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Diffrazione di Raggi-X
da Monocristalli
A.A. 2009-2010
Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Università di Milano
Diffrazione di Raggi X
Raccolta Dati di Diffrazione:
Diffrazione di Raggi X
Raccolta Dati di Diffrazione:
Ihkl
raggi X
2θ
cristallo
h = 2, k = 1, l = 0
detector
h = 1, k = 3, l = 0
Il fenomeno fisico della diffrazione da parte di un cristallo può essere visto
come un fenomeno di riflessione della radiazione X da parte dei piani
del reticolo cristallino definiti dagli indici di Miller (h,k,l).
La diffrazione di raggi X nel cristallo avviene in direzioni discrete e le
condizioni geometriche che definiscono la diffrazione possono essere
descritte mediante la legge di Bragg.
Diffrazione di Raggi X
Legge di Bragg:
θθ
2dhklsinθ = nλ
dhkl = distanza interplanare della
famiglia di piani reticolari definiti dagli indici di Miller (h,k,l)
λ = lunghezza d’onda radiazione incidente
θ = angolo di riflessione
Diffrazione di Raggi X
Legge di Bragg:
θθ
Per avere un effetto di diffrazione (interferenza positiva tra le onde
elettromagnetiche riflesse dai vari piani reticolari definiti da hkl, per
qualunque valore di hkl) occorre che la differenza di cammino ottico (Δ) fra
le varie onde riflesse sia un multiplo intero della lunghezza d’onda λ.
Δ = AB + BC = d senθ + d senθ = 2d senθ
Δ = nλ (n intero)
2d senθ = nλ
Diffrazione di Raggi X
Intensità di Diffrazione e Fattori di Struttura:
Risultato dell’esperimento di diffrazione
h
k
l
0
0 18
0
0 30
0
0 39
0
0 42
0
0 45
0
0 48
0
0 51
0
0 54
0
0 57
0
0 60
0
0 63
0
0 66
...
eccetera
...
I
5377.7
87315.1
79150.9
88255.3
14582.6
8125.2
46929.6
79917.3
2243.6
21097.8
90391.1
96333.2
σ
426.7
7080.9
5678.3
6544.6
1511.1
596.7
3740.0
8107.1
316.8
1703.7
6236.3
9161.3
Diffrazione di Raggi X
Intensità di Diffrazione e Fattori di Struttura:
Ihkl = k λ3 |Fhkl|2 Vcryst/V2cell
k = coeff. di proporzionalità
Vcryst = volume del cristallo
Vcell = volume della cella elementare
Il “fattore di struttura” Fhkl è un vettore che rappresenta in modulo (Fhkl) e
fase (φhkl) l’onda riflessa dalla famiglia di piani reticolari hkl, quando per
essi è verificata la legge di Bragg.
Fhkl può essere espresso come somma degli N contributi dei singoli atomi jesimi presenti nella cella cristallina.
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Scattering atomico:
Ad ogni onda diffratta contribuiscono tutti gli atomi della cella elementare.
Ogni atomo diffrange in base agli elettroni che possiede. Un atomo con
pochi elettroni (e-) è considerato un diffusore scadente di raggi X.
Il potere di diffrazione di un atomo è detto “fattore di scattering f”
(espresso in elettroni).
f=
ampiezza dell’onda diffratta dall’atomo
ampiezza dell’onda diffratta da un e-
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Scattering atomico:
Esempio: Atomo di Carbonio
f (espresso in
elettroni)
B=0
B = 20
B = 10
all’aumentare di θ, f diminuisce
senθ/λ=0 → f = numero atomico (tutti gli e- diffrangono in fase)
(senθ)/λ
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Scattering atomico:
La radiazione emessa dagli elettroni di un atomo nella stessa direzione del
fascio incidente è quella più intensa, perché corrisponde ad una differenza
di fase nulla tra le onde diffuse da punti diversi della densità elettronica.
All’aumentare di θ l’ampiezza della radiazione diffusa decresce, perché i
contributi di porzioni diverse della nuvola elettronica tendono ad elidersi
reciprocamente.
densità elettronica
radiazione
diffratta
radiazione
incidente
Δx
atomo
θ
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Scattering atomico:
Le oscillazioni dell’atomo attorno alla sua posizione di equilibrio
(dipendenti dalla temperatura) si traducono in una espansione della
distribuzione elettronica mediata nel tempo.
La diffrazione dovuta ad un atomo j-esimo risulta allora smorzata dal
fattore di temperatura Bj (o di Debye-Waller), con un effetto più marcato a
grandi angoli:
f
fj(θ, B) = f 0j exp [-Bj(sen2θ)/λ2]
(senθ)/λ
con Bj = 8π2<μj2>, dove <μj2> indica lo scostamento quadratico medio
associato alle vibrazioni atomiche attorno alla posizione di equilibrio per
l’atomo j-esimo.
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
Onda monodimensionale:
Un’onda può essere descritta come una funzione periodica che può essere
espressa come una somma di funzioni sinusoidali del tipo:
a(x) = F cos 2π (hx + α)
b(x) = F sen 2π (hx + α)
F = ampiezza dell’onda
h = frequenza dell’onda
α = fase dell’onda
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
Nel caso si utilizzi come funzione base la funzione coseno, una qualunque
funzione periodica monodimensionale f(x) potrà essere approssimata dalla
somma (detta “Serie di Fourier):
f(x) = F0 cos 2π (0x + α0) + F1 cos 2π (1x + α1) +
+ F2 cos 2π (2x + α2) + ………… + Fn cos 2π (nx + αn)
cioè:
n
f(x) = hΣ= 0Fh cos 2π (hx + αh)
F = ampiezza, h = frequenza, α = fase
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
n
f(x) = hΣ= 0Fh cos 2π (hx + αh)
f(x) = cos 2π (x)
F = 1, h = 1, α = 0
f(x) = 3 cos 2π (x)
F = 3, h = 1, α = 0
f(x) = cos 2π (5x)
F = 1, h = 5, α = 0
f(x) = cos 2π (x + 1/4)
F = 1, h = 1, α = 1/4
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
f0(x) = 1
f1(x) = cos 2π (x)
f2(x) = (- 1/3) cos 2π (3x)
f3(x) = (1/5) cos 2π (5x)
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
Una utile onda base per approssimare un’onda periodica è data da
c(x) = F cos 2π (hx + α) + i F sen 2π (hx + α) =
= F [cos 2π (hx + α) + i sen 2π (hx + α)] =
(*)
= F [e2πi(hx + α)] = ( F e2πi α ) e2πi(hx) = C e2πi(hx)
dove C = F e2πi α
(*) poiché (cos θ + i sen θ) = eiθ
Allora, data una generica onda periodica f(x) può essere scritta come:
n
f(x) = Σ Ch e2πi(hx) = Σ Ch e2πi(hx)
h=0
h
Diffrazione di Raggi X
Serie di Fourier:
Onda monodimensionale:
n
f(x) = Σ Ch e2πi(hx) = Σ Ch e2πi(hx)
h=0
h
Onda tridimensionale:
f(x,y,z) = Σh Σk Σl Chkl e2πi(hx + ky + lz)
Diffrazione di Raggi X
Rappresentazione vettoriale di numeri complessi:
Un qualunque numero complesso F = A + iB, dove i = (-1)1/2 può essere
rappresentato come un vettore nel piano complesso
asse
immaginario
asse
immaginario
A
F
F
B
F sen α
α
asse reale
F = F = |F| (cos α + i sen α) = |F| eiα = F eiα
F cos α
asse reale
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Struttura:
Ad ogni effetto di diffrazione (“riflesso” = annerimento puntiforme sul
detector) è associata un’onda di intensità Ihkl
Ihkl = k λ3 |Fhkl|2 Vcryst/V2cell
Il fattore di struttura Fhkl ( Fhkl ) descrive un’onda (raggio X) diffratta che
produce un riflesso sul rivelatore.
Da un punto di vista matematico, come qualunque altra onda
tridimensionale (funzione periodica), il fattore di struttura può essere
espresso sotto forma di Serie di Fourier del tipo:
N
Fhkl = Σ fj e[2πi(hxj + kyj + lzj)] = Fhkl eiαhkl
j=1
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Struttura:
N
Fhkl = Σ fj e[2πi(hxj + kyj + lzj)] = Fhkl eiαhkl
j=1
N = numero di atomi presenti nell’unità di cella
fj = fattore di scattering atomico per ciascun atomo j-esimo
(xj,yj,zj) = posizione nell’unità di cella di ciascun atomo j-esimo
Ciascuna raggio diffratto (identificato da hkl) è un’onda data dalla somma
dei contributi diffrattivi di tutti gli atomi (N) presenti nell’unità di cella.
Quindi, il fattore di struttura che descrive il riflesso hkl è una serie di
Fourier in cui ciascun termine è il contributo di ciascun atomo, trattato
come una semplice sfera di densità elettronica.
Il contributo di ciascun atomo j a Fhkl dipende:
(1) dal tipo di atomo, cosa che determina fj cioè l’ampiezza del contributo
(2) dalla posizione dell’atomo (xj,yj,zj) nella cella elementare, che
determina la “fase” del contributo.
Diffrazione di Raggi X
Fattori di Struttura:
i
Esempio (N = 4 atomi)
f4
f3
Fhkl
α4
α3
f2
f1
α2
αhkl α1
4
r
Fhkl = f1 + f2 + f3 + f4 = f1eiα1 + f2eiα2 + f3eiα3 + f4eiα4 = Σ fjeiαj = Fhkl eiαhkl
j=1
con N = numero atomi nella cella elementare (= 4 in questo caso)
h, k, l = indici di Miller
xj, yj, zj = coordinate dell’atomo j-esimo nella cella elementare
Diffrazione di Raggi X
Densità Elettronica:
Da un punto di vista matematico, il fattore di struttura Fhkl (per ogni terna
hkl) può essere definito come la trasformata di Fourier della densità
elettronica ρ(xyz).
Tale densità elettronica, che esprime la posizione degli atomi (cioè la
struttura tridimensionale) della proteina nella cella elementare, può dunque
essere determinata come trasformata di Fourier inversa di Fhkl:
+∞
1
ρ(x,y,z) = 1 ΣΣΣ Fhkl e-2πi(hx+ky+lz) = Σ (Fhkl eiαhkl ) e-2πi(hx+ky+lz)
V hkl
V h=-∞ k l
Diffrazione di Raggi X
Problema della Fase:
+∞
1
ρ(x,y,z) = 1 ΣΣΣ Fhkl e-2πi(hx+ky+lz) = Σ (Fhkl eiαhkl ) e-2πi(hx+ky+lz)
V hkl
V h=-∞ k l
Da un semplice esperimento di diffrazione di raggi X su un monocristallo
macromolecolare nativi si misurano i moduli di Fhkl (Fhkl) mentre non si
hanno informazioni sulle fasi αhkl. Quindi non è possibile calcolare la
funzione densità elettronica per gli atomi che si trovano nella cella
elementare.
Per ottenere informazioni su e quindi essere in grado di calcolare la
funzione densità elettronica è necessario utilizzare i seguenti metodi:
- metodo delle “ Sostituzioni Molecolari ” (“ Molecular Replacement ”)
- metodo delle “ Sostituzioni Isomorfe ” o metodo degli “ Atomi Pesanti ”