Biologia Molecolare

Relatore: Codecà Monia
11 dicembre 2008
Dip. di Medicina di Laboratorio
direttore Dott.Claudio Dotti
Biologia Molecolare:
nuova frontiera del
tecnico di laboratorio
Innanzitutto chi è il tecnico di laboratorio?
Una piccola storia per conoscerci………..
Mario è in montagna , accusa un malore , si reca al pronto
soccorso, viene accolto dal personale medico e paramedico
che presta le prime cure e procede agli accertamenti…..
Dove vanno le
provette di Mario ?
Chi se ne occupa?
I tecnici di laboratorio biomedico, “gli invisibili
a Mario”, provvedono all’esecuzione dei test
con competenza e professionalità, garantendo
precisione ed accuratezza dei risultati.
Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008
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La figura del tecnico di laboratorio nasce nel
contesto lavorativo degli anni 60. All’inizio la
professione richiedeva una grande manualità,e gli
strumenti di lavoro erano: beute, provettoni, pipette,
becchi Bunsen e sostanze chimiche di vario genere.
Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008
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Negli anni la medicina di laboratorio si è caratterizzata sempre più come settore
ad alta specializzazione in rapido e continuo progresso. L’aumento del numero e
della tipologia di analisi richieste ha prodotto nei nostri laboratori lo sviluppo di
ben 40 settori di lavoro distinti. Le nuove tecnologie e l’informatizzazione
migliorano qualità ed accuratezza del dato, diminuiscono i tempi di risposta,
aumentano la sicurezza degli operatori, ma richiedono al TSLB conoscenze, abilità,
e versatilità in situazioni sempre più complesse ed in continua evoluzione.
L’ultima evoluzione del laboratorio
riguarda i test di biologia molecolare
L’elevata sensibilità di
questi test richiede al
tecnico una grandissima
attenzione e precisione.
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BIOLOGIA MOLECOLARE
È una branca della biologia che studia i meccanismi molecolari alla base
della fisiologia cellulare, concentrandosi in particolare sulle interazioni
tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA).
James Watson
Francis Crick
Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008
La nascita della
biologia
molecolare si può
far risalire alla
scoperta della
struttura del DNA
da parte di James
Watson e Francis
Crick nel 1953
quando
presentarono
ufficialmente il
loro modello a
doppia elica.
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I biologi molecolari studiarono come caratterizzare,
isolare e manipolare le componenti molecolari delle
cellule e degli organismi con lo scopo di capire i loro
meccanismi di funzionamento più profondi.
DNA = depositario dell’informazione genetica
DNA = fonte di tutte le attività degli esseri viventi
Per biologia molecolare si intende una serie di
tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la
manipolazione e l'amplificazione degli acidi nucleici.
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PCR: Reazione di Polimerizzazione a Catena
• Tecnica inventata nel 1983 dal Dott.Kary Mullis, che
gli valse il premio Nobel per la Chimica nel 1993
•Consente di amplificare in vitro segmenti di DNA
specifici
Kary Mullis
• È così sensibile da rilevare “teoricamente” anche una singola copia del
DNA o RNA bersaglio ed ha un così alto grado di specificità che è entrata
di diritto nella diagnostica di laboratorio
• Consente in poche ore di amplificare milioni di volte un segmento di DNA
sfruttando i meccanismi cellulari di replicazione del DNA stesso
• Viene utilizzata per segnalare la presenza o meno di sequenze
specifiche di DNA come mutazioni, inserzioni virali e micro-organismi
patogeni
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Animazione PCR
Crescita
esponenziale del
numero di copie
ottenute con
l’aumentare del
numero dei cicli
di PCR
DNA stampo
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
PCR: metodiche derivate
•RT-PCR: utilizzata per amplificare l’RNA
•NESTED-PCR: aumenta la specificità dell’analisi
•PCR QUANTITATIVA: consente la quantificazione degli
acidi nucleici
•REAL-TIME PCR: tipo di PCR che permette un’analisi in
tempo reale
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FISH: Ibridizzazione Fluorescente In Situ
•Metodica potente e versatile che
permette l’individuazione e la
localizzazione degli acidi nucleici
direttamente sul materiale fissato
(cellule, cromosomi in metafase o
sezioni di tessuto) sfruttando
particolari coloranti fluorescenti
•Permette sia la valutazione di
anomalie cromosomiche (trisomie
complete o a mosaico), che la precisa
caratterizzazione di riarrangiamenti
strutturali (traslocazioni, inversioni,
delezioni, ecc).
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Immagine FISH
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Cromosoma marcato con tecnica FISH
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Eseguire un esame di biologia molecolare assume
significati diversi che dipendono dalla finalità
dell’analisi stessa. Può significare:
•ricercare la presenza di DNA o RNA di varia natura;
•ricercare la presenza nel DNA o nell'RNA di
particolari sequenze di geni caratteristiche per ogni
specifica patologia;
•ricercare la presenza nei geni dei riarrangiamenti
strutturali quando ritenuti responsabili delle varie
patologie.
Tutti i laboratori del Dipartimento di Medicina di Laboratorio,
del Dipartimento Oncoematologico e Malattie Infettive
dell'Arcispedale Santa Maria Nuova eseguono analisi di
biologia molecolare.
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L.A.C.C.E: settore COAGULAZIONE
Esegue test ematici collegati al rischio di patologie
cardiovascolari: la prima causa di mortalità nei Paesi Occidentali
Fattori di rischio:
ipercolesterolemia
ipertensione
diabete
fumo
obesità
FAMILIARITA’
Vengono ricercate le mutazioni:
del fattore V di Leiden
della Protrombina (fattore II)
della MTHFR (metilentetraidrofolatoreduttasi)
con varie metodiche di PCR
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Il 50% dei soggetti che sviluppano
patologie cardiovascolari presentano
come unico fattore di rischio una forte
storia di famigliarità indicando una
predisposizione genetica allo sviluppo di
tali patologie
Queste mutazioni sono normalmente
presenti nella popolazione sana ed
esserne portatore non significa
necessariamente sviluppare una
patologia cardiovascolare.
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Grafici di rilevazione delle PCR del fattore V
Campione
negativo,
assenza di
mutazione
Campione
positivo
presentante
la
mutazione
in omozigosi
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Campione
positivo
presentante
la
mutazione
in
eterozigosi
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L.A.C.C.E: settore EMATOLOGIA
Esegue test ematici su DNA e RNA per seguire l’esordio,
il monitoraggio, e la remissione di patologie leucemiche
DNA:
BCL1 – Linfoma mantellare
BCL2 – Linfoma follicolare
RNA:
BCR/ABL – Leucemia mieloide cronica
PMR RAR α - Leucemia promielocitica
AML1ETO – Leucemia acuta mieloide
Vengono utilizzate
metodiche di PCR
qualitativa che
indicano la
presenza o meno
del clone cellulare
cercato.
Di più recente introduzione (2007) sono alcune metodiche
di real-time PCR usate come esame prognostico per le
leucemie mieloidi croniche sui geni BCR/ABL, JAK2 eWT1
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Gel di amplificazione della Mutazione BCR-ABL
Campione 1
POSITIVO per
la mutazione
Campione 2
NEGATIVO
per la
mutazione
Negativo
Marcatore di
riferimento
PCR-ABL
PCR-ABL
PCR-ABL
PCR-P 190
PCR-P 190
PCR-P 190
PCR-P 120
PCR-P 120
PCR-P 120
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L.A.C.C.E : settore EMATOLOGIA
Esegue test ematici su DNA per confermare le diverse
varianti emoglobiniche
DNA:
α Talassemia
β Talassemia- β Talassemia Mediterranea
BeTha Gene 2 / Asiatica
Hb S-C
Hb fetale
Da alcuni anni a questa parte le emoglobinopatie sono
aumentate molto, di numero e di variabilità, a causa
dell'immigrazione extracomunitaria che ha portato sul
territorio etnie con caratteristiche genetiche tipiche.
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LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BIOLOGIA MOLECOLARE
Esegue test su diverse tipologie di materiali per rilevare la
presenza di numerosi agenti infettanti quali virus, batteri e
protozoi.
BATTERI
•Mycoplasma pneumonie
•Borrelia spp.
VIRUS
•v. Erpetici
•Enterovirus
•Parvovirus
•Citomegalovirus
•HIV
PROTOZOI
•HCV
•Chlamydia trachomatis
•HBV
•Toxoplasma gondii
•Leishmania spp.
Esempio di gel ottenuto dopo PCR.
La presenza delle bande indica
l’avvenuta amplificazione.
Le tecnologie utilizzate spaziano dalle metodiche manuali, applicate ai
campioni con bassa cadenza analitica, fino a quelle di più recente messa a
punto quali le real-time PCR usate ad esempio per la determinazione
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quantitativa di HIV, HCV e HBV.
LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BK
Esegue test su campioni di materiali respiratori per la rilevazione
diretta del DNA del Complesso Mycobacterium Tuberculosis
Circa un terzo della popolazione
mondiale è infetta da Mycobacterium
Tuberculosis ed è esposta ad un
rischio del 10% di sviluppare la
malattia nel corso dell’esistenza.
La lenta crescita di questo microrganismo
(tempo di refertazione della coltura: 42
giorni) ritarda la diagnosi clinica e quindi il
trattamento, contribuendo alla diffusione
della malattia.
Viene utilizzata una real-time PCR che consente un’analisi rapida
(esito in giornata) del campione, favorendo così un intervento
medico tempestivo.
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LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BATTERIOLOGIA
Esegue test real-time su campioni ematici per rilevare la presenza di
batteri e funghi causa di sepsi: una delle principali cause di mortalità
ospedaliera
BATTERI
•Staphylococcus spp.
•Streptococcus spp.
•Escherichia coli
•Klebsiella spp.
•Proteus mirabilis
•Pseudomonas aeruginosa, ecc.
FUNGHI
•Candida spp.
•Aspergillus fumigatus
Esempio di grafico delle temperature di melting ottenuto durante la real-time
PCR. La presenza dei picchi indica l’avvenuta amplificazione.
È stato condotto uno studio per determinare la performance del test su materiali
biologici diversi dal sangue (liquor, liquidi biologici vari e pus da ascessi)
confrontandone i risultati con quelli ottenuti mediante coltura standard.
Considerando l’importanza dei materiali analizzati e le conseguenze cliniche, i
risultati ottenuti fanno concludere che il sistema usato trovi un utile impiego nel
Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008 miglioramento della diagnostica microbiologica.
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SERVIZIO TRASFUSIONALE
Esegue, per legge, test con tecniche NAT (tecniche di amplificazione
degli acidi nucleici) per garantire la sicurezza degli emocomponenti
che ottiene dalle donazioni
Vengono analizzati :
• tutti gli aspiranti donatori,
• tutte le sacche prelevate,
• tutte le donazioni di sangue
cordonale.
Obbligo di legge
per esami NAT:
•HCV dal 2002
•HIV dal 2003
•HBV dal 2006
ORGANIZZAZIONE DEL LAVORO
POOLING
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ESTRAZIONE
AMPLIFICAZIONE
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LABORATORIO DI GENETICA
Esegue test con tecniche di PCR su persone che intraprendono
il percorso della fecondazione assistita, per fare diagnosi di
ritardo mentale e su donne affette dalla sindrome di Turner
PERCORSO DELLA FECONDAZIONE ASSISTITA
•microdelezioni del cromosoma Y – gametogenesi
•gene della fibrosi cistica – individuare i portatori sani
RITARDO MENTALE
•metilazione del cromosoma 15 – sindrome di Prader-Willie
sindrome di Angelman
•cromosoma X – sindrome dell’X fragile
SINDROME DI TURNER
•segmenti del cromosoma Y – aumento della probabilità di
patologie tumorali
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LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA
Esegue analisi con metodiche FISH per valutare le
tipologie di alcune patologie oncologiche e nel caso
di aborti spontanei.
•Carcinoma della mammella – ricerca di amplificazioni del
gene Her2-neu (cromosoma 17)
•Gliomi - ricerca di delezioni sul cromosoma1 e sul cromosoma 19
•Linfomi – ricerca di traslocazioni cromosomiche tipiche
•Aborti nel 1° trimestre di gravidanza - valutazione del cariotipo
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CARCINOMA DELLA MAMMELLA
Campione negativo per
l’amplificazione del gene Her2-neu
Campione positivo per
l’amplificazione del gene Her2-neu
LINFOMI
Linfoma follicolare
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Linfoma mantellare
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LABORATORIO DI ENDOCRINOLOGIA
Abbina tecniche di RT-PCR e real-time PCR per uno studio sulla ricerca di
cellule di carcinoma prostatico (CaP) circolanti nel sangue periferico. Il
CaP è la neoplasia più frequentemente diagnosticata nel maschio adulto
e la seconda causa di morte dopo il tumore al polmone.
m-RNA del PSA
È l’espressione
della produzione
cellulare di PSA
RT-PCR
c-DNA del m-RNA
PCR
Amplificato
Se presente indica la presenza
di cellule PSA secernenti nel
campione (micrometastasi)
Vengono ricercate le micrometastasi circolanti utilizzando il PSA (antigene
prostatico specifico) come marcatore molecolare organo specifico, al fine di
cercare di predire il decorso della patologia. Il ritrovamento di tali cellule nel
sangue periferico può essere considerato un indice di progresso della malattia.
Questa metodica è in grado di individuare correttamente i soggetti sani con
una specificità del 100% in quanto non sono stati riscontrati falsi positivi però,
gli elevati costi della metodica, ne fanno presupporre un utilizzo confinato a
casi selezionati per il follow-up e non su larga scala.
Lo studio è tutt’ora in corso.
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IN DEFINITIVA……….
Il TSLB è responsabile dei campioni,
ne valuta l’idoneità ed esegue le
procedure per la corretta
conservazione e smaltimento.
Attua e controlla le fasi del processo
preanalitico e del processo
analitico/produttivo, giudicando il
funzionamento della strumentazione
utilizzata , la validità dei reagenti e le
modalità operative. Inoltre procede ad una
valutuazione e validazione tecnica del dato.
E’ abilitato all’esercizio della professione dal corso di
Laurea istituito nel 2001 o da titoli pregressi equipollenti ,
ma soprattutto attraverso corsi di aggiornamento teoricopratici riguardanti gli specifici campi di attività.
Conclusioni
La biologia molecolare è un’ulteriore dimostrazione della versatilità della
professione del tecnico di laboratorio. Oggi il tecnico di laboratorio è un
professionista con competenza teorica e manuale, chiamato a
confrontarsi in modo autonomo con una realtà multidisciplinare ad
ampio spettro. Inoltre il continuo divenire tecnologico richiede al TSLB
dinamicità, adattabilità e necessità di mantenersi aggiornato per poter
lavorare in modo competente e responsabile.
ADATTABILITA’
RESPONSABILITA’
COMPETENZA
Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008
DINAMICITA’
MANUALITA’
VERSATILITA’
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Un sentito ringraziamento a tutti i colleghi che hanno
contribuito alla realizzazione di questa presentazione.