Proteine - CusMiBio

Proteine:
dove, quando e perchè
Paolo Plevani
Milano, CusMiBio 21-23 Settembre 2011
Il dogma centrale della Biologia Molecolare DNA
Trascrizione
RNA
Traduzione
Proteina
Proteoma Proteome = Proteins encoded by the genome Il proteoma comprende tu9e le proteine espresse in una data cellula in un certo momento, incluse tu9e le isoforme della stessa proteina (splicing alterna=vo) e le loro modificazioni post-­‐traduzionali. Mentre il genoma è costante per una data cellula ed iden=co per tu9e le cellule di un organismo (~ 25.000 geni nell’uomo), il numero di proteine prodo9e è molto piu’ elevato (un fa9ore 10-­‐100) in virtù del meccanismo , di splicing alterna=vo e delle modificazioni post-­‐traduzionali. Inoltre, il proteoma è dinamico nel tempo e in risposta a fa9ori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi =pi cellulari. Proteine:
dove, quando e perchè
Analisi di proteine:
Tanti metodi:
Elettroforesi e Western Blot
Elettroforesi su gel
Metodo per separare macro-­‐molecole (Proteine, DNA, RNA, etc.) sulla base delle loro proprieta’ chimico-­‐fisiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica ele9rica Elettroforesi di Proteine
• Piu’ complessa dell’ele9roforesi di DNA – Proteine diverse hanno cariche diverse – Le proteine variano molto per forma (stru9ura) • Generalmente il gel e’ fa9o di poliacrilammide Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? • I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compa9a • I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio • Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA – Amminoacido medio = 110 Da – Paio di nucleo=di medio = 649 Da – 1 kilobase di DNA = 650 kDa – 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa Ele9roforesi di proteine Condizioni Non Denaturan= • Non-­‐denaturante (na=vo): nessun pre-­‐tra9amento delle proteine prima dell’ele9roforesi – Le proteine conservano la loro stru9ura 2° e 3°; pon= disolfuro etc. – Le proteine conservano la loro carica normale – Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome
Carica
Massa
Proteina Q
+3
30kD
Proteina R
-4
42kD
Forma
Ele9roforesi di proteine in condizioni denaturan= • Le proteine sono tra9ate con SDS (detergente anionico) prima dell’ ele9roforesi (SDS-­‐PAGE) – Le molecole di SDS si legano alle proteine – Le proteine perdono la loro normale forma – Le proteine hanno tu9e lo stesso rapporto carica/massa – Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa
+3
30kD
-4
42kD
Carica Massa
SDS
-300 30kD
-420 42kD
SDS-­‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-­‐
PAGE) CH3
CH2
CH2
" SDS (Sodio Dodecil
CH2
Solfato)
CH2
e denatura le
CH2
proteine
 Aggiunge cariche
negative alle proteine
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
O
S
-
O
O
 Solubilizza
CH2
SDS
O
Proteina Nativa
Carica netta: -4
Proteina trattata con SDS
Carica netta: Molto (-)
Come funziona un Gel SDS-­‐PAGE ? • Le proteine cariche nega=vamente si muovono verso l’ele9rodo posi=vo • Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente s-s
SDS, calore
Proteine con SDS
–
• Le proteine si separano per dimensione +
Estrazione delle proteine
Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine
e inibisce le proteasi cellulari
 Concentrazione dei sali
 Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS)
 pH
 Inibitori di proteasi
 Bassa temperatura (ghiaccio)
Proteasi
Inibitori proteasi:
Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF
Cosa c’e’ nel tampone di caricamento? • Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) • SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica nega=va complessiva • Glicerolo per rendere pesan= i campioni e farli scendere nei pozzee • Un agente riducente (DTT o β-­‐Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro • Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni SDS-PAGE
Colorazione con Blu di Coomassie
SDS-­‐PAGE: separazione di proteine in base al loro peso molecolare In presenza di SDS e di un riducente dei legami disolfuro, le
diverse proteine vengono separate in elettroforesi su gel
esclusivamente sulla base di differenze di peso molecolare
delle loro catene polipeptidiche.
Il Gel • Come funziona: – Stacking gel: 4-­‐5% gel superiore, pH 6.8 8-­‐14% gel separatore, pH 8.8 – Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-­‐acrilammide, formando una stru9ura a laece – Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS Il Gel Componen= del gel SDS-­‐PAGE • Soluzione di Acrilammide/Bis-­‐Acrilammide • Tris-­‐HCl pH 6.8 oppure Tris-­‐HCl pH 8.8 • SDS • ddH2O • TEMED • APS (ammonio persolfato) • Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS) • Come funziona: – Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente ele9rica Il Gel • Includere un marker di peso molecolare colorato • 10-­‐50ug di estra9o proteico totale • 0.1-­‐1ug di proteina purificata –
– Ioni Cloruro (-­‐) / Proteina / Glicina (+) Stacking
pH 6,8
– Si muovono verso il gel separartore (“resolving) Resolving
pH 8,8
• Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, perme9endo alle proteine di migrare nel gel separatore +
Il Gel • % di acrilammide consigliata • Dimensioni delle proteine 40-­‐200 kDa 21-­‐100 kDa 10-­‐40 kDa 8% 10% 12% Visualizzazione delle proteine nel gel
I due metodi piu’ usati sono:
Colorazione con il Coomassie Brilliant
Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere
visualizzato ~1ng di proteina per banda)
Coomassie staining
Silver staining
SDS-­‐PAGE: determinazione del peso molecolare di una proteina Stima dei
pesi
molecolari Western Bloeng Southern Blot: Per l’analisi del DNA.
(sonda = DNA o RNA).
Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA.
(sonda = DNA o RNA).
Western Blot: Per l’analisi delle proteine.
(sonda = anticorpo).
Cosa e’ un Western Blot? • Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante ele9roforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene iden=ficata mediante la sua reazione specifica con un an=corpo. A cosa serve il Western Blot?
Qual e’ la proteina che mi interessa? – SDS-­‐PAGE (non certo) • Si basa sul confronto di peso molecolare – Western blot (certo) • Si basa su una reazione specifica an=gene-­‐an=corpo –
?
+
Fasi di un Western Blot • Prima fase: ele,roforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) • Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo ele9rico) • Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’an=corpo e la membrana) Fasi di un Western Blot • Quarta fase: legame dell’an>corpo primario. (L’an=corpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) • Quinta fase: legame dell’an>corpo secondario. (L’an=corpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’an=corpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana) • Sesta fase: rivelazione o “detec>on”. (L’enzima coniugato all’an=corpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza) Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
Le proteine nel gel sono ancora in soluzione – Le bande diffondono e si confondono col tempo E’ necessaria l’immobilizzazione per: – Preservare in maniera permanente l’esperimento di ele9roforesi – Perme9ere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana – Fa9a di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon – Si usa l’ele9roforesi, in un processo de9o ‘bloeng’ Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
• Ele9robloeng – Apparato di trasferimento – Il gel e’ messo tra stra= di carta da filtro con la membrana a dire9o conta9o col gel sul lato verso l’ele9rodo posi=vo – Viene applicato un campo ele9rico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’ele9rodo posi=vo e si legano alla membrana – Fa9o a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine Apparato per il trasferimento “Semi-dry”
Western Blotting
-
Buffer-soaked
filter papers
+
Nitrocellulose
membrane
Gel
Buffer
Electrode
SDS-PAGE
Direction of
transfer
Assemble ‘sandwich’
Wet blotting
Graphite Electrode Plates
-
Stained
(Red
Ponceau)
+
Semi-dry blotting
Nitrocellulose with bound proteins
Western blot: terza fase
saturazione o “blocking”
• Per saturare i si= idrofobici liberi sulla membrana • Per prevenire il legame dell’an=corpo primario alla membrana stessa • La9e scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA) Western blot: quarta fase
incubazione con anticorpo primario
• L’an=corpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana • An=corpi come sonde: – Molto sensibili – Possono essere “prodoe” • Immunizzando una specie diversa (an=corpi policlonali) • Generando an=corpi monoclonali (mAb) – Economici Anticorpi
Ab + Ag
AbAg
Kd
Kd =
[Ab] = 10-9 M
[AbAg]
An=corpi An=corpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico an=gene, come un ba9erio o un virus, che neutralizza l’an=gene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. An=corpi policlonali Produzione • Immunizzazione ripetuta dell’animale con l’an=gene (pep=de, proteina purificata o ricombinante) • Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’an=corpo ed e’ purificato il siero • Il “pool” degli an=corpi riconosce mol= epitopi dell’an=gene usato per l’immunizzazione An=corpi monoclonali Riconoscono solo un epitopo Fusioni tra linfoci= B (milza/
linfonodi) e cellule di mieloma di topo Western blot: quinta fase
Incubazione con anticorpo secondario
An=corpi • An=corpo primario – Riconosce la proteina • An=corpo secondario – Lega l’an=corpo primario – Generalmente prodo9o in una specie diversa – Coniugato con un enzima – Il substrato dell’enzima sara’ conver=to in un prodo9o colorato – Puo’ anche essere radioaevo o fluorescente Western blot: sesta fase
rivelazione o “detection”
• Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) – Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato • Substra= Chemioluminescen= – Eme9ono luce se conver== dall’enzima – Possono essere visualizza= su lastre radiografiche • Marcatura radioaeva • An=corpi secondarii bio=nila= Western blot
HRP
Anticorpo primario
substrato
HRP
Anticorpo secondario
luce
Rivelazione
Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce
pg proteina
Le proteine possono essere modificate dopo la loro
sintesi: modificazioni post-traduzionali
Fosforilazione
Glicosilazione
Ubiquitinazione
etc…….
Tali modificazioni fanno variare il PM della proteina e, quindi,
possono essere evidenziabili dopo elettroforesi e western blot
La risposta cellulare a danni al DNA
Danni al DNA
Checkpoints di risposta a danni
Apoptosi
Ciclo cellulare
Replicazione DNA
Trascrizione
Riparazione e
ricombinazione
del DNA
•Molto conservati negli eucarioti: dal lievito all’uomo
•Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica e tumori
Il checkpoint innescato da danni al DNA è
una via di trasduzione dei segnali
Lievito
Mec1, Tel1, Ddc2,
Rad17, Mec3, Ddc1
Rad24,RFC
Uomo
Proteine sensori
Rad9, Rad53, Chk1
Trasduttori
RPA, Polα-primase,
Cdc28, Swi6, Pds1,
Cdc14, ...
Effettori
ATR, ATM, ATRIP,
hRAD1, hHUS1,
hRad9, hRAD17, RFC
BRCA1?, CHK2,
CHK1
RPA, p53,
CDC25, CDK, ...
DNA damage checkpoint in S. cerevisiae
RFC2-5
2
3
4
Rad24 5
Ddc2
Ddc1
P
P
P
P
Rad9
P
Rad9
P
P
Rad9
RPA
P
RPA
P
P
P
Ddc2
RPA
RPA
RPA
Mec3
RPA
Mec1
PRad53
P P
Rad9
Rad53
Targets
Rad53
FOSFORILAZIONI !!!!!!