
minut·o, risciacquate con acqua sterile e asciugate sotto cappa per almeno 15 minuti.
Un numero predefinito di espianti (30-50 mm) delle radici viene posto su agar acqua e incubato per
4-5 giorni.
Le colonie che partono dai singoli espianti vengono trasferite in substrato nutritivo (PDA) e
incubate per almeno una settimana. le colonie risultanti vengono sottoposte ad identificazione.
RICONOSCIMENTO DEI MICRORGANISMI COLTIVABILI
Riconoscimento dei funghi
Il riconoscimento delle specie fungine viene svolto sulla base delle comuni chiavi tassonomiche. In
alcuni casi, a conferma del riconoscimento tassonomico, viene condotta l’estrazione del DNA da
micelio con l’utilizzo di Kit specifici. Il DNA estratto viene amplificato, con primers specifici della
regione 18S o ITS di rDNA secondo il metodo descritto da Manici e Bonora (2007), e sequenziato.
L’isolato viene successivamente riconosciuto per comparazione con altri isolati eventualmente già
presenti nel database delle sequenze nucleotidiche in GenBank (Lane, 1991).
Riconoscimento dei batteri azotofizzatori aerobi
L’identificazione dei batteri azotofissatori liberi isolati dal suolo viene eseguita per via molecolare
attraverso:
il sequenziamento del gene per il 16S rDNA.
il sequenziamento di una porzione del gene nifH per la nitrogenasi reduttasi, gene specifico dei
batteri azotofissatori liberi.
A partire dal DNA genomico, estratto dalle cellule batteriche attraverso il metodo detto del CTAB,
la porzione del 16S rDNA viene amplificata utilizzando primers specifici (P0 e P6) e,
successivamente, sequenziata.
Riconoscimento dei rizobi
Il riconoscimento dei rizobi può essere eseguito adottando mezzi biologici, biochimici o molecolari.
L’ identificazione con mezzi biologici consiste nell’ eseguire saggi di nodulazione su una o più
specie di leguminose al fine di individuare la specie ed, eventualmente, la sottospecie di
appartenenza del rizobio isolato.
Questi saggi di nodulazione vengono eseguiti ricorrendo all’allevamento di piantine in vasi
contenenti agriperlite sterile. le piantine vengono ottenute dalla germinazione di semi
preventivamente disinfettati con soluzione di ipoclorito di sodio al 2% e inoculati con il ceppo
batterico da identificare.
Dopo circa 1-2 mesi di crescita, vengono eseguiti i rilievi sulle radici per verificare la presenza o
meno di tubercoli.
Il saggio di nodulazione presenta lo svantaggio di richiedere molto tempo, ma fornisce indicazioni
in merito all’ efficienza azotofissatrice dei ceppi.
L’ identificazione con mezzi biochimici si basa sul profilo catabolico mostrato dal ceppo batterico
da identificare, cioè dalla capacità o meno di utilizzare una serie di specifici composti organici.
Un sistema biochimico di identificazione semplice da utilizzare e che dà risposta in un paio di
giorni è il BIOLOG.
Questo sistema utilizza delle piastre, molto simili a quelle impiegate nei saggi ELISA, nelle quali i
96 pozzetti contengono specifici substrati che, se catabolizzati dallo specifico ceppo da identificare,
assumono una colorazione violacea (figura 6).
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indice
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Figura 6 – Sistema di identificazione BIOLOG. Il profilo
indicato dalla colorazione dei pozzetti
corrisponde ad un determinato ceppo batterico.
I metodi molecolari di identificazione dei rizobi si basano, come per la maggior parte dei batteri,
sulla reazione a catena della polimerasi (PCR).
Primers specifici per i geni nodABC sono stati disegnati per Rhizobium leguminosarum biovar
viciae.
Questo protocollo di PCR è sicuramente molto valido ma, purtroppo, permette l’identificazione
soltanto di questa sottospecie.
Diversi altri metodi molecolari, universalmente usati per la caratterizzazione e l’identificazione dei
batteri, sono stati adottati anche per i rizobi.
Tra essi si ricordano:
l’amplificazione del 16S rDNA, seguita dall’analisi di restrizione (ARDRA) o dal
sequenziamento;
l’amplificazione di specifici geni implicati nell’azotofissazione, seguita dalla restrizione o dal
sequenziamento.
Tuttavia, questi metodi sono abbastanza laboriosi nell’interpretazione dei risultati e, pertanto, non
molto adatti ad essere applicati nell’identificazione di routine.
CONSERVAZIONE
Funghi tellurici
I funghi colturabili del suolo possono essere conservati con vari metodi a seconda delle loro
caratteristiche:
Tutti gli isolati possono essere conservati come porzioni di micelio o spore concentrate in azoto
liquido (-180 °C), previo congelamento lento a -80 °C per 2-3 giorni, in acqua contenente
Dimethylsulfoxide al 10%.
Molti Ascomiceti, Oomiceti (Chromista) e Zigomiceti possono essere mantenuti in collezione in
acqua sterile (10 ml) contenuta in provette di plastica da 15 mL, in frigorifero a 4 °C.
Pochi isolati, come colonie su substrato nutritivo PDA (Potato Sucrose Agar) a 6-8 °C, in
provette di vetro con tappo a vite in silicato.
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Batteri azotofissatori liberi
I ceppi isolati sono mantenuti in collezione attraverso la preparazione di glicerolati conservati a -80
°C.
Per questo sistema di conservazione, 1 mL di coltura del ceppo, coltivato su un substrato liquido di
tipo massimo (RM, Trypticase Soy Broth. PY) viene aggiunto, in una provetta sterile per criogenia
da 2 mL con tappo a vite, ad 1 mL di glicerolo 80% (w/v) in modo da ottenere una soluzione al 40%
(w/v) finale in glicerolo. La provetta si agita energicamente per mescolare il glicerolo con la coltura
e si conserva a –80 °C.
Rizobi
La conservazione dei rizobi avviene secondo le modalità generalmente adottate per tutti i batteri
coltivabili aerobi.
Per periodi relativamente brevi (diversi mesi) i rizobi possono essere conservati in tubi di YEMagar posti in frigorifero (4 °C).
Per garantire la conservazione degli isolati per lunghi periodi (diversi anni) si ricorre alla
preparazione di liofilizzati oppure, più semplicemente, alla crioconservazione a – 80 °C. In questo
caso le sospensioni batteriche vengono concentrate (almeno 109 C.F.U/ml) in YEM-brodo
addizionato con il 20% di glicerolo.
Vista l’elevata variabilità dei rizobi dal punto di vista genetico, della specificità dell’ospite e
dell’efficienza azotofissatrice, è di estrema importanza conservare un numero molto elevato di
ceppi affinché sia ben rappresentata la biodiversità di questi simbionti. Pertanto, al fine di ridurre i
tempi e i costi della conservazione, è anche possibile crioconservare a –80 °C direttamente i
tubercoli, senza ricorrere all’isolamento dei rizobi.
MICRORGANISMI NON COLTIVABILI: ISOLAMENTO E CONSERVAZIONE
Studi relativi alla composizione e diversità delle comunità microbiche del suolo sono molto difficili
da compiere a causa della grande difficoltà che si incontra nell’isolamento e successiva coltivazione
dei diversi microrganismi.
Come accennato in precedenza, solo l’1% dell’intera popolazione microbica del suolo è coltivabile,
la restante parte non lo è.
È questa la ragione per la quale sono stati proposti metodi biochimici di caratterizzazione delle
attività metaboliche che si svolgono nel suolo, al fine di ottenere un dato sulla composizione e
sull’attività microbica in maniera dedotta.
È altrettanto noto però che alle stesse funzioni concorrono organismi diversi (ridondanza
funzionale).
Per ovviare alla difficoltà di non poter studiare l’intera popolazione microbica in vitro gli studiosi si
sono orientati all’utilizzazione di metodi di biologia molecolare che non richiedono l’isolamento e
la coltura dei microrganismi.
Essi si basano sull’estrazione dal suolo del DNA totale, dall’osservazione del quale poter poi
dedurre eventuali alterazioni in termini di richness (numero di specie presenti) ed eveness (quantità
relativa di ciascuna specie).
Per l’estrazione d·i DNA da suolo, il suolo essiccato e vagliato a 2 mm viene conservato a –20 °C o
a temperature inferiori.
L’estrazione del DNA viene svolta con l’utilizzo dei kit per estrazione di DNA da suolo, utilizzando
le istruzioni della ditta fornitrice.
Il DNA estratto viene amplificato con primers specifici per il 16S rDNA e gli amplificati vengono
clonati direttamente o previa separazione mediante Denaturing Gradient Gel Electrophoresis il cui
acronimo è DGGE (figura 7).
·
indice
29
Figura 7 – Immagine di una Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(DGGE) in cui si possono effettuare valutazioni sia in termini di
richness (numero di bande), sia di eveness (intensità delle bande).
I frammenti provenienti dalla scelta casuale dei cloni o dalle bande elettroforetiche più significative
vengono sequenziati. la collocazione tassonomica degli organismi viene poi eseguita per
comparazione con il database di sequenze nucleotidiche disponibile nel web (es. GenBank).
Conservazione del genoma del suolo
Parallelamente alla conservazione in collezione di singoli isolati microbici, possono essere
conservati suoli campione con l’intero materiale genetico, detto “metagenoma”, per un database
nazionale di campioni ambientali provenienti da siti di elevato valore agronomico o naturalistico.
Microscopia
La microscopia ottica è una tecnica di osservazione capace di produrre immagini ingrandite di
oggetti o di particolari di essi, troppo piccoli per essere osservati ad occhio nudo.
Gli strumenti utilizzati per eseguire tale tecnica prendono il nome di microscopio ottico.
Per vedere un oggetto distintamente è necessario che sulla retina (delicato strato di fibre nervose)
dell’occhio umano si formi un’immagine nitida, trasferita attraverso il nervo ottico al cervello.
Il cristallino ha le proprietà di una lente convergente in grado di modificare la sua forma e quindi la
sua distanza focale (intervallo di spazio in cui è possibile la messa a fuoco).
La sua elasticità consente all’occhio normale di “accomodarsi” per una visione distinta per tutte le
distanze comprese tra dmin = 250 mm (distanza della visione distinta più vicina all’occhio o “punto
prossimo”) e l’infinito (“punto remoto”).
Quando si vuole esaminare un piccolo oggetto nei suoi dettagli, lo si avvicina il più possibile agli
occhi, affinché l’angolo di osservazione sia il più piccolo possibile e l’immagine retinica la più
grande possibil·e,
·
indice
30
Ma come detto la minima distanza alla quale l’occhio può adattarsi per una visione distinta è quella
del punto p·rossimo.
Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso all’uso di sistemi ottici o sistemi di lenti che può
essere semplicemente una lente d’ingrandimento, fino alla tecnica microscopica ed in particolare al
microscopio.
Microscopio ottico
Il microscopio ottico è una tipologia di microscopio che sfrutta la luce con lunghezza d'onda dal
vicino infrarosso all'ultravioletto, coprendo tutto lo spettro visibile. I microscopi ottici sono
storicamente quelli più vecchi e sono anche tra i più semplici.
Vi sono tre parametri che definiscono l’efficienza di un microscopio ottico.
Ingrandimento.
Potere risolutivo.
Diffrazione.
Si definisce ingrandimento il rapporto tra le dimensioni dell'oggetto originale, e quelle
dell'immagine ottenuta.
E’ dato dal prodotto tra l’ingrandimento dovuto all’oculare (solitamente 10x) moltiplicato
l’ingrandimento dovuto agli obiettivi (solitamente 4x, 25x, 40x, 100x).
L’ingrandimento totale del microscopio ottico raggiunge quindi facilmente il fattore 1000x, ma è
inutile oltre 400x per il limite al potere risolutivo (o risoluzione) del microscopio imposto dalla
diffrazione.
L'ingrandimento, infatti, non è lo scopo principale di un microscopio ottico poiché oltre un certo
livello di ingrandimento non si possono distinguere ulteriori dettagli.
Questo limite è superabile grazie al potere risolutivo o risoluzione del microscopio ottico potere
risolutivo o risoluzione.
Il potere risolutivo di un microscopio è la distanza minima tra due punti che lo strumento consente
di osservare distinti.
Supponiamo che una certa struttura contenga due piccoli punti molto vicini. Se le immagini di
questi due punti si sovrappongono non lì si vede più come distinti, ma come una struttura unica. Se
invece l’immagine li presenta ancora separati possiamo dire che il microscopio ha risolto (cioè
separato) questi due punti.
La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione. di
solito, in un microscopio composto, la risoluzione è determinata dal sistema di lenti più vicino
all’oggetto (obbiettivo). inoltre, al fine di rendere facilmente visibili i dettagli, l'obbiettivo ed il
sistema di lenti più vicino all’occhio (oculare) hanno anche la funzione di ingrandire l'immagine ma
questa funzione, può essere considerata secondaria rispetto alla risoluzione.
In definitiva la risoluzione si ottiene quando punti oggetti molto vicini possono essere distinti come
separati.
Però la capacità di risoluzione è limitata, a sua volta dal fenomeno della diffrazione.
La diffrazione è un fenomeno fisico che si ottiene quando onde incontrano oggetti sul loro
cammino, associato anche al mezzo nel quale si tali onde si propagano.
Questo fenomeno è tipico di ogni genere di onda, come il suono, le onde sulla superficie dell’acqua
o le onde elettromagnetiche come la luce o le onde radio.
Gli effetti della diffrazione sono però rilevanti solo se un’onda incontra un ostacolo le cui
dimensioni sono comparabili o minori rispetto alla propria lunghezza d’onda. Quando ciò accade, le
due immagini non possono essere più essere viste come due immagini separate cioè non sono più
risolvibili.
Le parti del microscopio sono:
stativo: braccio robusto del microscopio.
·
indice
31
tasto luce: permette di accendere e spegnere la lampada.
ripiano portavetrino: il piano su cui si appoggia il vetrino da osservare.
ferma-vetrino: levetta metallica angolare posta sul ripiano porta-vetrino. permette di bloccare il
vetrino porta-oggetti.
tavolino traslatore, che permette di spostare facilmente il vetrino in maniera controllata tramite
una o due viti.
obiettivi: ciascun microscopio ha tre o quattro obiettivi. insieme l’obiettivo e l’oculare formano
l’immagine ingrandita che viene osservata. nella parte centrale del corpo di ciascun obiettivo è
indicato il fattore d’ingrandimento 4x, 10x, 40x, 100x.
oculari regolabili: sono le lenti attraverso le quali si effettua l’osservazione. da un lato hanno
inciso il numero 10x che rappresenta il loro fattore d’ingrandimento.
regolatore dell’intensità luminosa: permette di variare l’intensità luminosa del campo mediante il
controllo della tensione applicata alla lampada.
vite macrometrica o cursore: è la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco,
permette di fare spostamenti sensibili del tavolino porta preparati, avvicinandolo o
allontanandolo dall’obiettivo, fino a quando non si rende visibile il preparato, la si usa solamente
con l’obiettivo più piccolo il 4x.
vite micrometrica o microcursore: più piccolo della precedente è coassiale con essa. permette la
regolazione fine della messa a fuoco. Perché gli obiettivi sono parafocali, questa è l’unica
manopola che è necessario regolare per mettere a fuoco il preparato, quando si passa da un
obiettivo all’altro (tutti gli obiettivi sono costruiti in modo da mettere a fuoco il preparato,
usando la stessa distanza di lavoro, cioè quella tra il vetrino e obiettivo, e sono detti parafocali).
Microscopi ottici e affini
Il microscopio ottico (LM) tradizionale (LM acronimo di light microscope) è il più semplice. Per
mezzo di lenti ingrandisce l'immagine del campione, illuminato con luce nell'intervallo spettrale del
visibile.
Il microscopio ottico può essere semplice (un solo sistema di lenti o addirittura una sola lente) o
composto (almeno due sistemi, oculare ed obiettivo).
L'illuminazione può raggiungere il campione da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o esserne
riflessa (luce riflessa).
Il microscopio ottico permette di avere immagini di soggetti dimensionalmente collocati all'incirca
tra il millimetro ed il micrometro, anche di esseri viventi.
I primi esempi di ingrandimento ottico datano migliaia di anni e risalgono alle civiltà
mesopotamiche.
Nel 1648 Antonio van Leeuwenhoek osservò e descrisse numerosi microorganismi, utilizzando un
microscopio semplice, inizialmente dotato di pochi ingrandimenti e poi perfezionato fino a
raggiungerne alcune centinaia (275 accertati, 500 ipotizzati).
Nel 1665 Robert Hooke, utilizzando una forma molto rudimentale di microscopio ottico composto,
con un limitato potere di ingrandimento ed osservando il sughero vide e descrisse per la prima volta
la struttura cellulare propria di tutti i viventi.
Si considerano nella classe dei microscopi ottici anche strumenti affini, come i microscopi
nell'ultravioletto, che benché sfruttino frequenze non visibili hanno principi e tecnologie simili.
Monoculari e Binoculari
In testa alla lista delle tipologie strumentali va premesso che ogni microscopio a visione diretta può
essere fornito di un solo oculare di osservazione, come pure di un sistema per la visione binoculare,
con entrambi gli occhi.
I modelli monoculari permettono uno schema costruttivo più semplice ed economico, riducono le
perdite di luminosità, permettono con semplicità di proiettare l'immagine su un sistema di
registrazione della stessa.
32
I sistemi binoculari permettono a scapito della semplicità costruttiva e dell'economicità una visione
più comoda, specie per lunghi periodi d'osservazione. I sistemi stereoscopici sono ovviamente
obbligatoriamente binoculari.
Costruttivamente, le teste binoculari, o multioculari, nel caso di ulteriori deviazioni a strumenti di
ripresa e misura, vengono realizzate con sistemi ottici di prismi, che prima suddividono il fascio
luminoso, in genere con un sistema di prismi triangolari incollati e poi, nei due percorsi ottici lo
riportano con un sistema di prismi di Porro o di Porro-Abbe, sul piano focale dei due oculari.
Il sistema induce ovviamente ulteriori aberrazioni, dovute in massima parte alle proprietà di
dispersione ottica degli elementi, che devono essere dovutamente valutate calcolate e compensate.
Fenomeni di sommatoria binoculare, ovvero dove la soglia di rilevamento di uno stimolo è più
bassa con due occhi che con uno inducono ulteriormente a diffondere i sistemi binoculari.
Ci sono due forme. In primo luogo, quando si cerca di rilevare un segnale debole, c'è un vantaggio
statistico nell'utilizzare due rivelatori.
Matematicamente, il vantaggio è uguale alla radice quadrata di 2, circa 1.41.
In secondo luogo, quando alcune cellule della corteccia visiva ricevono segnali da entrambi gli
occhi contemporaneamente, essi mostrano l'agevolazione binoculare, un maggiore livello di attività
rispetto alla somma delle due attività evocate separatamente da ciascun occhio.
Il vantaggio d'usare due occhi con attività di rilevazione 1,41 è chiamato sommatoria neurale.
Fenomeni d'interazione binoculare, oltre alla sommatoria bioculare possono inoltre influenzare a
vicenda i due occhi in almeno tre modi:
Diametro pupillare.
Sistemazione e convergenza
Trasferimento endoculare
Questi fenomeni spiegano in gran parte la spontanea preferenza nell'utilizzo dei sistemi binoculari,
specie nell'uso prolungato.
Microscopio semplice a luce trasmessa
Come nei primi esemplari di van Leeuwenhoek si tratta di una semplice lente o sistema di lenti (un
doppietto frequentemente) con una serie di supporti per il campione ed un sistema elementare di
spostamento dell'ottica per la messa a fuoco.
Microscopio semplice a luce riflessa
Come il precedente, l'illuminazione in questo caso è frontale o laterale, il caso tipico è la lente
contafili in uso in filatelia e nel controllo dei filati dell'industria tessile.
Microscopio composto a luce trasmessa
È un microscopio che, permette di vedere i particolari del campione utilizzando luce trasmessa
attraverso lo stesso, proveniente da una piccola lampadina incorporata o indirizzata tramite uno
specchio da una sorgente esterna (figura 8).
Rappresenta il microscopio per antonomasia e viene utilizzato largamente in applicazioni didattiche,
scientifiche, tecniche ed industriali in un intervallo di ingrandimenti compreso generalmente tra le
decine ed il migliaio.
Nei primi esemplari storici si utilizzava luce diurna o luce proveniente da una candela o lampada ad
olio.
Negli esemplari di uso corrente la sorgente più convenientemente utilizzata è una lampada alogena.
Da notare che nei microscopi composti, in genere senza particolari accorgimenti l'immagine
osserv·ata risulta invertita e capovolta.
·
indice
33
Figura 8 - Un modello
base di microscopio
ottico composto, di
marca Leitz, ora Leica.
Design industriale anni
sessanta ma di struttura
concettualmente
moderna. La messa a
fuoco avviene variando
la distanza tra il
preparato e l’obiettivo,
muovendo, in questo
caso, il tavolino sul
quale si trova il
preparato. Illuminatore
incorporato nello
strumento.
1. Tubo verticale per
fotografia.
2. Oculare.
3. Stativo.
4. Revolver porta
obbiettivi con
obbiettivi.
5. Tavolino portaoggetti.
6. Condensatore con
diaframma e contrasto
di fase.
7. Manopole di messa a
fuoco (vite
macrometrica e vite
micrometrica).
8. Sorgente di luce
inserita nella base.
Microscopio composto a luce riflessa
Come il precedente, l'illuminazione in questo caso proviene dall'alto, tramite diversi sistemi.
Focalizzazione della sorgente tramite specchi, sistemi a fibre ottiche, LED, epi-illuminazione (che
sfrutta lo stesso obiettivo anche per illuminare il campione).
Stereomicroscopio
Il microscopio stereoscopico, noto anche come stereomicroscopio, microstereoscopio o
dissezionatore, è uno strumento progettato in modo differente dal microscopio ottico convenzionale,
e per una differente finalità (figura 9).
Utilizza due percorsi ottici separati, diversamente allineati tra loro ed entrambi terminanti con due
obiettivi e due oculari. questi due percorsi ottici provvedono agli occhi destro e sinistro delle
immagini diversamente angolate. In questo modo viene prodotta una visione stereoscopica del
campione in esame.
34
Figura 9 - Stereomicroscopio a
basso ingrandimento. Permette la
visione stereoscopica del
campione ed è usato per studi di
Sistematica, per piccole
dissezioni, per la conta delle
colonie batteriche e per la
preparazione dei pezzi da
osservare poi con gli altri più
potenti tipi di microscopio. Questo
strumento è anche molto usato
nelle indagini della Polizia
scientifica.
Il microscopio stereoscopico viene usato spesso per studiare le superfici di un campione solido o
per eseguire attività come classazione glanulometrica, dissezione, determinazione di
macroinvertebrati, microchirurgia, orologeria, produzione o ispezione di piccole piastre per circuito
stampato, e simili.
Diversamente dai microscopi composti, in un microscopio stereoscopico, il più delle volte,
l'illuminazione si ottiene per riflessione piuttosto che per trasparenza, cioè la luce è riflessa
dall'oggetto anziché ricorrere alla luce che lo attraversa. L'uso della luce riflessa dall'oggetto
consente l'esame di campioni che sarebbero troppo spessi o altrimenti opachi per la microscopia
tramite microscopi composti. Tuttavia, i microscopi stereo possono altrettanto bene impiegare
l'illuminazione trasmessa, tipicamente con una lampada o uno specchio al disotto di un supporto
trasparente posto al disotto dell'oggetto, tuttavia diversamente dal microscopio composto, nella
maggioranza dei sistemi stereoscopici l'illuminazione per trasparenza non è focalizzata attraverso
un condensatore.
Grande distanza di lavoro e profondità di campo sono qualità importanti per questo tipo di
microscopio. Entrambe queste qualità sono correlate inversamente con il potere risolutivo:
maggiore è il potere risolutivo (cioè, più piccola è la distanza alla quale due punti adiacenti si
possono distinguere), minore è la profondità di campo e la distanza di lavoro. Un microscopio
stereoscopico ha un ingrandimento ragguardevole fino a 100x.
35
Due tipi prevalenti di sistemi d'ingrandimento sono riscontrabili nei microscopi stereoscopici. Uno è
ad ingrandimento fisso nel quale l'ingrandimento è ottenuto con l'appaiamento di due obiettivi ad
ingrandimento non variabile. L'altro è ad ingrandimento variabile, che è capace di una variazione
continua del grado di ingrandimento all'interno di un intervallo prefissato. I sistemi ad
ingrandimento variabile possono raggiungere un ingrandimento ulteriore tramite l'uso di obiettivi
ausiliari che accrescono l'ingrandimento totale con un coefficiente impostato. Inoltre,
l'ingrandimento totale in entrambi i sistemi ad ingrandimento fisso e variabile può venire variato col
cambiare gli oculari.
Un sistema ottico attribuito a Galileo, ovverosia il telescopio galileiano, è un sistema intermedio tra
i sistemi ad ingrandimento fisso e quelli ad ingrandimento variabile, ma con la distinzione precisa
che gli stessi componenti ottici nella stessa spaziatura, se fisicamente invertiti, si risolvono in un
ingrandimento differente sebbene ancora fisso. Ciò consente ad un insieme di lenti di fornire due
ingrandimenti differenti. due insiemi di lenti, su una torretta, forniscono quattro ingrandimenti. tre
insiemi di lenti forniscono sei ingrandimenti ed ancora nella medesima torretta. La pratica
esperienza mostra che tale sistema ottico Galileiano è tanto utile quanto un più costoso sistema ad
ingrandimento variabile, con il vantaggio di conoscere l'ingrandimento utilizzato come un valore
predefinito, senza dovere leggere delle scale analogiche.
Il microscopio stereoscopico non dovrebbe venire confuso con un microscopio binoculare composto
e un binoviewer. In tale microscopio entrambi gli occhi vedono la medesima immagine, ma gli
oculari binoculari forniscono maggiore conforto visivo. Comunque, l'immagine in tale microscopio
non è differente da quella che si ottiene con un singolo oculare monocolare.
Microscopio polarizzatore
Il microscopio polarizzatore sfrutta un fascio di luce polarizzata di dato orientamento che attraversa
il corpo del preparato, posto su un tavolino rotante, per venire poi analizzato da un secondo filtro
polarizzatore, anch'esso orientabile e in genere posto sul piano posteriore dell'obiettivo. Questo tipo
di microscopio è molto utilizzato in petrografia, cioè nello studio delle rocce e dei minerali che le
compongono. La microscopia in luce polarizzata utilizza onde ciascuna delle quali oscilla in un
piano, detto piano di vibrazione o piano di polarizzazione che è perpendicolare alla direzione di
propagazione dell’onda stessa. In un raggio di luce normale le onde oscillano in tutti i possibili
piani. Definiamo polarizzato un raggio di luce formato da onde i cui piani di vibrazione sono tutti
orientati in un’unica direzione, sono cioè paralleli fra loro.
Microscopio a contrasto di fase
È un tipo particolare di microscopio che analogamente al microscopio a luce trasmessa lavora nel
campo del visibile. Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa.
Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in
due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza. Il cambiamento ulteriore di fase
dovuto alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con la luce non
rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del
mezzo.
In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche
a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta
oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che
dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata.
Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e
convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di
cellule e tessuti analizzati.
Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita
in apposite colture in vitro. Infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di
coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati
36
molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. La tecnica in questione fu messa a punto
dal fisico olandese Frederik Zernike (Frits Zernike) negli anni trenta e gli valse il Premio Nobel per
la fisica nel 1953.
Microscopio ad interferenza
Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti
visibili in campo chiaro. Combina effetti di interferenza e di polarizzazione e fornisce immagini più
contrastate e con un effetto di tipo tridimensionale. Questo metodo di contrasto è conosciuto anche
con il nome di "DIC" (differential interference contrast). Una delle due tecnologie più utilizzate è la
Nomarski, dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova in diffusi microscopi
odierni a contrasto interferenziale.
Ultramicroscopio
L'ultramicroscopio ed il microscopio in campo oscuro, sono microscopi ottici con un condensatore
paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo anulare che ferma i raggi
che illuminerebbero direttamente il preparato.
Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati (rifratti) oppure
diffratti.
La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene
operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni submicroscopiche comprese fra 0,1
micrometro e 1 nanometro, particelle che, pur sotto la soglia di risoluzione del microscopio,
appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici (effetto Tyndall).
Microscopio a fluorescenza
Strutturalmente esisterebbero sistemi a luce trasmessa e riflessa, ma per motivi tecnici i primi sono
stati relegati ad usi limitati, su campioni opachi.
La maggior parte della produzione ed uso prevede sistemi ad epifluorescenza. Questo tipo di
microscopio serve per osservare preparati naturalmente fluorescenti, o legati con molecole
fluorescenti o rese tali da particolari coloranti detti fluorocromi. Questi composti vanno
selettivamente a legarsi con strutture cellulari definite.
La sorgente luminosa (alogena di alta potenza, lampada di Wood, lampada ad arco e scarica di gas e
più recentemente diodi LED ad alta efficienza e laser), che trasmette radiazioni ultraviolette, o
comunque di bassa lunghezza d'onda nel visibile, eccita il preparato generalmente dall'alto (sistemi
ad epifluorescenza).
Le componenti del preparato emettono luce di lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla
sorgente luminosa. Questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza.
Attualmente gli utilizzi più diffusi prevedono l'utilizzo di anticorpi specifici, appositamente prodotti
per andare a legarsi con determinate molecole nel campione (che rappresentano l'antigene)
utilizzando fluoresceina, rodamina, ed altre simili molecole come fluorocromo legato all'anticorpo
per renderlo appunto fluorescente e visibile.
Nell’osservazione è fondamentale l'utilizzo corretto dei filtri ottici per selezionare la giusta
lunghezza d'onda di eccitazione, la giusta lunghezza d'onda di emissione visibile, e l'arresto della
radiazione ultravioletta che danneggerebbe l'occhio dell'osservatore.
Gli obiettivi microscopici usati per questo tipo di osservazione non devono contenere lenti che
presentino fenomeni di autofluorescenza (come spesso succede per quelli alla fluorite), devono
trasmettere l'ultravioletto (se in epifluorescenza, visto che l'illuminazione passa attraverso
l'obiettivo), mentre il grado di correzione cromatico è poco influente sulla qualità dell'immagine,
per cui vanno generalmente bene le ottiche acromatiche.
Il Vertico SMI combina, infine, la microscopia con la modulazione spaziale dell'illuminazione
raggiungendo risoluzioni inferiori ai 10 nanometri (1 nanometro = 1 nm = 1 × 10−9 m), come si
osserva in figura 10.
37
Localizzazione di YFP molecole in cellula
(15 nm distanza) SPD Mphymod tecnologia.
Colocalizzazione di GFP e RFP molecole (120.000
molecole) 2CLM tecnologia.
Figura 10 - Super risoluzione di GFP con il microscopio Vertico SMI di Christoph Cremer.
Microscopio confocale
Il microscopio confocale si basa su una tecnologia ottica volta ad accrescere sensibilmente la
risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco
del preparato (figura 11).
Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk),
Programmable Array Microscopes (PAM), laser.
Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning
Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema
precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo.
La sua sorgente luminosa è costituita uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni
diversa frequenza d'eccitazione.
Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le
immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di relazione, sono
particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare in diversi colori diverse
molecole presenti nel preparato, permettendone di apprezzarne la tridimensionalità (esempio actina
in rosso tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu).
·
·
indice
38
Figura 11 - Immagine al
confocale. La
tubulina di alcune
cellule di endotelio
colorata in verde da
anticorpi coniugati
alla fluoresceina, la
actina colorata da
Texas red coniugato
alla falloidina in
rosso, ed il dna
colorato in azzurro
dal DAPI
Microscopio nell'ultravioletto
Il limite principale della microscopia ottica sta nella risoluzione massima, strettamente legata al
fenomeno della diffrazione.
Il criterio di Abbe limita la risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per un sistema ottico avente
apertura numerica n sin θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ.
Per luce nello spettro visibile essa si attesta circa a 0,2 µm, dati i limiti teorici imposti dalla
massima apertura numerica di una lente.
Un sistema per superare il limite è spostarsi su lunghezze d'onda nello spettro appartenente
all'ultravioletto. Si riesce così ad incrementare notevolmente la risoluzione, ma i problemi tecnici
derivanti dalla non visibilità dell'ultravioletto (occorrono schermi fluorescenti o la fotografia
dell'immagine), alla trasparenza delle ottiche (in quarzo), ed alla dannosità della radiazione per gli
organismi viventi, con l'avvento dei microscopi elettronici a basso costo hanno limitato molto
ulteriori sviluppi di questo strumento.
Prima di concludere questo capitolo riguardante la microscopia ottica, si vogliono fornire alcune
indicazioni pratiche ed alcune regole sull’impiego di questi strumenti d’indagine che sono delicati e
costosi.
Uso del microscopio ottico
1. se, eventualmente, c’è la necessità di spostare il microscopio (figura 8) non usare le parti
mobili, ma impugnare lo stativo, mettendo contemporaneamente una mano sotto al
microscopio;
2. accendere la luce e regolarne l’intensità, agendo sulla manipola del voltmetro a cui è collegato
l’impianto elettrico del microscopio;
3. posizionare il vetrino sul ripiano porta-vetrino del tavolino e bloccarlo con la levetta fermavetrino;
4. posizionare il vetrino al centro del fascio luminoso utilizzando la vite (o le viti) per il
movimento del ripiano traslatore. Tali viti permettono l’osservazione di tutto il preparato, una
volta operata la messa a fuoco;
5. cominciare l’osservazione utilizzando sempre per primo l’ingrandimento minore (4x) tra gli
obiettivi a vari ingrandimenti, poiché il campo visivo per il minore ingrandimento è più vasto e
consente una la visione di una superficie maggiore di preparato istologico;
6. regolare la distanza interpupillare cambiando la posizione reciproca dei due tubi porta-oculari,
avvicinandoli o allontanandoli tra loro, direttamente o mediante la vite di regolazione.
39
L’osservazione del preparato del vetrino va effettuata usando, contemporaneamente, ambedue
gli occhi;
7. aggiustare l’intensità del fascio luminoso utilizzando la levetta del diaframma o la manopola
(posta sul voltmetro) che controlla la regolazione dell’intensità della sorgente luminosa;
8. effettuare una prima messa a fuoco grossolana usando la vite macrometrica. Dopo questa
operazione tale vite non si deve più toccare. Infatti, essendo gli obiettivi parafocali, una volta
effettuata la prima messa a fuoco con il 4x essa sarà mantenuta anche per gli ingrandimenti
maggiori che saranno pressoché a fuoco;
9. effettuare una seconda e fine messa a fuoco. Usando la vite micrometrica e spostando
leggermente avanti e indietro tale vite micrometrica (fochettamento) sarà possibile una
migliore definizione dei particolari;
10. passando all’obiettivo 10x o al 40x bisognerà usare solamente la vite micrometrica per
ottimizzare la messa a fuoco. Qualora il punto che si stava osservando con gli ingrandimenti
alti esca dal campo visivo bisogna ricominciare l’osservazione dall’ingrandimento 4x;
11. usare l’obiettivo ad immersione per avere ingrandimenti maggiori, avendo cura d’interporre,
tra la lente frontale di tale obiettivo e la superficie superiore esterna del vetrino copri-oggetto,
l’olio di cedro;
12. terminata l’osservazione riposizionare l’obiettivo 4x e spegnere la lampada dall’interruttore.
Regole per l’uso del microscopio
Il microscopio è uno strumento delicato e costoso ed è quindi opportuno trattarlo con cura
ricorrendo alcune norme di buon senso che di seguito si ricordano.
a. Per spostare il microscopio da un tavolo di lavoro ad un altro bisogna afferrarlo con una mano per
il braccio dello stativo e mettere l’altra mano sotto la base.
b. Durante lo spostamento ed il posizionamento sul tavolo di lavoro evitare di far prendere dei colpi
allo strumento.
c. Quando si condivide il microscopio con un collega e si vuol fare osservare il preparato, bisogna
evitare di spostare il microscopio, trascinandolo sul tavolo, perché a causa delle vibrazioni che
ne derivano l’apparecchio potrebbe danneggiarsi. E’ preferibile cedere il posto, lasciando
immobile il microscopio.
d. Lavorare con il microscopio di fronte disponendo il notes per gli appunti o disegni di lato; non il
contrario. L’osservazione, in questo modo, è facilitata e non si corre il rischio di urtare o far
cadere accidentalmente il microscopio dal tavolo.
e. Pulire le lenti quando è necessario. Quando gli oculari o gli obiettivi sono sporchi è ovvio che la
qualità della visione ne risente, per cui si rende necessario procedere alla pulizia delle lenti, in
particolare quando si è usato un mezzo (olio di cedro) che riduce la diffrazione del raggio
luminoso al suo passaggio dalla lente frontale dell’obiettivo ad immersione al vetrino.
f. Per pulire le lenti bisogna usare la carta speciale per lenti ed acqua distillata. Non usare mai
tessuto comune o strofinare una lente quando è asciutta.
Osservazioni al microscopio elettronico
Microscopio Elettronico a Trasmissione ( M.E.T.)
La formazione dell'immagine nel microscopio elettronico a trasmissione (TEM) dipende dalla
dispersione degli elettroni, prodotta dalle diverse parti del campione. Se non ci fosse nessun
campione, il raggio emesso illuminerebbe in maniera uniforme lo schermo. Quando un campione
viene inserito sul percorso del fascio elettronico, una percentuale di elettroni colpisce gli atomi del
campione, viene deviato di un certo angolo e non partecipa alla formazione dell'immagine perché
non passa attraverso la piccolissima apertura della lente dell'obiettivo. Il materiale biologico ha una
bassa capacità di disperdere gli elettroni, perciò per ottenere un contrasto i campioni vengono
preparati con soluzioni di metalli pesanti, che si legano con differente affinità alle diverse parti del
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campione, per esempio un preparato cellulare. All'interno del TEM, le parti della cellula che hanno
legato più metalli permettono un minor passaggio di elettroni, e lo schermo in quel punto sarà più
scuro, mentre dove si è legato meno metallo, più elettroni passeranno lo schermo sarà più luminoso.
Il TEM viene utilizzato per l'esame approfondito della struttura interna delle cellule.
Il microsopio elettronico a trasmissione è costituito da:
una colonna cilindrica alta, cava e sottovuoto, all'interno della quale passa il fascio di elettroni.
La parte superiore della colonna contiene il catodo, un sottile filamento di tungsteno che quando
viene riscaldato agisce come fonte di elettroni.
dei potenti elettromagneti, che sostituiscono le lenti, che consentono di accelerare gli elettroni in
un fascio sottile e di deviare il fascio elettronico nel suo cammino, mettendolo a fuoco. Sono
presenti tre tipi di lenti-magneti: le lenti del condensatore (che mettono a fuoco il raggio di
elettroni sul campione), le lenti dell'obiettivo (che raccolgono l'immagine) e le lenti dell'oculare
(che ingrandiscono l'immagine ulteriormente).
una consolle con il quale è possibile eseguire le operazioni nella colonna, cioè fornire una
determinata corrente per controllare la forza dei magneti. Modificando la corrente applicata alle
varie lenti del microscopio l'ingrandimento può variare da 1000 a 250.000 volte.
uno schermo alla base della colonna che raccoglie l'immagine finale, quella vista
dall'osservatore. Gli elettroni che colpiscono lo schermo eccitano la copertura di cristalli
fluorescenti, che emettono luce visibile, percepita come un'immagine.
Nella figura 12, si riporta lo schema di funzionamento di un microscopio elettronico a trasmissione
(a sinistra) ed un moderno microscopio elettronico a trasmissione (a destra).
Figura 12 - Schema di funzionamento di un microscopio elettronico a trasmissione (a sinistra) ed un
moderno microscopio elettronico a trasmissione (a destra)
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Il TEM viene frequentemente utilizzato nella ricerca per visualizzare parti subcellulari, come gli
organuli (nucleo, mitocondri, lisosomi, perossisomi, reticolo enoplasmico, apparato di Golgi), o i
grossi complessi macromolecolari (ribosomi). E' possibile anche, mediante l'utilizzo di anticorpi
coniugati con particelle metalliche (solitamente oro) marcare specificamente delle proteine ed
individuarle all'interno della cellula.
Microscopio elettronico a scansione (S.E.M.)
Il microscopio elettronico a scansione (Scansion Electron Microscope) fornisce informazioni
sull’aspetto, sulla natura e sulle proprietà di superfici e degli strati sottostanti di campioni
solitamente solidi, con risoluzione media di 2÷5 nanometri (riferita al segnale “generato” dagli
elettroni secondari).
Schematicamente è costituito da:
emettitore di elettroni;
lenti per la focalizzazione e per la scansione del fascio;
fenditure per la collimazione del fascio;
camera porta campione con uscite per la rilevazione dei segnali.
Nella figura 13 è riportato lo schema di come è costituito il microscopio elettronico a scansione.
Figura 13 – Schema di microscopio elettronico a scansione.
Funzionamento. Funziona in un modo analogo ad un sistema televisivo a circuito chiuso. La base
del SEM consiste in un fascio di elettroni generato da un cannone elettronico (catodo) situato sulla
sommità della colonna, il fascio è attratto verso l'anodo, condensato da lenti collimatrici e
focalizzato sul campione attraverso lenti obiettivo.
Il fascio elettronico colpisce il campione, producendo tra l'altro, elettroni secondari e retrodiffusi.
Questi elettroni sono raccolti da un detector per elettroni secondari ed uno per elettroni retrodiffusi,
convertiti in segnali elettrici ed amplificati.
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Questi vengono convertiti in pixels ed elaborati da un sistema computer. Quando una superficie è
investita da elettroni ad elevata energia sono prodotti diversi tipi di segnali, così come rappresentato
nella figura 14.
Figura 14 – Schema di funzionamento del microscopio
elettronico a scansione
Quando una superficie è investita da elettroni ad elevata energia sono prodotti diversi tipi di segnali.
Alla base della microscopia elettronica a scansione sono principalmente due i segnali che
interessano:
elettroni secondari o segnale SE (Secondary Electron).
elettroni retroddifusi (backscatterati).
1. Immagini in elettroni secondari (topografia, morfologia)
Gli elettroni secondari, o segnale SE (Secondary Electron), sono definiti convenzionalmente
come gli elettroni uscenti dal campione con energia minore o uguale a 50 eV. Essi provengono
da una profondità di pochi nm e forniscono informazioni sulla topografia delle superfici e sulla
presenza e distribuzione di campi magnetici o elettrici. L’immagine fornita da tali elettroni
appare in rilievo, come se l’osservatore fosse allo stesso livello del diaframma interno e
guardasse l’oggetto illuminato da un’ipotetica sorgente situata in corrispondenza del rilevatore.
L'immagine è formata dagli elettroni secondari estratti dal campione in seguito all'interazione
con il fascio degli elettroni primari. Ideale per osservare dettagli minutissimi nella morfologia
del campione, variando l'energia del fascio è possibile vedere i dettagli della reale superficie del
campione (fascio a bassa energia) o rendere la superficie "trasparente" (fascio ad alta energia)
Gli elettroni retrodiffusi, o segnale BSE (Back-Scattered Electron), sono elettroni di energia
maggiore di 50 eV che derivano principalmente dalle interazioni del fascio primario con i nuclei
degli atomi del campione. Gli BSE forniscono informazioni riguardo al numero atomico medio
della zona di provenienza (circa qualche μm), alla topografia e alla struttura cristallina del
campione.
2. Immagine in elettroni retrodiffusi (composizione, topografia)
Nell'immmagine il contrasto è funzione delle differenze di numero atomico degli elementi
presenti sulla superficie del campione. La risoluzione del segnale degli elettroni retroduffusi
(BE) è inferiore a quella raggiunta con gli elettroni secondari (SE).
Il SEM ha una grande profondità di campo che permette ad una vasta parte del campione di
essere a fuoco contemporaneamente.
La progettazione delle camere porta campioni è realizzata in modo da facilitare lo scambio dei
campioni facendo variare di poco la pressione da quella ambientale a quella di esercizio.
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Il porta campioni inoltre può variare nelle direzioni X, Y e Z, ruotando intorno ad essi, per
esaminare il campione in ogni punto.
Nella figura 15 viene mostrata la camera ed il tavolino portacampioni:
Figura 15 - La camera ed il tavolino portacampioni del SEM.
Il SEM produce immagini ad alta risoluzione, ciò significa che particolari molto vicini tra loro
possono essere esaminati ad alti ingrandimenti.
Per questa ragione il SEM può realizzare un’immagine che è una buona rappresentazione
tridimensionale della superficie del campione.
Il microscopio elettronico a scansione ha la possibilità di rilevare elettroni secondari e retrodiffusi in
condizioni di vuoto variabile.
Per le osservazioni è necessario però che il campione sia conduttore.
Per i campioni conduttori di elettricità lo studio si presenta facile, poiché il flusso di elettroni a terra
non è ostacolato riducendo al minimo gli inconvenienti dovuti all’accumulo di cariche. Inoltre
essendo dei buoni conduttori di calore, la degradazione termica è minima.
Materiali non conduttori sono metallizati, cioè ricoperti con un sottile strato di oro o carbone,
utilizzando uno sputter/vaporizzatore.
Lo strumento può essere dotato di un accessorio per osservazioni di campioni in criogenia (CRIOSEM) in condizioni di vuoto variabile, in tale tipo di analisi è necessario fornire le informazioni sui
valori di temperatura e pressione in cui la fase che si vuole osservare risulta stabile.
Il microscopio ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope)
Il microscopio ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope) si presenta non solo come
una naturale evoluzione della microscopia elettronica a scansione dal punto di vista elettronico ed
informatico, ma come nuovo approccio concettuale che consente di superare il vincolo imposto
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dalla necessità di operare, come nei microscopi elettronici convenzionali, in condizioni di vuoto
elevato.
Nella figura 16 è riportata l’immagine di un microscopio ESEM, con tutti gli accessori di
informatica.
Figura 16 – Microscopio ESEM con accessori informatici
Il diverso funzionamento si basa sull’esistenza di una colonna che può lavorare, oltre che in
modalità convenzionale (vuoto elevato in tutta la colonna), anche in modalità controllata di vuoto
differenziale, elevato nella zona della colonna vera e propria (zona filamento e zona lenti), minore
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in prossimità del diaframma finale e decisamente più basso nella camera vera e propria ove viene
posto il campione, pur mantenendo la risoluzione del SEM convenzionale (circa 4 nm).
Nella figura 17 viene riportato lo schema del SEM convenzionale, con valori di pressioni differenti
tra la colonna e la camera del preparato.
Figura 17 - Schema del SEM convenzionale, con valori di pressioni differenti tra la colonna e la
camera del preparato.
È stata sviluppata una tipologia di rivelatori che possono operare in presenza di gas (vapor d’acqua
o altro gas) all’interno della camera, potendo così sfruttare il segnale prodotto dal campione
bombardato dal fascio elettronico e amplificato per “effetto valanga” dallo stesso gas flussante
(figura 18). Il gas ottimale è il vapor acqueo.
Il rivelatore ESD (Environmental Secondary Detector) amplifica il segnale generato dagli elettroni
secondari sfruttando il gas presente nella camera.
Le pressioni che si raggiungono nel cannone elettronico sono 107 torr. nella colonna: 105 torr–102
torr. nella camera del preparato 10 torr.
Si ottengono in questo modo due effetti:
1. il primo è l’estrazione e neutralizzazione di cariche in eccesso dalla superficie del campione,
cariche che altrimenti creerebbero un campo elettrostatico sul campione impedendone
l’osservazione, questo consente l’osservazione di campioni anche isolanti senza dover rendere
conduttiva la loro superficie;
2. il secondo è la produzione di un segnale morfologico proporzionale agli elettroni secondari
rimossi dalla superficie del campione, dando la possibilità di un’osservazione superficiale di
buona qualità.
Le condizioni sperimentali, all’interno della camera, possono essere scelte via software (pressione,
temperatura, energia e corrente del fascio primario sul campione, modalità di raggiungimento delle
condizioni dinamiche di P e T sul preparato da osservare).
Per il controllo della pressione si agisce su valvole di ingresso del gas (normalmente vapori di
acqua) e sull’aspirazione del sistema pompante, fino al raggiungimento della P impostata, il cui
valore può essere modificato in modo continuo anche durante l’esperimento.
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Per il controllo in temperatura viene utilizzato un sistema con celle Peltier su cui viene posto il
materiale da osservare, questo dispositivo può operare a ±15 °C rispetto alla T del liquido
refrigerante (normalmente acqua) che circola a contatto con le celle Peltier, proveniente da un
sistema (bagno termostatato) esterno.
Figura 18 – Rivelatore operante con vapor d’acqua e gas ausilare.
Allestimento di preparati biologi per l’osservazione al microscopio elettronico. Per allestire
preparati biologi per l’osservazione al microscopio elettronico occorre:
garantire la massima conservazione delle strutture;
permettere la preparazione di campioni sottili e resistenti all'impatto con gli elettroni ed
attraversabili dal fascio elettronico del microscopio con minimi effetti collaterali:
Preparazione dei campioni. Le diverse fasi della preparazione dei tessuti sono simili a quelle
correntemente usate per la microscopia ottica:
Prelievo: è l’operazione fisica con cui si ottiene il campione da esaminare.
Fissazione: è il procedimento con cui si bloccano i processi di degradazione del tessuto prelevato
rendendolo stabile nel tempo e inalterabile all’azione dei successivi trattamenti.
Disidratazione: è il procedimento che permette di sostituire l’acqua contenuta nel tessuto con un
solvente delle resine.
Inclusione in paraffina/resina: è la procedura necessaria per sostituire il solvente con un
materiale in genere idrofobico ed indurente che permette al campione di avere le caratteristiche
necessarie per un taglio di sezioni sottili e resistenti.
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Sezionamento al microtomo/ ultramicrotomo: è il procedimento per ottenere sezioni sottili di
tessuto di circa 1mm per l’indagine preliminare al microscopio ottico e di sezioni di circa 100nm
dette fini od ultrasottili per l’osservazione con il microscopio elettronico.
Colorazione/contrasto: è il trattamento del campione con soluzioni coloranti (per microscopia
ottica) o con sali di metalli pesanti opachi agli elettroni (per la microscopia elettronica) in grado
di aumentare il contrasto fra le diverse componenti del tessuto e delle cellule.
Preparazione campione per l’osservazione al SEM. Lo scopo è quello di rendere il campione
biologico stabile sotto il fascio elettronico.
Un campione biologico è costituito per il 70-80% di acqua.
Se viene posto nel SEM, senza preparazione, l’acqua evaporerà istantaneamente con conseguente
contrazione del campione. E’ necessario sottoporre il campione ad una serie di passaggi preparativi:
Fissazione: è il processo con cui le strutture interne ed esterne delle cellule vengono conservate e
bloccate (fissate) nelle loro posizioni.
Questa procedura inattiva gli enzimi che potrebbero alterare la morfologia cellulare e stabilizza la
struttura della cellula in modo tale da evitarne qualsiasi modificazione durante la colorazione e
l’osservazione. Prima della fissazione il campione va lavato in tampone. Si hanno due tipi di
fissazione:
a) Chimica con l’uso di sostanze chimiche.
b) Fisica mediante congelamento.
Le modalità della fissazione sono:
a) Per immersione
b) Per perfusione
La fissazione permette al campione di sopportare gli stress a cui dovrà essere sottoposto,
immobilizzando istantaneamente tutti i componenti molecolari e macromolecolari
dell’architettura cellulare.
La fissazione comunemente usata prevede una:
La fissazione primaria aldeidica (glutaraldeide 2.5% in tampone cacodilato) a 4 °C che
conserva bene le più fini strutture cellulari compresi gli enzimi, un poco meno i lipidi e le
membrane.
i lavaggi in tampone (lo stesso in cui si diluisce il fissativo).
la post-fissazione in tetrossido di osmio (OsO4 all’1% in tampone) per ~ 1 ora a 4 °C che
rende le strutture opache agli elettroni e fissa bene proteine e lipidi.
Disidratazione: è un processo attraverso il quale l’acqua contenuta nel campione è sostituita da
reagenti organici come etanolo o acetone.
Il preparato viene trattato con concentrazioni in acqua crescenti di acetone per 2-10 minuti a 4 °C,
come nella figura che segue:
Figura 19 – Disidratazione del campione.
Il Critical Point Drying (CPD) è la completa sostituzione dell’acetone con la CO2 gassosa.
Permette l’evaporazione della soluzione disidratante la cui tensione superficiale influenzerebbe
la morfologia della superficie del campione.
Il raggiungimento del CPD avviene attraverso le seguenti fasi:
1. Raffreddamento della camera a ~ 10 °C.
2. Riempimento della camera con CO2 liquida ricoprendo tutto il campione.
3. Aspettare 5-10 minuti.
4. Svuotare la camera.
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5. Ripetere per 5-6 volte i lavaggi fino alla completa sostituzione dell’acetone con la CO2
6. Riempire la camera con CO2 e alzare la temperatura fino a ~ 40 °C (la pressione salirà fino a
~ 90 bar).
7. Aspettare 15-20 minuti affinchè si abbia il passaggio di stato della CO2 (dallo stato liquido a
quello aeriforme).
8. Far fuoriuscire il gas.
Tali fasi vengono realizzate utilizzato la camera che viene mostrata nella figura 20.
Figura 20 – Camera nella quale è raggiunto il Critical Point Drying (CPD)
Quando la pressione e la temperatura raggiungono un certo livello, la CO2 passa dallo stato
liquido a quello gassoso (37 °C e ~ 75 bar).
Montaggio: dopo il CPD i campioni vengono montati su dei supporti metallici (figura 21).
Figura 21 – Montaggio dei campioni su supporti metallici.
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Metallizzazione: serve a ricoprire il campione con uno stato sottile di un metallo (oro). Ciò ha i
seguenti effetti:
Rende conduttivo il campione
Determina un aumento del contrasto topografico (fornendo elettroni secondari)
Stabilizza strutture delicate contro il riscaldamento prodotto dal fascio elettronico
Il campione è posto in una camera (figura 22) in cui è fatto il vuoto. Una corrente permette la
polverizzazione del metallo (oro) che va a ricoprire il campione.
Figura 22 – Camera nella quale avviene la metallizzazione del campione.
Nella tabella 9 sono confrontate le principali caratteristiche del microscopio ottico, elettronico a
trasmissione (TEM) e a scansione (SEM).
Tabella 9 – Confronto delle principali caratteristiche del microscopio ottico, elettronico a
trasmissione (TEM) e a scansione (SEM).
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Applicazioni della microscopia elettronica
Osservazione diretta di campioni biologici.
Studio degli effetti dei gas sul preparato.
Valutazione degli effetti di idratazione e disidratazione del campione.
Studio di polimeri, oli, grassi.
Studi agronomici (pollini, foglie, ecc.).
Limiti
Effetti di evaporazione di acqua e di danneggiamento termico del preparato che si possono
verificare durante l’osservazione.
Saggi sierologici
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima)
ELISA è un acronimo derivato dall'espressione inglese Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
(Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima). Si tratta di un versatile metodo d'analisi
immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più
anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima. La sostanza da rilevare può essere un antigene
appartenente ad un patogeno od una molecola più piccola, chiamata aptene, come per esempio per
riconoscere la presenza di steroidi. Se invece di un enzima, viene usato un radionucleide (spesso
l’isotopo 125 dello iodio) per rilevare la positività del test, si parla di RIA dall'inglese (radioimmuno assay).
Figura 23 – Test ELISA diretto ed indiretto.
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Il saggio ELISA trova anche un ampio uso per accertare la presenza di anticorpi contro un
determinato antigene nel plasma sanguigno del paziente per accertarsi se c'è stata un'esposizione ad
un determinato patogeno. Questo avviene nel test per l'HIV per accertarsi se il sistema immunitario
del soggetto si è trovato a confrontare il virus dell'AIDS. Ma il test ELISA è molto applicato nella
diagnosi di malattie, soprattutto quelle causate da virus, nel campo vegetale. naturalmente esso è
diretto verso uno specifico patogeno e sarà necessario ricorrere all’uso di antigeni in grado di
legarsi, specificamente, all’agente patogeno virale o batterico o altro, facendo particolare attenzione
alla possibilità di riscontrare dei falsi postitivi.
Ci sono diversi varianti del test ELISA, che si differenziano secondo il componente che si vuole
rilevare.
Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto, la presenza di
anticorpi contro l'antigene. Il saggio può essere competitivo o non competitivo. L'ELISA non
competitivo diretto si effettua secondo diverse metodiche: semplice e sandwich ELISA.
Nel metodo semplice ELISA l'antigene è assorbito sulla placca e rilevato con un anticorpo marcato
da un enzima.
Nel metodo a sandwich l'anticorpo che è usato per catturare l'antigene è assorbito sulla placca, gli
anticorpi assorbiti sono in seguito esposti al fluido che potrebbe contenere l'antigene ed un secondo
anticorpo, marcato, viene aggiunto per rilevare che l'antigene è stato catturato. In questo secondo
caso, gli epitopi sull'antigene dei due anticorpi devono essere completamente distinti senza alcuna
sovrapposizione. Nella figura 23 è riportato lo schema del test ELISA diretto (a sinistra) e del test
ELISA a sandwich (a destra).
Metodo diretto
l metodo diretto sandwich prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico
per l'antigene che vogliamo misurare.
Si esegue un lavaggio. In seguito si introduce l'antigene, che si legherà all'anticorpo. Si lava
ulteriormente per togliere antigeni in eccesso.
Si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo + antigene, formando un
triplo strato da cui prende il nome il test. All'ultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, era legato un
enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il
pozzetto.
Le fasi in sintesi prevedono:
1. Immissione di una soluzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene da ricercare ed
individuare nel siero o in un dato liquido biologico, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio
in polistirene. Il fondo del pozzetto viene saturato con l'anticorpo che aderisce al fondo dei
pozzetti e l'eccesso viene lavato via.
2. Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni non note, dei campioni dei quali bisogna
saggiare la presenza, o meno, dell'antigene caratteristico dell’organismo patogeno e lavaggio con
soluzione tampone. L'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo e l'eccesso
viene lavato via.
3. Aggiunta dell'anticorpo secondario, che può essere rappresentato da un anticorpo antiimmunoglobuline umane, che possono essere ottenute da animali di grossa taglia inoculando in
essi siero umano(le cui proteine sono riconosciute come antigeni estranei al sistema immune
dell'animale e quindi determinano la formazione di anticorpi). Questo anticorpo viene coniugato
con un enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone.
L'anticorpo secondario si lega selettivamente all'antigene, se presente, e l'eccesso viene lavato
via. L’assenza dell’antigene specifico per l'anticorpo comporta che l'anticorpo secondario (e il
relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga dilavato.
4. Se l'enzima usato è la fosfatasi alcalina si aggiunte come substrato p-nitrofenilfosfato. Questa
sostanza provoca una reazione con la fosfatasi alcalina coniugata all'anticorpo secondario
producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Se l’antigene caratteristico dell’organismo patogeno è
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assente nel pozzetto non vi sarà neanche l’enzima coniugato all’anticorpo secondario e quindi la
reazione non può avvenire.
5. Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato.
6. Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che
produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di colore o
luce di fluorescenza - successivamente misurabile attraverso uno spettrofotometro.
Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità
della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala
arbitraria di intensità. Al fine di validare il test, le operazioni sopra riportate vengono effettuate in
due pozzetti distinti che differiscono per il tipo di anticorpo primario che viene introdotto
inizialmente: un pozzetto viene riempito con l'anticorpo specifico per l'antigene che si vuole
individuare, mentre l'altro viene saturato con un anticorpo non specifico. Affinché il test possa
ritenersi valido, in primo luogo deve risultare negativo in quest'ultimo pozzetto e nel caso in cui il
campione biologico saggiato contenga realmente l'antigene d'interesse, il test deve essere positivo
nell'altro pozzetto, quello saturato con l'anticorpo primario specifico.
Il test ELISA NON COMPETITIVO è un test qualitativo e semi-quantitativo: non fornisce un
valore effettivo ma afferma la presenza o l'assenza dell'antigene.
Il test ELISA COMPETITIVO è invece un test quali-quantitativo: fornisce un valore specifico, con
una deviazione standard.
Metodo indiretto
Nel metodo indiretto innanzitutto si copre il fondo del pozzetto con l'antigene specifico per
l'anticorpo che vogliamo misurare.
Si lava via l'eccesso per eliminare l'indesiderato. Si aggiunge il siero(campione) che si pensa
contenga gli anticorpi per quell'antigene adsorbito al fondo del pozzetto.
Si lava via l'eccesso ancora una volta.
Si aggiunge un secondo tipo di anticorpo (marcato con un enzima), che legherà il complesso
antigene(adsorbito)+anticorpo(del campione) se sono presenti gli anticorpi nel campione. Il secondo
anticorpo è quindi un anti-anticorpo.
Si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi al complesso (quelli combinati
resistono invece al lavaggio). Infine, si aggiunge il substrato dell'enzima con cui è stato marcato
l'anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli anticorpi nel siero (nel
campione), visto che l'enzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la
luce e risulti colorato. Ha lo scopo di ricercare specifici anticorpi in un dato liquido biologico
avendo a disposizione antigeni a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici
antigeni avendo a disposizione anticorpi monoclonali che possano legarsi a questi ultimi.
In caso di esito positivo, per conferma si esegue il Western Blot.
Innovazioni
La Multiple & Portable ELISA (M&P ELISA) usa una conformazione innovativa della fase solida:
un’astina di polistirene da cui protrudono 8 o 12 ogive.
L’intera astina va introdotta direttamente nel campione da saggiare e tutti i passaggi successivi
(lavaggi, incubazione in coniugato e incubazione in cromogeno) sono eseguiti semplicemente
immergendo le ogive dell’astina - estratta dal campione dopo opportuna incubazione - in pozzetti di
micropiastre o microstrip standard, pre-riempiti con le soluzioni e i reagenti. Gli importanti
vantaggi sono:
l’astina introdotta nel campione ha le ogive sensibilizzate con reagenti differenti, in modo che in
ciascun campione sia possibile la ricerca simultanea di differenti anticorpi e/o di differenti
antigeni, per analisi multiple o per multi-screening.
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il volume del campione analizzato può essere aumentato per aumentare la sensibilità del test in
campioni clinici (sangue, saliva, urine), alimentari (latte di massa, pool di uova) e ambientali
(acqua).
un’ogiva di ogni astina non è sensibilizzata e funge da controllo negativo, per valutare la
specificità per tutti i test di ricerca di anticorpi e/o antigeni eseguiti nel campione in esame.
non si deve effettuare la distribuzione dei campioni, dei coniugati e del cromogeno nei pozzetti
di micropiastra o in microstrip. i lavaggi sono estremamente semplificati.
la tecnologia innovativa consente la realizzazione di kit da laboratorio pronti all'uso e di kit
portatili per analisi in campo (ambulatori, aeroporti, dogane, allevamenti).
Saggi molecolari
Northern Blot
Il northern blot è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un
campione, in particolare per studiare l'espressione genica. Tecnicamente, è simile al southern
blotting, con la differenza sostanziale che l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in
soluzione. per fare in modo che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del
frammento, l'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte
temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di agenti denaturanti,
solitamente formaldeide e formammide. Questa tecnica è stata messa a punto nel 1977 da James
Alwine e George Stark della Stanford University. Il nome è derivato per assonanza dalla tecnica
analoga per il DNA (southern blot).
Fasi del protocollo
L'RNA è molto suscettibile alla presenza di RNasi. queste sono proteine enzimatiche che degradano
l'RNA sintetizzate da vari organismi, incluso l'uomo. sono pertanto presenti sulla pelle umana e in
soluzioni contaminate da microorganismi. È essenziale sterilizzare (in autoclave a 120 °C per
almeno 20 minuti) tutte le soluzioni e la vetreria da utilizzare per la preparazione e l'analisi
dell'RNA.
Gli apparati elettroforetici devono essere puliti utilizzando una soluzione di NaOH.
Inoltre, è necessario utilizzare dei guanti protettivi durante tutte le fasi di manipolazione dell'RNA,
da cambiare frequentemente. In alcuni laboratori è diffuso l'uso di DEPC (dietilpirocarbonato), che
degrada le proteine presenti in soluzione, comprese le RNasi.
Deve essere inattivato per mezzo del calore. è un agente cancerogeno ed il suo uso è limitato a
soluzioni non contenenti ammine.
In commercio sono disponibili inibitori delle RNasi (Rnasine), da utilizzare in aggiunta ai mezzi di
protezione già suggeriti.
Denaturazione
L'RNA viene riscaldato a ca. 70 °C per 3-5 minuti, poi viene raffreddato rapidamente in un bagno di
ghiaccio fondente. Una piccola quantità di un agente denaturante viene aggiunta (solitamente
formammide) per mantenere l'RNA privo di strutture secondarie.
Elettroforesi
L'elettroforesi permette di frazionare l'RNA in base al peso molecolare, e quindi in base alla
lunghezza·.
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Dato che l'RNA in soluzione a temperatura ambiente tende a formare strutture secondarie che ne
alterano la m·obilità elettroforetica, un agente denaturante (formaldeide) è aggiunto al gel.
Generalmente, la corsa elettroforetica avviene su gel di agarosio, a concentrazione variabile dallo
0,6% al 2-3%, a seconda della lunghezza dell'RNA da identificare.
È sconsigliato l'uso di gel di poliacrilammide, in quanto i monomeri radicalici non polimerizzati
possono causare una degradazione dell'RNA.
Per visualizzare l'RNA durante l'elettroforesi, si può utilizzare l'etidio bromuro, che si lega
debolmente all'RNA ed emette luce fluorescente quando esposto a luce ultravioletta. Su gel
compaiono generalmente tre bande che corrispondono dalla più alta alla più bassa alla 28s, alla 18s
e alla 5s.
Trasferimento su membrana
L'RNA può essere trasferito su una membrana di nylon utilizzando il fenomeno della capillarità. Il
gel viene preparato e incubato in una soluzione salina.
La membrana viene poggiata al di sopra del gel ed una pila di carta assorbente viene posta al di
sopra della membrana. Il movimento dell'acqua e degli ioni causa il trasferimento dell'RNA dal gel
alla membrana, alla quale si lega mediante legami deboli. Per stabilizzare questi legami, il
complesso membrana/RNA è sottoposto a crosslinking usando raggi ultravioletti.
Ibridizzazione
Per identificare l'RNA in oggetto di studio si possono utilizzare diverse metodologie, ma la più
diffusa prevede l'utilizzo di una sonda di DNA, cioè una sequenza di DNA complementare all'RNA
da identificare (da cui la definizione di ibridizzazione o ibridazione). La sonda è spesso marcata con
un isotopo radioattivo (ad esempio P32) oppure con una molecola facilmente individuabile con altre
tecniche, ad esempio la digossigenina.
Visualizzazione
Questa dipende dal tipo di marcatura utilizzata durante l'ibridazione. Nel caso di un isotopo
radioattivo, è possibile rilevare la posizione dell'RNA (legato adesso alla sonda marcata) esponendo
la membrana ad una lastra fotografica.
Southern Blot
Il Southern Blot è una tecnica usata in biologia molecolare per rivelare la presenza di specifiche
sequenze di DNA in una miscela complessa. Prende il nome dal suo inventore, Edwin Mellor
Southern.
Procedura
Un campione eterogeneo di DNA genomico viene trattato con enzimi di restrizione e
successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel d'agarosio o di poliacrilammide. Nel gel sarà
possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua. non si vedranno bande nette perché il
DNA genomico digerito con l'enzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si
troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso
molecolare.
Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA. solitamente si tratta di una
soluzione molto diluita di NaOH per un tempo pari a 15 minuti.
Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa o nylon a carica positiva e sopra di questo
viene posta una pila di fogli assorbenti.
Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei
fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli
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sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici (dovute alle
cariche negative dei gruppi fosfato del DNA che si legano alle positive della membrana). Da
notare che in questo passaggio il DNA non sale grazie a una forza elettrica come nella prima
elettroforesi ma solo per capillarità.
Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e vengono saturate le cariche positive con DNA
eterologo (solitamente DNA da salmone). processo di preibridizzazione.
Il foglio di nitrocellulosa viene quindi immerso in una soluzione contenente una sonda marcata
in vario modo (fluorescenza, radioattività, ecc.) che ibridizza con sequenze di DNA
complementari presenti sul foglio, identificandole. La sonda viene creata con tecniche di
amplificazione del DNA. L'ibridizzazione della sonda con il DNA può avvenire con diversi gradi
di "stringenza" a seconda delle finalità dell'esperimento, consentendo una ibridizzazione con
specificità anche inferiore al 100%.
A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra
fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il DNA genomico.
Microarray
Un microarray di DNA (comunemente conosciuto come gene chip, chip a DNA, biochip o matrici
ad alta densità) è un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida
come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (matrice). Tali array permettono di
esaminare simultaneamente la presenza di moltissimi geni all'interno di un campione di DNA (che
spesso può rappresentare anche tutto il genoma o il trascrittoma di un organismo). Un utilizzo tipico
è quello di confrontare il profilo di espressione genica di un individuo malato con quello di uno
sano per individuare quali geni sono coinvolti nella malattia.
I microarray sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, che consiste nel fissare tutti i segmenti di
DNA (detti probe) su un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico che vogliamo identificare
(detto target). È una tecnica che è stata sviluppata negli anni '90 ed oggi permette l'analisi
dell’espressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni. Per
studiare gli mRNA, essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cDNA, con l’uso di un
enzima chiamato transcrittasi inversa ed allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente.
Quando si fa avvenire l’ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cDNA target,
quest’ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la
posizione dove è rimasto legato. Le principali applicazioni dei microarray sono l’analisi dei
polimorfismi SNP, il confronto di popolazioni di RNA di cellule diverse e l'utilizzo per nuove
metodologie di sequenziamento del DNA, nonché per lo screening di sequenze senso e antisenso
nella ricerca degli oligonucleotidi usati in campo farmaceutico. In tale occasione, a proposito dei
polimorfismi SNP, bisogna ricordare che un polimorfismo a singolo nucleotide (in inglese Single
Nucleotide Polymorphism, il cui acronimo è SNP, pronunciato snip) è un polimorfismo, cioè una
variazione, del materiale genico a carico di un unico nucleotide, tale per cui l'allele polimorfico
risulta presente nella popolazione in una proporzione superiore all'1%. Al di sotto di tale soglia si è
soliti parlare di variante rara. Ad esempio, se le sequenze individuate in due pazienti sono
AAGCCTA e AAGCTTA, è presente uno SNP che differenzia i due alleli C e T.
Ritornando alle applicazioni dei microarray, il segmento di DNA legato al supporto solido è noto
come probe. In un array sono usati contemporaneamente migliaia di probe. Questa tecnologia è nata
da una tecnica più semplice nota come Southern blotting (di cui si è già detto in questa relazione
sulle metodologie di analisi), dove frammenti di DNA attaccati ad un substrato sono testati da sonde
geniche aventi sequenze conosciute.
La misura dell’espressione genica mediante microarray ha un notevole interesse sia nel campo della
ricerca di base (ad esempio in genetica vegetale per lo studio del profilo d’espressione genetica), sia
nella diagnostica delle patologie in campo umano, animale e vegetale, in particolare di malattie a
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base genetica, dove l’espressione genetica di cellule sane viene comparata con quella di cellule
affette dalla malat·tia in esame.
Produzione
I microarray possono essere fabbricati usando diverse tecnologie, come la stampa di micro solchi,
con un particolare microspillo appuntito su una lastrina di vetro dove verrà attaccata in maniera
covalente la sonda (probe) di materiale genetico ottenuta per clonazione, sfruttando la tecnica PCR,
(fotolitografia) ed usando maschere preformate da ditte specializzate come ad esempio da Greiner
Bio-One. Ogni singolo clone viene posizionato nell'esatta posizione sul vetrino da un robot. È
evidente che questa tecnica richiede apparecchiature robotiche molto sofisticate. Il nucleo
dell'apparecchiatura è costituito da una "gruppo scrivente" che preleva uno o più campioni di cDNA
mediante l'utilizzo di pennini e li trasferisce su vetrini per microscopio, il movimento è ovviamente
controllato da un computer. Durante la deposizione, il sistema di controllo del robot registra
automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione ed alla completa
identificazione di ciascun punto della matrice. Una volta che la sonda è sul vetrino si effettua il
processing, il passaggio cioè in cui la sonda viene legata covalentemente al supporto attraverso una
reazione innescata dall'irraggiamento con luce ultravioletta o incubando il vetrino a 80 °C per 2 h.
Infine, il cDNA viene reso a singola catena attraverso una denaturazione termica o chimica. Con
questa tecnica però era possibile creare solo microarray a bassa densità (ovvero con poche sonde
per millimetri quadrati). I DNA microarray possono essere usati per individuare RNA che può
essere o non essere tradotto in proteine. Questa analisi è detta analisi dell’espressione o profilo
d'espressione. Con la tecnologia dei microarray si possono avere decine di migliaia di risultati in
pochissimo tempo. Per questo motivo questa tecnologia ha permesso notevoli accelerazioni in
diversi campi di investigazione biochimico e biotecnologico. L’uso di microarray per lo studio del
profilo d’espressione genetica è stato pubblicato per la prima volta nel 1995 sulla prestigiosa rivista
Science ed il primo genoma eucariotico completato con l’analisi di microarray è stato quello di
Saccharomyces cerevisiae nel 1997 (Science).
Array per fotolitografia
In questo caso gli oligonucleotidi sono sintetizzati in sito, questa tecnica è stata utilizzata per la
prima volta dall'Affymetrix, una ditta che ne detiene il brevetto.
La tecnica per la produzione di questi chip è detta fotolitografia, con la quale è possibile sintetizzare
molte migliaia di differenti oligonucleotidi sulla superficie di un vetrino.
Anche se questa tecnica di sintesi è molto accurata, la massima lunghezza degli oligonucleotidi che
è possibile raggiungere è di 25 nucleotidi, ma oligonucleotidi di queste dimensioni non sono
sufficienti a dare specificità al microarray, per questo servono almeno 3 oligonucleotidi, che legano
un gene, ed altri 3 oligonucleotidi che presentano un mismatch che serviranno da controllo negativo.
Per cui le analisi di un singolo gene richiedono lo studio di sei spot che devono avere come
risultato: i tre oligonucleotidi corretti, positivi, mentre i tre oligonucleotidi con il mismatch,
negativi. Inoltre, ogni volta bisogna fare un chip per il controllo e uno del soggetto da analizzare,
perché non si può effettuare un'ibridazione per competizione. Sui microarray a bassa densità
solitamente si usavano marcatori radioattivi, questo tipo di marcatori però non permette una
risoluzione sufficientemente elevata per i chip ad alta densità, con i quali è necessario utilizzare
marcatori fluorescenti. Una volta che il microarray è stato costruito o comprato e il campione di
acidi nucleici da analizzare è stato isolato, si fa avvenire la reazione di ibridazione, che permette la
formazione degli eteroduplex. Per ottenere dei buoni microarray è essenziale difenderli dall'umidità
(se l'ambiente è secco la soluzione evapora, se invece è umido si deposita dell'acqua) e dalla polvere
(ogni spot è grande circa 50 micron, un granello di polvere e più grande di 50 micron, per cui può
coprire vari spots), per questo motivo esistono delle camere apposite per l'ibridazione dei
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microarray che vengono sigillate. Dopo l'ibridazione il microarray viene lavato per rimuovere il
cDNA che non si è legato. Generalmente il Dna fluorescente dei campioni sperimentali è mescolato
con un Dna di un soggetto di controllo marcato con un colorante fluorescente diverso. Per i
microarray si usano solitamente Cy3 (che emette una lunghezza d'onda nel campo del verde) e Cy5
(che emette nel campo del rosso). In questo modo se la quantità di RNA espressa da un gene nelle
cellule di interesse è aumentata (up regolata) rispetto a quella del campione di riferimento, lo spot
che ne risulta sarà del colore del primo fluorescente. Viceversa se l'espressione del gene è diminuita
(down regolata) rispetto al campione di riferimento lo spot sarà colorato dal secondo fluorescente.
La fluorescenza è rilevata poi con uno scanner a laser, grazie al quale si acquisisce un'immagine per
ogni fluoroforo. Poi vengono usati dei software appositi per convertire i segnali in una gamma di
colori dipendente dalla loro intensità. Il segnale rilevato dallo scanner viene poi sottoposto ad altri
algoritmi di filtrazione e di pulizia e convertito in valori numerici. Il principale problema dei
microarray è la mancanza di standardizzazione, che causa difficoltà nel confronto di dati; inoltre, se
oggi con questa tecnica è possibile analizzare i livelli di espressione di un singolo gene ottenendo
degli ottimi risultati, la combinazione dello studio di molte migliaia di geni risulta molto complicato
e può portare spesso a dei falsi positivi, questo accade anche a causa del fatto che alcuni cDNA
possono cross-ibridare altre sonde (che avrebbero dovuto rilevare altri geni). Un altro problema è
presentato dai fluorofori che, nonostante siano molto simili fra loro, presentano delle differenze
problematiche. Esiste una diversa efficienza di fluorescenza tra Cy3 e Cy5 che deve essere
standardizzata dai software di rilevazione. Inoltre, poiché Cy3 è più piccolo di Cy5, c'è un diverso
livello di incorporazione del due fluorofori, in quanto la polimerasi presenta più difficoltà a inserire
il nucleotide marcato con Cy5 a causa dell'ingombro sterico; come se non bastasse Cy5 si presenta
più labile di Cy3, quindi una prima scansione di Cy3 con il laser potrebbe ridurre la fluorescenza di
Cy5. Per ovviare a tutte questa problematiche e per creare un minimo di standardizzazione si
effettua il dye swap: consiste nell’effettuare un secondo microarray scambiando l'uso dei fluorofori.
Se nel primo microarray Cy3 è stato usato per marcare il cDNA sperimentale, nel secondo
microarray si userà Cy3 per marcare il cDNA del soggetto di controllo, e viceversa per Cy5.
Spotted microarrays
Negli spotted microarrays (o microarray a doppio canale), i probe sono oligonucleotidi, cDNA o
piccoli frammenti prodotti con la tecnologia PCR corrispondenti a mRNA.
Figura 24 – Ibridizzazione in un singolo microarray con targets in combinazione.
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Questo tipo di microarray sfrutta l’ibridazione di DNA con cDNA da due campioni comparati (es.
individuo ammalato e controllo), che sono marcate con due differenti fluorofori.
I campioni possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo microarray e quindi analizzati,
permettendo la visualizzazione dei geni up-regolati e down-regolati contemporaneamente (figura
24). Con questa tecnica il livello assoluto dell’espressione genica non può essere apprezzata a
pieno, ma il costo dell’analisi è ridotto della metà.
Microarray di oligonucleotidi
Nei microarray di oligonucleotidi (o single-channel microarrays), i probe sono progettati per
riconoscere parti di sequenze di mRNA conosciute o predette. Vi sono matrici microarray di tal
specie commercializzate da numerose ditte specializzate, come GE Healthcare, Affymetrix, Agilent.
Tali matrici microarray contengono oligonucleotidi importanti per alcune analisi di routine o
addirittura grosse parti di genomi di vari esseri viventi. Inoltre, possono essere prodotte matrici ad
hoc a richiesta, al fine di soddisfare qualsiasi bisogno, per la ricerca o la diagnostica. Array
oligonucleotidici possono essere prodotti o per deposizione piezoelettrica dell’intera lunghezza
dell’oligo, o per sintesi in situ (fotolitografia).
Array di oligonucleotidici lunghi sono composti da 60-meri (oligo costituiti da 60 basi) e sono
prodotti con la tecnologia ink-jet printing su substrati di silicio. Array di oligonucleotidici corti sono
composti da 25-meri or 30-meri e sono prodotti per sintesi fotolitografica su substrati di silicio
(Affymetrix) o per deposizione piezoelettrica su matrici acrilammidiche (GE Healthcare). Più
recentemente, la NimbleGen Systems ha sintetizzato nuove matrici, dette Maskless Array, che
possono essere utilizzate in modo flessibile con numerosissimi oligonucleotidi test (probe): i
nucleotidi che formeranno gli oligonucleotidi sono dei nucleotidi modificati che presentano un
gruppo protettore fotolabile che, finché è presente, ne impedisce il legame all'oligonucleotide in
crescita. Questo gruppo può essere allontanato con una fonte luminosa che permette ai nucleotidi di
reagire. Si usano delle "maschere" per determinare quali nucleotidi ed in quale posizione devono
essere attivati dalla luce. In questa maniera sequenze oligonucleotidiche specifiche possono essere
costruite in posizioni predeterminate. Questa tecnica permette di preparare microarray ad alta
densità. Un array standard può contenere più di 390.000 pozzetti test (spots). Nuovi array sono in
studio per la ricerca nel campo biochimico (vie metaboliche) o per la diagnosi e la prevenzione in
campo medico. In particolare questa tecnica è importante per l’analisi del genoma di soggetti con
malattie genetiche o che sono soggetti a potenziali malattie familiari, come il diabete, malattie
cardiovascolari o tumori familiari.
Microarray di genotipi
DNA microarray possono essere usati per lo studio di genotipi.
Gli SNP microarray sono particolari DNA microarray che sono usati per identificare i così detti
tratti ipervariabili, ovvero quelle sequenze che variano da individuo a individuo nell’ambito della
stessa specie o in sotto-popolazioni isolate geograficamente o socialmente. Array di oligonucleotidi
corti sono usati per identificare il polimorfismo di un singolo oligonucleotide (single nucleotide
polymorphisms) (SNPs), che si pensano responsabili della variazione genetica e della suscettibilità
individuale a manifestare determinate malattie. I DNA microarray possono essere usati anche per la
genotipizzazione (genotyping), che trova impiego nella medicina forense (esame del DNA), nella
diagnostica e in una nuova branca della farmacologia, la farmacogenomica, che si propone di
studiare la relazione tra diversità genetica e risposta ai farmaci, intendendo per risposta sia gli effetti
terape·utici che quelli collaterali o avversi.
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Questi SNP microarray sono usati per tracciare i profili di mutazione somatica nelle cellule
tumorali. L’amplificazone e la delezione a cui vanno soggette queste cellule possono essere
investigate contem·poraneamente ai microarray l’ibridazione genomica comparativa.
Frequenza degli SNPs: all’interno di una popolazione, è possibile determinare una minor
frequenza allelica, il rapporto tra la frequenza della variante più rara e quella più comune di un
determinato SNP. Solitamente ci si guarda con maggiore attenzione da SNPs aventi un valore di
minor frequenza allelica minore all’1%, trascurando nelle analisi la maggior parte degli SNPs che,
anche per il loro elevatissimo numero, risultano poco maneggevoli. È importante notare che
possono esistere variazioni notevoli tra popolazioni umane. Uno SNP molto comune in un
determinato gruppo etnico può dunque essere molto raro in un’altra popolazione.
Gli SNPs possono presentarsi all’interno di una sequenza codificante di un gene, all’interno di una
regione intronica o in una regione intergenica. Gli SNPs all’interno di un gene, in ogni caso, non
necessariamente modificano la sequenza amminoacidica codificata, dal momento che il codice
genetico è degenerato. Uno SNP che genera in tutte le sue forme lo stesso peptide è detto sinonimo
(synonymous); in caso contrario è detto non-sinonimo (non-synonymous). Gli SNPs che non si
trovano in una sequenza codificante possono, in ogni caso, presentare sequenze negative sullo
splicing o sul legame dei fattori di trascrizione.
Gli SNPs costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane. SNPs con minor frequenza
allelica pari o maggiore all’1% sono presenti ogni circa 100-300 paia di basi lungo l’intero genoma.
In media, due SNPs su tre vedono una variazione tra citosina e timina.
Potenzialità degli SNPs: lo studio degli SNPs è molto utile poiché variazioni anche di singoli
nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai patogeni, agli agenti
chimici, ai farmaci. Per tale motivo gli SNPs possono avere una grande importanza nello sviluppo
di nuovi farmaci e nella diagnostica, in quanto consentono di conoscere l’effetto che può avere un
farmaco su un individuo ancor prima della somministrazione, attraverso uno screening degli SNPs
presenti nel gene responsabile della metabolizzazione del farmaco stesso; queste sono le basi della
armaco genomica. Dal momento che gli SNPs sono perlopiù ereditati di generazione in
generazione, essi vengono utilizzati in alcuni studi genetici.
Individuazione degli SNPs: un metodo utile per individuare gli SNPs è la valutazione dei
cosiddetti restriction fragment length polymorphisms (polimorfismi di lunghezza dei frammenti di
restrizione, o RFLP). Se un allele contiene un sito di riconoscimento per un enzima di restrizione ed
un altro no, la digestione dei due alleli genererà due frammenti di dimensione differente. In realtà
oggi gli SNPs sono studiati principalmente attraverso i microarrays, che permettono l'analisi
simultanea di centinaia di diversi SNPs ed una veloce analisi elaborata da un computer. Una tecnica
con cui è possibile analizzare gli SNPs è la SNuPE (single-nucleotide primer extension). La
procedura prevede l'estrazione dell'RNA, l'amplificazione mediante RT-PCR della porzione in cui è
presente il locus polimorfico in modo da ottenere il cDNA, e infine un ciclo di PCR con primer
SNuPE. Tale primer è progettato in modo tale da appaiarsi all'estremità 3' a monte di un nucleotide
prima del nucleotide che caratterizza il polimorfismo, si inserisce poi un dNTP marcato.
L'amplificato ottenuto viene analizzato su un gel di poliacrilamide e identificato mediante
autoradiografia. Una variante di tale tecnica, la MS-SNuPE (Methylation-sensitive singlenucleotide primer extension), consente di analizzare il grado di metilazione che si può presentare ad
esempio a livello dei dinucleotidi CpG. Tali nucleotidi sono presenti in molti regioni del genoma
umano e sono oggetto di studio dei meccanismi epigenetici. La MS-SNuPE viene condotta
esattamente come la SNuPE ma prima di fare l'amplificazione con il primer si tratta il cDNA con
bisolfito che trasforma le citosine non metilate in uracile.
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Microarray e bioinformatica
Standardizzazione: la mancanza di standardizzazione negli array presenta un problema interoperativo nella bioinformatica, che non può prescindere dallo scambio di dati ottenuti con tale
tecnica. Diversi progetti open-source si prefiggono di facilitare l’interscambio di dati ottenuti da
array. Il "Minimum Information About a Microarray Experiment" (MIAME), standard XML base
per la descrizione· di esperimenti di microarray, è stato adottato da molti giornali scientifici come
standard richiesto per l’accettazione di lavori che contengono risultati ottenuti attraverso analisi di
microarray.
Analisi statistica: l’analisi di DNA microarray propone numerosi problemi di carattere statistico,
compresa la normalizzazione dei dati.
Analizzando il metodo dei microarray, pare evidente che il grande numero di geni presenti in un
singolo array pone lo sperimentatore davanti a un problema di test multiplo: anche se è molto raro e
casuale, ogni gene può dare un risultato falso positivo.
Un test effettuato su più geni è più sicuro che mostri un andamento scientificamente più probante.
Una differenza fondamentale tra i microarray e gli altri metodi di analisi biologica e biomedica
tradizionali sta nella dimensione dei dati. Studi che contengono 100 analisi per paziente per 1.000
pazienti possono essere considerati vasti studi clinici.
Uno studio microarray di media vastità comprende diversi migliaia di dati per campione su
centinaia di campioni diversi.
Relazione tra gene e probe: la relazione tra probe e mRNA è molto semplice ma nello stesso
tempo complessa. Il probe ha alta affinità con una singola sequenza (quella complementare), ma
può legare altre sequenze non prettamente complementari. Ciò potrebbe portare a dati errati.
Protein microarray
Si ottengono utilizzando differenti proteine, fissate su microarray, come sonde. I protein microarray
sono usati per identificare le interazioni proteina-proteina o, ad esempio, per identificare i substrati
delle proteine chinasi o ancora per identificare gli obiettivi di piccole molecole biologicamente
attive.
Le proteine più comunemente usate durante un protein microarray sono gli anticorpi monoclonali,
dove gli anticorpi sono stampati sul vetrino e usati come sonde per rilevare le proteine del lisato
cellulare. L'uso di anticorpi monoclonali però crea alcuni problemi, compreso il fatto che non
esistono anticorpi per la maggior parte delle proteine.
Più recentemente ci si sta spingendo verso altri tipi di molecole da usare come sonde, quali peptidi
di piccole, medie e grandi dimensioni. Tuttavia, oggi gli anticorpi rappresentano ancora la sonda più
efficace per i protein microarray.
I protein microarray (detti anche biochip, proteinchip) sono utilizzati nelle applicazioni biomediche
per determinare la presenza e/o la quantità di proteine in campioni biologici, ad esempio nel sangue.
Anche se i protein microarray usano metodi di rilevazione simili ai DNA microarray, i protein
microarray presentano un altro problema: le concentrazioni delle proteine in un campione biologico
può presentare molti ordini di grandezza di differenza da quello degli mRNA. Di conseguenza, i
metodi di rilevazione dei protein microarray devono avere una gamma molto più vasta di
rilevazione.
Comunque il metodo preferito di rilevazione è ancora la rilevazione per fluorescenza, poiché è
sicuro, sensibile e può dare alte risoluzioni.
Lista di aziende che operano nel campo dei microarray
Affymetrix
Agilent Technologies
Applied Biosystems
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"ArrayIt" TeleChem International Inc.
BioMicro Systems Inc.
Biotecgen s.r.l.
CombiMatrix
Dolomite Microfluidics
Eppendorf
febit biotech gmbh
GE Healthcare
Genetix
Greiner Bio-One
Illumina, Inc.
Kreatech
Micronit Microfluidics
Nanogen, Inc.
NimbleGen
Ocimum Biosolutions
Roche Diagnostics
SCHOTT Nexterion
STMicro·electronics
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