lezione9-2017trasformazioneDrosophila2
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Sistema PM • 30/50 copie di elementi P presenti nel genoma • La TRASPOSASI funziona solo nelle cellule germinali • Elementi incompleti possono saltare se hanno le 31 bp Spradling e Rubin hanno dimostrato che la DISGENESIA degli IBRIDI si poteva indurre anche introducendo solo un elemento P clonato, nel genoma! Hanno usato il plasmide p25.1 che conteneva l ’ elemento P completo di 2.9 kb Era necessario dimostrare che questo elemento P introdotto dall’esterno funzionasse e quindi potesse essere poi usato come vettore per trasferimento di geni La mutazione singed weak La mutazione singed weak (snw) : • altera la morfologia dei peli della Drosophila • mappa sul cromosoma X • è dovuta alla presenza nel locus di un singolo elemento P incompleto • il ceppo con questa mutazione è un ceppo M ’ (non produce né trasposasi, né repressore) -> ha le 31 bp sn w (ceppo M’) (F1) X X (ceppo P) Incrocio disgenico (ceppo M) Alcuni maschi della progenie di questo incrocio mostravano un fenotipo sn + o sn extreme -> l’elemento P incompleto nel locus singed si era mosso L’elemento P incompleto della mutazione singedweak si muove in seguito a disgenesia La mutazione singedweak può rappresentare un ottimo test per saggiare la funzionalità di un elemento P inserito dall’esterno Microiniettando l’elemento P contenuto nel plasmide p25.1 in uova snw (citotipo M) e verificando la comparsa dei due fenotipi sne e sn +, si può testare se un elemento P, clonato e fornito per microiniezione, provoca HD. Fasi dello sviluppo di Drosophila melanogaster ovocita A Embrione 10 h P segmenti Blastoderma sinciziale 1,5 h nuclei del blastoderma sinciziale cellule polari Blastoderma cellulare 3 h Larva alla schiusa 24 h cellule del blastoderma cellule polari Adulto 12 g Gastrula 3,5 h mesoderma endoderma ectoderma Stadi precoci nello sviluppo di Drosophila melanogaster Stadio 1 Uovo appena deposto 10-15 min Stadio 2 Divisioni precoci 15-90 min Stadio 3 Formazione delle cellule polari 8090 min SINCIZIO : i nuclei si dividono ma restano nello stesso citoplasma Cellule polari Stadio di preblastoderma: stadio in cui si effettua la MICROINIEZIONE I nuclei migrano alla periferia (256-512 nuclei) Stadio 4 Blastoderma sinciziale 90 -150 min Stadio 5 Cellularizzazione 150-190 min BLASTODERMA sinciziale dopo 9 divisioni cellulari (512-3200 nuclei) BLASTODERMA cellulare dopo 13 divisioni cellulari 5000 cellule Razionale dell’esperimento Stadio di preblastoderma sn w di CITOTIPO M Microiniettato p25.1 (embrioni G0) Le uova si sviluppano in adulti e dopo circa 12 giorni….. adulte G0 X CITOTIPO M Progenie G1-> selezionare maschi sn+ e sn e Esperimenti di ibridazione in situ hanno dimostrato che elementi P erano inseriti nel genoma; e che la mutazione, in incroci successivi con ceppi M, risultava stabile Un elemento P fornito dall’esterno mediante microiniezione produce gli stessi effetti di un incrocio disgenico e si inserisce in varie parti del genoma MICROMANIPOLATORE Descrizione della tecnica della microiniezione in Drosophila • raccolta degli embrioni preblastodermici • rimozione del corion (manuale o ipoclorito 2%) MICROSCOPIO A • essiccamento (gel di silice) embrioni decorionati P • iniezione del DNA mediante un MICROMANIPOLATORE scotch ago per iniettare MICROMANIPOLATORE Valvola a 3 vie Valvola micrometrica Microsiringa Hamilton 100ml olio minerale siringa da 10 ml Produzione di vettori per la microiniezione L’elemento P introdotto nelle cellule uovo garantisce l’inserzione; perché il sistema sia efficace è necessario disporre anche di un sistema di SELEZIONE per identificare tra la progenie quella che ha il “costrutto” inserito Il primo marcatore usato per la trasformazione in Drosophila è stato il gene “rosy ” Frammento del gene rosy di 7,2 kb Repeat di 31 bp p[ry +] pUC8 Repeat di 31 bp L’esperimento con snw ha dimostrato che la TRASPOSASI può essere fornita da un elemento P separato. Se si usa un elemento P modificato che produce la trasposasi e NON SI INTEGRA (perché manca delle 31 bp), chiamato “P helper” si può provare ad inserire nel genoma un “ costrutto” con qualunque cosa tra le 31bp p 25.7wing clipper (P helper) Repeat di 31 bp Produce una trasposasi di 87kd Non ha le ultime 23 bp dell’ IR e NON SI INTEGRA Trasformazione con il gene “rosy” P Iniezione dell ’ elemento P , ad es. p[ry +] e dell ’ elemento P helper nel plasma polare A Il 15% degli embrioni sopravvive e produce gli ADULTI Moscerini adulti G0 p[ry +] è integrato in alcune cellule germinali ma i moscerini non presentano il fenotipo rosy + Il 40% di questi moscerini non è fertile G0 Non hanno l’elemento inserito ry-/ryOcchio rosato X ry-/ryIndividui G1 p[ry +] ; ry-/ryOcchio ROSSO Hanno l’elemento inserito Vettori P sviluppati per la Drosophila Carnegie 20 polylinker pUC8 Frammento del gene rosy di 7,2 kb Repeat di 31 bp Repeat di 31 bp p[ry +] Qualunque gene inserito nel polylinker di questo vettore viene inserito nel genoma ed i moscerini che lo portano avranno l’occhio di colore rosso e sono facilmente identificabili • in seguito sono stati sviluppati altri vettori con geni diversi; tra questi il gene white privato di alcuni introni e quindi chiamato “miniwhite”; ha la stessa selezione del Carnegie20 • un altro tipo di vettore favorisce la selezione perché permette la crescita solo degli embrioni transgenici : pUChsneo HindIII PstI P SalI BamHI SmaI EcoRI pUC8 hs neoR P Il gene neo codifica per una FOSFOTRASFERASI che inattiva la neomicina (ed anche sostanze simili come la G418) che inibisce la funzione dei ribosomi Trasformazione con il vettore pUChsneo + gene di interesse P Iniezione dell ’ elemento P , ad es. pUChsneo e dell ’ elemento P helper nel plasma polare A Moscerini adulti G0 pUCHSneo è integrato in alcune cellule germinali G0 X individui con citotipo M Individui G1 tenuti a crescere su un terreno contenente G418 a temperatura elevata (x attivare il promotore Heat Shock- HS) nascono solo se hanno il costrutto inserito Gli elementi P sono utili strumenti per la MUTAGENESI Il processo di trasposizione degli elementi P può essere semplificato e usato con lo specifico scopo di ottenere mutanti per HD, usando linee di Drosophila costruite apposta per far “saltare” i trasposoni con appropriati incroci genetici. Mutator female (ha l’ elemento P incompleto (con le 31 bp, senza trasposasi) Jump-Starter [ha una TRASPOSASI funzionale (JS) senza le 31 bp] JS IP IP JS IP IP In embrioni in cui sono presenti sia la trasposasi (JS) che IP, gli elementi P incompleti possono muoversi e spostarsi in altri siti genomici creando NUOVE MUTAZIONI che sono selezionate con incroci appropriati IP Identificazione e messa “a ceppo” di nuove mutazioni Selvatico mutante IP Nuovo sito di inserzione JS Si cercano, nella progenie mutanti per il fenotipo voluto che non abbiano il cromosoma con JS Si rende così possibile clonare il gene di interesse per “trasposon tagging” I trasposoni P, oltre che per la mutagenesi e l’inserimento di sequenze di interesse nel genoma di Drosophila, si sono rivelati utilissimi per molti altri scopi: •identificare geni espressi in specifici tessuti (linee enhancertrap) •Studio delle regioni regolatrici di specifici geni Vettore P (enhancer trap) Un elemento enhancer-trap è un elemento P, che contiene un gene definito “reporter”, molto spesso si tratta del gene della gal sotto il controllo di un promotore debole. Perché questo elemento abbia dei livelli di espressione accettabili è necessario che l’elemento si inserisca nel genoma in vicinanza di un enhancer di un gene endogeno. L’espressione del gene viene svelata con un substrato cromogeno (di solito Xgal-> 5-bromo4-cloro-indolyl--D-Galattopiranoside) Questo permetterà di identificare, nella zona in cui l’elemento si è inserito, un gene che è normalmente espresso nel tessuto o nello stadio in cui sarà possibile osservare la colorazione dovuta alla gal e sarà inoltre possibile “recuperare” le sequenze fiancheggianti il sito di inserzione dell’elemento! O'Kane and Gehring 1987 Si sono ottenute + di 4000 linee trasformate “enhancer-trap” e sono state usate sia per la classica analisi fenotipica per cercare mutanti, qualora l’elemento si sia inserito all’interno di un gene codificante o per l’analisi di espressione, qualora l’elemento si sia inserito in vicinanza di un enhancer (Bier et al. 1989; Spradling et al. 1995).
