lezione9-2017trasformazioneDrosophila2

Sistema PM
• 30/50 copie di elementi P presenti nel genoma
• La TRASPOSASI funziona solo nelle cellule germinali
• Elementi incompleti possono saltare se hanno le 31 bp
Spradling e Rubin hanno dimostrato che la DISGENESIA degli
IBRIDI si poteva indurre anche introducendo solo un elemento P
clonato, nel genoma!
Hanno usato il plasmide p25.1 che conteneva l ’ elemento P
completo di 2.9 kb
Era necessario dimostrare che questo elemento P introdotto
dall’esterno funzionasse e quindi potesse essere poi usato come
vettore per trasferimento di geni
La mutazione singed weak
La mutazione singed weak (snw) :
• altera la morfologia dei peli della Drosophila
• mappa sul cromosoma X
• è dovuta alla presenza nel locus di un singolo elemento P
incompleto
• il ceppo con questa mutazione è un ceppo M ’ (non
produce né trasposasi, né repressore) -> ha le 31 bp
sn w (ceppo M’)
(F1)
X
X
(ceppo P)
Incrocio disgenico
(ceppo M)
Alcuni maschi della progenie di questo incrocio mostravano un fenotipo sn
+ o sn extreme -> l’elemento P incompleto nel locus singed si era mosso
L’elemento P incompleto della mutazione singedweak si
muove in seguito a disgenesia
La mutazione singedweak può rappresentare un ottimo test
per saggiare la funzionalità di un elemento P inserito
dall’esterno
Microiniettando l’elemento P contenuto nel plasmide
p25.1 in uova snw (citotipo M) e verificando la
comparsa dei due fenotipi sne e sn +, si può testare se
un elemento P, clonato e fornito per microiniezione,
provoca HD.
Fasi dello sviluppo di Drosophila melanogaster
ovocita
A
Embrione 10 h
P
segmenti
Blastoderma
sinciziale 1,5 h
nuclei del blastoderma sinciziale
cellule polari
Blastoderma
cellulare 3 h
Larva alla
schiusa 24 h
cellule del blastoderma
cellule polari
Adulto 12 g
Gastrula 3,5 h
mesoderma
endoderma
ectoderma
Stadi precoci nello sviluppo di Drosophila melanogaster
Stadio 1
Uovo appena deposto
10-15 min
Stadio 2
Divisioni precoci
15-90 min
Stadio 3
Formazione delle
cellule polari 8090 min
SINCIZIO : i nuclei si dividono ma
restano nello stesso citoplasma
Cellule
polari
Stadio di preblastoderma:
stadio in cui si effettua la
MICROINIEZIONE
I nuclei migrano alla periferia (256-512 nuclei)
Stadio 4
Blastoderma
sinciziale
90 -150 min
Stadio 5
Cellularizzazione
150-190 min
BLASTODERMA sinciziale
dopo 9 divisioni cellulari
(512-3200 nuclei)
BLASTODERMA cellulare
dopo 13 divisioni cellulari
5000 cellule
Razionale dell’esperimento
Stadio di preblastoderma
sn w di CITOTIPO M
Microiniettato
p25.1
(embrioni G0)
Le uova si sviluppano in adulti e dopo circa 12 giorni…..
adulte G0 X
CITOTIPO M
Progenie G1-> selezionare maschi sn+ e sn e
Esperimenti di ibridazione in situ hanno dimostrato che elementi P erano inseriti nel
genoma; e che la mutazione, in incroci successivi con ceppi M, risultava stabile
Un elemento P fornito dall’esterno mediante microiniezione produce gli stessi effetti di un
incrocio disgenico e si inserisce in varie parti del genoma
MICROMANIPOLATORE
Descrizione della tecnica della microiniezione in Drosophila
• raccolta degli embrioni preblastodermici
• rimozione del corion (manuale o ipoclorito 2%)
MICROSCOPIO
A
• essiccamento (gel di silice)
embrioni
decorionati
P
• iniezione del DNA mediante un MICROMANIPOLATORE
scotch
ago per
iniettare
MICROMANIPOLATORE
Valvola a 3 vie
Valvola micrometrica
Microsiringa Hamilton 100ml
olio
minerale
siringa da 10 ml
Produzione di vettori per la microiniezione
L’elemento P introdotto nelle cellule uovo garantisce l’inserzione; perché il sistema sia
efficace è necessario disporre anche di un sistema di SELEZIONE per identificare tra la
progenie quella che ha il “costrutto” inserito
Il primo marcatore usato per la trasformazione in Drosophila è stato
il gene “rosy ”
Frammento del gene rosy di 7,2 kb
Repeat
di 31 bp
p[ry +]
pUC8
Repeat
di 31 bp
L’esperimento con snw ha dimostrato che la TRASPOSASI può essere fornita da un
elemento P separato. Se si usa un elemento P modificato che produce la trasposasi
e NON SI INTEGRA (perché manca delle 31 bp), chiamato “P helper” si può provare
ad inserire nel genoma un “ costrutto” con qualunque cosa tra le 31bp
p 25.7wing clipper (P helper)
Repeat
di 31 bp
Produce una trasposasi di 87kd
Non ha le ultime
23 bp dell’ IR e
NON SI INTEGRA
Trasformazione con il gene “rosy”
P
Iniezione dell ’ elemento
P , ad es. p[ry +] e
dell ’ elemento P helper
nel plasma polare
A
Il 15% degli embrioni sopravvive e produce gli ADULTI
Moscerini adulti G0
p[ry +] è integrato in alcune cellule germinali ma i
moscerini non presentano il fenotipo rosy +
Il 40% di questi moscerini non è fertile
G0
Non hanno
l’elemento
inserito
ry-/ryOcchio rosato
X ry-/ryIndividui G1
p[ry +] ; ry-/ryOcchio ROSSO
Hanno
l’elemento
inserito
Vettori P sviluppati per la Drosophila
Carnegie 20
polylinker
pUC8
Frammento del gene rosy di 7,2 kb
Repeat
di 31 bp
Repeat
di 31 bp
p[ry +]
Qualunque gene inserito nel polylinker di questo vettore viene inserito nel genoma ed i moscerini che
lo portano avranno l’occhio di colore rosso e sono facilmente identificabili
• in seguito sono stati sviluppati altri vettori con geni diversi; tra questi il gene white privato di alcuni
introni e quindi chiamato “miniwhite”; ha la stessa selezione del Carnegie20
• un altro tipo di vettore favorisce la selezione perché permette la crescita solo degli embrioni
transgenici : pUChsneo
HindIII PstI
P
SalI
BamHI SmaI EcoRI
pUC8
hs
neoR
P
Il gene neo codifica per una FOSFOTRASFERASI che inattiva la neomicina (ed anche sostanze
simili come la G418) che inibisce la funzione dei ribosomi
Trasformazione con il vettore pUChsneo + gene di interesse
P
Iniezione dell ’ elemento
P , ad es. pUChsneo e
dell ’ elemento P helper
nel plasma polare
A
Moscerini adulti G0
pUCHSneo è integrato in alcune cellule germinali
G0
X
individui con citotipo M
Individui G1 tenuti a crescere su un terreno contenente G418 a temperatura elevata
(x attivare il promotore Heat Shock- HS)
nascono solo se hanno il costrutto inserito
Gli elementi P sono utili strumenti per la MUTAGENESI
Il processo di trasposizione degli elementi P può essere semplificato e usato con lo specifico scopo di
ottenere mutanti per HD, usando linee di Drosophila costruite apposta per far “saltare” i trasposoni con
appropriati incroci genetici.
Mutator female (ha l’ elemento
P incompleto (con le 31 bp,
senza trasposasi)
Jump-Starter [ha una TRASPOSASI
funzionale (JS) senza le 31 bp]
JS
IP
IP
JS
IP
IP
In embrioni in cui sono presenti sia la trasposasi (JS) che IP, gli elementi P incompleti
possono muoversi e spostarsi in altri siti genomici creando NUOVE MUTAZIONI che sono
selezionate con incroci appropriati
IP
Identificazione e messa “a ceppo” di nuove mutazioni
Selvatico
mutante
IP Nuovo sito di inserzione
JS
Si cercano, nella progenie mutanti per il fenotipo voluto
che non abbiano il cromosoma con JS
Si rende così possibile clonare il gene di interesse
per “trasposon tagging”
I trasposoni P, oltre che per la mutagenesi e l’inserimento di
sequenze di interesse nel genoma di Drosophila, si sono rivelati
utilissimi per molti altri scopi:
•identificare geni espressi in specifici tessuti (linee enhancertrap)
•Studio delle regioni regolatrici di specifici geni
Vettore P (enhancer trap)
Un elemento enhancer-trap è un elemento P, che contiene un gene definito “reporter”,
molto spesso si tratta del gene della gal sotto il controllo di un promotore debole.
Perché questo elemento abbia dei livelli di espressione accettabili è necessario che
l’elemento si inserisca nel genoma in vicinanza di un enhancer di un gene endogeno.
L’espressione del gene viene svelata con un substrato cromogeno (di solito Xgal->
5-bromo4-cloro-indolyl--D-Galattopiranoside)
Questo permetterà di identificare, nella zona in cui l’elemento si è
inserito, un gene che è normalmente espresso nel tessuto o nello
stadio in cui sarà possibile osservare la colorazione dovuta alla gal e
sarà inoltre possibile “recuperare” le sequenze fiancheggianti il sito di
inserzione dell’elemento!
O'Kane and Gehring 1987
Si sono ottenute + di 4000 linee trasformate “enhancer-trap” e sono state usate sia per la
classica analisi fenotipica per cercare mutanti, qualora l’elemento si sia inserito all’interno
di un gene codificante o per l’analisi di espressione, qualora l’elemento si sia inserito in
vicinanza di un enhancer (Bier et al. 1989; Spradling et al. 1995).