Transgenesi in Drosophila melanogaster

Transgenesi in Drosophila melanogaster
Biologia dello sviluppo – Tor Vergata
Dott.ssa Merlo
22 Nov 2013
Riassunto schematico della lezione
Storia dell’utilizzo di Drosophila come modello da laboratorio
e descrizione del modello
Drosophila transgenica:
modi per ottenere la transgenesi, funzione ed utilizzo
Drosophila come modello di neurodegenerazione
Storia dell’utilizzo di Drosophila come modello da
laboratorio e descrizione del modello
Thomas Hunt Morgan
1866 – 1945
•  Biologo americano che diede inizio alla Genetica Moderna, non
solo basata sulle osservazioni ma sulla sperimentazione.
Era interessato alla comprensione dei fattori ereditari, dove
erano e come venivano trasferiti da generazione in generazione.
•  Dopo vari anni di insegnamento si trasferisce alla Columbia
University dove apre la sua famosa “Fly Room”. Voleva capire la
relazione fra ereditarietà e mutazione.
+
•  Esaminando migliaia e migliaia di moscerini con microscopio e
lenti di ingrandimento, Morgan ed i suoi colleghi confermarono
la teoria cromosomica dell’ereditarietà
“I geni si trovano sui cromosomi come delle perle in una
collana e che alcuni geni sono legati, “linked” (sono cioè
sullo stesso cromosoma e vengono ereditati insieme).”
Uno dei suoi studenti, Alfred Sturtevant, creò la prima mappa
genica, una pietra miliare in genetica.
Nel 1933 riceve il Premio Nobel in Medicina
Adattato da
http://www.nature.com/scitable/topicpage/thomas-hunt-morgan-the-fruitfly-scientist-6579789
Teoria di Sutton-Boveri
teoria cromosomica dell’ereditarietà
+
Esperimento di Morgan
XX
XY
XX
XY
P
XX
F1
XX
+
F: rossi
M: ½ rossi, ½ bianchi
X
Y
X
XX
XX
XY
XY
XY
F: rossi
M: bianchi
F e M: rossi
X
XY
F: ½ rossi, ½ bianchi
M: ½ rossi, ½ bianchi
F2
X
Y
X
X
XX
XX
XY
XY
Nuesslein-Volhard, Wieschaus and Lewis
Ognuno dei tre è stato coinvolto nella ricerca sui
geni coinvolti nel controllo dello sviluppo della Drosophila.
Molti dei geni studiati da Nuesslein-Volhard, Wieschaus and Lewis
hanno anche importanti funzioni durante lo sviluppo embrionale
dell’uomo.
Edward B. Lewis
1918 – 2004
Lewis:
+
Christiane Nüsslein-Volhard
1942
determinò che un paio extra di ali osservato in una naturale
mutazione di Drosophila era dovuto ad una duplicazione di un
intero segmento del corpo. E il gene che doveva controllare il
bilanciamento del moscerino era perso. Altri geni nell’embrione in
seguito avevano trasformato il segmento del corpo in un paio extra
di ali (Bithorax complex: torace doppio).
Nüsslein-Volhardis e Wieschaus:
Determinarono la funzione dei geni coinvolti nella segmentazione
dell’embrione di Drosophila.
Il lavoro pioneristico sui geni omeotici ha indotto altri scienziati ad
esaminare famiglie di geni analoghi in organismi superiori.
Nel 1995 ricevono il Premio Nobel in Medicina
Eric F. Wieschaus
1947
Geni omeotici
+
Geni Hox nei mammiferi
+
Vantaggi dell’uso di Drosophila m. come modello
Insetto piccolo, facile da mantenere in laboratorio (anche a temperatura ambiente),
non richiede molta cura e non è dispendioso mantenere anche colture estese
I moscerini possono essere anestetizzati facilmente e I singoli individui possono
essere manipolati senza necessità di attrezzature costose o sofisticate
La Drosophila è sessualmente dimorfica (maschi e femmine possono essere distinti
facilmente). È quindi facile ottenere delle vergini, utili per l’incrocio con altri
transgenici
Se ne conosce l’intero genoma (escluso le regioni altamente ripetute) ed
esiste una quantità enorme di reagenti disponibili (loss of function, gain of
function, etc).
Il ciclo vitale è molto corto e quindi permette di studiare anche fenomeni come
l’invecchiamento o le malattie neurodegenerative.
Ciclo
Ciclo vitale
vitale di
di Drosophila
Drosophila
http://www.youtube.com/watch?v=wm_cfjhgqeM
Il genome umano è
composto da 23 paia di
cromosomi
≈20.000-25.000 geni
Genoma sequenziato
parzialmente nel 2001
(90%) e completato nel
2003
Il genome del moscerino è
composto da 4 paia di cromosomi
≈ 14.000 geni
Genoma sequenziato nel 2000
Il genoma del moscerino è composto da
4 paia di cromosomi
≈ 14.000 geni
Genoma sequenziato nel 2000
Ad oggi solo di una parte dei gene
è conosciuta la funzione
Modalità di genetica “inversa” –
reverse genetics
sequenza di un determinato gene -> fenotipo corrispondente
(la genetica classica)
Analisi del fenotipo -> determinazione di un particolare genotipo
1. 
2. 
Mutagenesi indotta da radiazioni ionizzanti,
sostanze chimiche o elementi trasponibili
Mutagenesi diretta ad interferire con la funzione di un gene specifico
(gene targeting, RNAi lines)
Mappatura genetica di Drosophila
http://www.youtube.com/watch?v=YAvwvudcwuk
Drosophila transgenica: modi per ottene la transgenesi,
funzione ed utilizzo
Mutagenesi indotta da radiazioni,
sostanze chimiche o elementi trasponibili
Radiazioni ionizzanti (raggi X)
•  produzione di DSBs (double strand breaks) nel DNA
•  mutazioni identificabili citologicamente osservando i cromosomi politenici
•  mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto
Mutagenesi con agenti chimici (EMS)
•  Etilmetansulfonato, mutageno più usato: facile da amministrare, causa la più alta frequenza di mutazioni
•  Mutazioni di singole basi (point mutations)
•  Seguendo il protocollo standard si ottiene un alto tasso di mutazione di 1:1,000 (gene medio)
•  Difficile e laborioso identificare i punti di mutazione ed associarli a specifici geni
Mutagenesi mediata da trasposoni (P-elements)
•  Inserzione di elementi P all’interno di un gene o nella regione di regolazione genica
•  Mutazioni facilmente identificabili perchè l’elemento P può fare da tag
•  Esiste una collezione enorme esistente (Bloomington) che contiene 1/4 dei geni essenziali
•  L’inserzione non è casuale, ci sono degli hot spots
Elementi genetici trasponibili
Gli elementi trasponibili sono
caratteristica intrinseca del genoma di
tutti gli organismi viventi e
contribuiscono in maniera sostanziale
alla variabilità genetica
Gli elementi trasponibili negli eucarioti
possono essere divisi in due categorie
principali:
• 
Classe I (copy and paste): si
muovono tramite un intermedio ad
RNA, richiedono la retrotrascrizione
(retrotrasposoni) ed in genere hanno
long terminal repeats (LTR)
• 
Classe II (cut and paste): fanno
trasposizione da DNA a DNA (DNA
trasposoni) e hanno ripetizioni
invertite alle loro estremità. Questo
tipo di trasposoni è autonomo perché
codifica per una trasposasi che
permette la trasposizione in una
nuova posizione cromosomica
Elementi genetici trasponibili in Drosophila m.
Si pensa che un 10% del genoma di Drosophila sia MOBILE
Elementi copia-simili
Hanno ripetizioni terminali dirette costituite a loro
volta da piccoli tratti ripetuti e invertiti e hanno una seq
bersaglio duplicata, presente in singola copia prima
dell’inserimento
Elementi FB (fold back)
+
Seq eterogenee ma omologhe con dimensioni
comprese tra le poche centinaia e le varie migliaia di
basi. Sono costituiti da una lunga sequenza terminale
invertita: a volte è presente anche una sequenza
centrale. Le seq terminali invertite sono a loro volta fatte
di moduli di ripetizione diretta. Non è noto se usino una
trasposasi. Possono ripiegarsi su se stesse formando
strutture secondarie. La mutazione può essere dovuta sia
all’inserimento dell’elemento nel gene oppure intorno
alle regioni di controllo dell’espressione
Elementi P
Costituiti da ripetizioni terminali invertite perfette di
31bp. In genere gli elementi sono lunghi 2.9kb o hanno
strutture che fanno pensare ad una comune origine di
2.9kb. L’elemento di 2.9kb contiene l’informazione per
codificare tre proteine
Disgenesi degli ibridi: la scoperta degli elementi P
Gli elementi P di Drosophila
• 
• 
Piccoli trasposoni con ripetizioni terminali invertite di 31bp
Contengono un gene per la trasposasi, che comprende quattro esoni
• 
Per poter essere competente per la trasposizione l’elemento P
deve avere poche centinaia di paia di basi
•  In genere viene introdotto un marcatore genico per il colore degli occhi
(white, w+ o rosy, ry+) in modo da seguire l’integrazione e l’escissione fenotipicamente
• 
I normali ceppi di laboratorio non posseggono elementi P quindi le inserzioni sono stabili
La trasposizione può essere indotta a piacimento introducendo la trasposasi
• 
La trasposizione avviene solo nelle cellule germinali
Gli elementi P di Drosophila: utilizzo in laboratorio
+
Gli elementi P di Drosophila: vari utilizzi
•  In genere viene introdotto un marcatore genico per il colore degli occhi
(white, w+ o rosy, ry+) in modo da seguire fenotipicamente l’integrazione e l’escissione
• 
I normali ceppi di laboratorio non posseggono elementi P quindi le inserzioni sono stabili
La trasposizione può essere indotta a piacimento introducendo la trasposasi
Gli elementi P di Drosophila: Enhancer trap
• 
Sono costituiti da un gene LacZ fuso al promotore della trasposasi
all’estremità 5’ dell’elemento P
• 
L’espressione da questo promotore dipende dalle regioni regolative
in prossimità del punto di inserimento
• 
Spesso gli elementi P si inseriscono vicino al promotore di un gene
e LacZ viene spesso espresso seguendo il pattern spaziale e temporale
del gene nel quale l’elemento si è inserito
Gli elementi P di Drosophila: Enhancer trap
Ibridazione in situ
Colorazione β-gal
Gli elementi P di Drosophila: Misexpression
•  L’elemento P{EP} fa l’opposto di una enhancer trap:
invece di sfruttare le regioni regolative esistenti vicino al sito di inserzione ha una sequenza
UAS che modifica l’espressione del gene nel quale è inserito
• 
Se l’elemento P si inserisce vicino al 5’ di un gene, nel giusto orientamento,
l’espressione di quel gene può essere indotta esprimendo Gal4
Gli elementi P di Drosophila: Misexpression
Gli elementi P di Drosophila: gene disruption
• 
Non è necessariamente vero che ogni inserzione di elementi P abbia come risultato la
distruzione di un gene: non si sono evoluti per quello!
• 
• 
• 
Lo scopo dei progetti di gene disruption è di introdurre una inserzione
per distruggere ogni gene
Esistono costrutti che invece sono stati disegnati con lo scopo di assicurare un’alta
frequenza di distruzione genica
Doppio tagging di P{GT1} – tutti gli inserti che esprimono white e Gal4 distruggono un gene
Il sistema binario Gal4/UAS
Il sistema binario Gal4/UAS nel progetto Brainbow
I costrutti UAS-dBrainbow hanno una seq UAS che permette l’espressione
controllata a livello di ogni singola cellula tramite Gal4
• 
• 
La ricombinazione dovuta a Cre avviene a livello dei diversi siti lox in
maniera stocastica con un effetto sul colore finale espresso diverso,
cellula per cellula
• 
• 
La ricombinazione è irreversibile
Per comodità le proteine fluorescenti hanno anche dei tag
Il sistema binario Gal4/UAS nel progetto Brainbow
Visualizzazione endogeno
Colorazione con anticorpi specifici
Drosophila come modello di neurodegenerazione
Modello di neurodegenerazione nel moscerino
A. 
B. 
elav-GAL4/+
elav-GAL4/+; UAS-tau
R406W/+
V Khurana et al, Curr Biol, 2006
CW Wittmann et al, Science, 2001
Modello di neurodegenerazione nel moscerino
mutant tau
Day 0: normal flies
Day 10: brain nurodegeneration
TUNEL + cells ↑
PCNA + cells ↑
PH3 + cells ↑
A, C, E, G: elav-GAL4/+
B, D, F, H: elav-GAL4/+; UAS-tau
R406W/+
V Khurana et al, Curr Biol, 2006
CW Wittmann et al, Science, 2001
Modello di neurodegenerazione nel moscerino:
studio di un fattore trascrizionale
Genomic DNA
P<0.01
X
FT
Cross-link and shear
X
X
FT
X
normale
Y
X
neurodeg
IP with
α-FT
FT
control
qPCR
purify
amplify
label
Hybridization
Whole fly
genome
microarray
Merlo et al, submitted
[email protected]