Transgenesi in Drosophila melanogaster Biologia dello sviluppo – Tor Vergata Dott.ssa Merlo 22 Nov 2013 Riassunto schematico della lezione Storia dell’utilizzo di Drosophila come modello da laboratorio e descrizione del modello Drosophila transgenica: modi per ottenere la transgenesi, funzione ed utilizzo Drosophila come modello di neurodegenerazione Storia dell’utilizzo di Drosophila come modello da laboratorio e descrizione del modello Thomas Hunt Morgan 1866 – 1945 • Biologo americano che diede inizio alla Genetica Moderna, non solo basata sulle osservazioni ma sulla sperimentazione. Era interessato alla comprensione dei fattori ereditari, dove erano e come venivano trasferiti da generazione in generazione. • Dopo vari anni di insegnamento si trasferisce alla Columbia University dove apre la sua famosa “Fly Room”. Voleva capire la relazione fra ereditarietà e mutazione. + • Esaminando migliaia e migliaia di moscerini con microscopio e lenti di ingrandimento, Morgan ed i suoi colleghi confermarono la teoria cromosomica dell’ereditarietà “I geni si trovano sui cromosomi come delle perle in una collana e che alcuni geni sono legati, “linked” (sono cioè sullo stesso cromosoma e vengono ereditati insieme).” Uno dei suoi studenti, Alfred Sturtevant, creò la prima mappa genica, una pietra miliare in genetica. Nel 1933 riceve il Premio Nobel in Medicina Adattato da http://www.nature.com/scitable/topicpage/thomas-hunt-morgan-the-fruitfly-scientist-6579789 Teoria di Sutton-Boveri teoria cromosomica dell’ereditarietà + Esperimento di Morgan XX XY XX XY P XX F1 XX + F: rossi M: ½ rossi, ½ bianchi X Y X XX XX XY XY XY F: rossi M: bianchi F e M: rossi X XY F: ½ rossi, ½ bianchi M: ½ rossi, ½ bianchi F2 X Y X X XX XX XY XY Nuesslein-Volhard, Wieschaus and Lewis Ognuno dei tre è stato coinvolto nella ricerca sui geni coinvolti nel controllo dello sviluppo della Drosophila. Molti dei geni studiati da Nuesslein-Volhard, Wieschaus and Lewis hanno anche importanti funzioni durante lo sviluppo embrionale dell’uomo. Edward B. Lewis 1918 – 2004 Lewis: + Christiane Nüsslein-Volhard 1942 determinò che un paio extra di ali osservato in una naturale mutazione di Drosophila era dovuto ad una duplicazione di un intero segmento del corpo. E il gene che doveva controllare il bilanciamento del moscerino era perso. Altri geni nell’embrione in seguito avevano trasformato il segmento del corpo in un paio extra di ali (Bithorax complex: torace doppio). Nüsslein-Volhardis e Wieschaus: Determinarono la funzione dei geni coinvolti nella segmentazione dell’embrione di Drosophila. Il lavoro pioneristico sui geni omeotici ha indotto altri scienziati ad esaminare famiglie di geni analoghi in organismi superiori. Nel 1995 ricevono il Premio Nobel in Medicina Eric F. Wieschaus 1947 Geni omeotici + Geni Hox nei mammiferi + Vantaggi dell’uso di Drosophila m. come modello Insetto piccolo, facile da mantenere in laboratorio (anche a temperatura ambiente), non richiede molta cura e non è dispendioso mantenere anche colture estese I moscerini possono essere anestetizzati facilmente e I singoli individui possono essere manipolati senza necessità di attrezzature costose o sofisticate La Drosophila è sessualmente dimorfica (maschi e femmine possono essere distinti facilmente). È quindi facile ottenere delle vergini, utili per l’incrocio con altri transgenici Se ne conosce l’intero genoma (escluso le regioni altamente ripetute) ed esiste una quantità enorme di reagenti disponibili (loss of function, gain of function, etc). Il ciclo vitale è molto corto e quindi permette di studiare anche fenomeni come l’invecchiamento o le malattie neurodegenerative. Ciclo Ciclo vitale vitale di di Drosophila Drosophila http://www.youtube.com/watch?v=wm_cfjhgqeM Il genome umano è composto da 23 paia di cromosomi ≈20.000-25.000 geni Genoma sequenziato parzialmente nel 2001 (90%) e completato nel 2003 Il genome del moscerino è composto da 4 paia di cromosomi ≈ 14.000 geni Genoma sequenziato nel 2000 Il genoma del moscerino è composto da 4 paia di cromosomi ≈ 14.000 geni Genoma sequenziato nel 2000 Ad oggi solo di una parte dei gene è conosciuta la funzione Modalità di genetica “inversa” – reverse genetics sequenza di un determinato gene -> fenotipo corrispondente (la genetica classica) Analisi del fenotipo -> determinazione di un particolare genotipo 1. 2. Mutagenesi indotta da radiazioni ionizzanti, sostanze chimiche o elementi trasponibili Mutagenesi diretta ad interferire con la funzione di un gene specifico (gene targeting, RNAi lines) Mappatura genetica di Drosophila http://www.youtube.com/watch?v=YAvwvudcwuk Drosophila transgenica: modi per ottene la transgenesi, funzione ed utilizzo Mutagenesi indotta da radiazioni, sostanze chimiche o elementi trasponibili Radiazioni ionizzanti (raggi X) • produzione di DSBs (double strand breaks) nel DNA • mutazioni identificabili citologicamente osservando i cromosomi politenici • mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto Mutagenesi con agenti chimici (EMS) • Etilmetansulfonato, mutageno più usato: facile da amministrare, causa la più alta frequenza di mutazioni • Mutazioni di singole basi (point mutations) • Seguendo il protocollo standard si ottiene un alto tasso di mutazione di 1:1,000 (gene medio) • Difficile e laborioso identificare i punti di mutazione ed associarli a specifici geni Mutagenesi mediata da trasposoni (P-elements) • Inserzione di elementi P all’interno di un gene o nella regione di regolazione genica • Mutazioni facilmente identificabili perchè l’elemento P può fare da tag • Esiste una collezione enorme esistente (Bloomington) che contiene 1/4 dei geni essenziali • L’inserzione non è casuale, ci sono degli hot spots Elementi genetici trasponibili Gli elementi trasponibili sono caratteristica intrinseca del genoma di tutti gli organismi viventi e contribuiscono in maniera sostanziale alla variabilità genetica Gli elementi trasponibili negli eucarioti possono essere divisi in due categorie principali: • Classe I (copy and paste): si muovono tramite un intermedio ad RNA, richiedono la retrotrascrizione (retrotrasposoni) ed in genere hanno long terminal repeats (LTR) • Classe II (cut and paste): fanno trasposizione da DNA a DNA (DNA trasposoni) e hanno ripetizioni invertite alle loro estremità. Questo tipo di trasposoni è autonomo perché codifica per una trasposasi che permette la trasposizione in una nuova posizione cromosomica Elementi genetici trasponibili in Drosophila m. Si pensa che un 10% del genoma di Drosophila sia MOBILE Elementi copia-simili Hanno ripetizioni terminali dirette costituite a loro volta da piccoli tratti ripetuti e invertiti e hanno una seq bersaglio duplicata, presente in singola copia prima dell’inserimento Elementi FB (fold back) + Seq eterogenee ma omologhe con dimensioni comprese tra le poche centinaia e le varie migliaia di basi. Sono costituiti da una lunga sequenza terminale invertita: a volte è presente anche una sequenza centrale. Le seq terminali invertite sono a loro volta fatte di moduli di ripetizione diretta. Non è noto se usino una trasposasi. Possono ripiegarsi su se stesse formando strutture secondarie. La mutazione può essere dovuta sia all’inserimento dell’elemento nel gene oppure intorno alle regioni di controllo dell’espressione Elementi P Costituiti da ripetizioni terminali invertite perfette di 31bp. In genere gli elementi sono lunghi 2.9kb o hanno strutture che fanno pensare ad una comune origine di 2.9kb. L’elemento di 2.9kb contiene l’informazione per codificare tre proteine Disgenesi degli ibridi: la scoperta degli elementi P Gli elementi P di Drosophila • • Piccoli trasposoni con ripetizioni terminali invertite di 31bp Contengono un gene per la trasposasi, che comprende quattro esoni • Per poter essere competente per la trasposizione l’elemento P deve avere poche centinaia di paia di basi • In genere viene introdotto un marcatore genico per il colore degli occhi (white, w+ o rosy, ry+) in modo da seguire l’integrazione e l’escissione fenotipicamente • I normali ceppi di laboratorio non posseggono elementi P quindi le inserzioni sono stabili La trasposizione può essere indotta a piacimento introducendo la trasposasi • La trasposizione avviene solo nelle cellule germinali Gli elementi P di Drosophila: utilizzo in laboratorio + Gli elementi P di Drosophila: vari utilizzi • In genere viene introdotto un marcatore genico per il colore degli occhi (white, w+ o rosy, ry+) in modo da seguire fenotipicamente l’integrazione e l’escissione • I normali ceppi di laboratorio non posseggono elementi P quindi le inserzioni sono stabili La trasposizione può essere indotta a piacimento introducendo la trasposasi Gli elementi P di Drosophila: Enhancer trap • Sono costituiti da un gene LacZ fuso al promotore della trasposasi all’estremità 5’ dell’elemento P • L’espressione da questo promotore dipende dalle regioni regolative in prossimità del punto di inserimento • Spesso gli elementi P si inseriscono vicino al promotore di un gene e LacZ viene spesso espresso seguendo il pattern spaziale e temporale del gene nel quale l’elemento si è inserito Gli elementi P di Drosophila: Enhancer trap Ibridazione in situ Colorazione β-gal Gli elementi P di Drosophila: Misexpression • L’elemento P{EP} fa l’opposto di una enhancer trap: invece di sfruttare le regioni regolative esistenti vicino al sito di inserzione ha una sequenza UAS che modifica l’espressione del gene nel quale è inserito • Se l’elemento P si inserisce vicino al 5’ di un gene, nel giusto orientamento, l’espressione di quel gene può essere indotta esprimendo Gal4 Gli elementi P di Drosophila: Misexpression Gli elementi P di Drosophila: gene disruption • Non è necessariamente vero che ogni inserzione di elementi P abbia come risultato la distruzione di un gene: non si sono evoluti per quello! • • • Lo scopo dei progetti di gene disruption è di introdurre una inserzione per distruggere ogni gene Esistono costrutti che invece sono stati disegnati con lo scopo di assicurare un’alta frequenza di distruzione genica Doppio tagging di P{GT1} – tutti gli inserti che esprimono white e Gal4 distruggono un gene Il sistema binario Gal4/UAS Il sistema binario Gal4/UAS nel progetto Brainbow I costrutti UAS-dBrainbow hanno una seq UAS che permette l’espressione controllata a livello di ogni singola cellula tramite Gal4 • • La ricombinazione dovuta a Cre avviene a livello dei diversi siti lox in maniera stocastica con un effetto sul colore finale espresso diverso, cellula per cellula • • La ricombinazione è irreversibile Per comodità le proteine fluorescenti hanno anche dei tag Il sistema binario Gal4/UAS nel progetto Brainbow Visualizzazione endogeno Colorazione con anticorpi specifici Drosophila come modello di neurodegenerazione Modello di neurodegenerazione nel moscerino A. B. elav-GAL4/+ elav-GAL4/+; UAS-tau R406W/+ V Khurana et al, Curr Biol, 2006 CW Wittmann et al, Science, 2001 Modello di neurodegenerazione nel moscerino mutant tau Day 0: normal flies Day 10: brain nurodegeneration TUNEL + cells ↑ PCNA + cells ↑ PH3 + cells ↑ A, C, E, G: elav-GAL4/+ B, D, F, H: elav-GAL4/+; UAS-tau R406W/+ V Khurana et al, Curr Biol, 2006 CW Wittmann et al, Science, 2001 Modello di neurodegenerazione nel moscerino: studio di un fattore trascrizionale Genomic DNA P<0.01 X FT Cross-link and shear X X FT X normale Y X neurodeg IP with α-FT FT control qPCR purify amplify label Hybridization Whole fly genome microarray Merlo et al, submitted [email protected]