ESEMPI DI DOMANDE PER IL CORSO DI INGEGNERIA PROTEICA
P450 – METABOLISMO DEI FARMACI
Discutere il ruolo del citocromo P450 nel metabolismo di xenobiotici, indicando nel ciclo catalitico le reazioni
di disaccoppiamento.
Discutere il ciclo catalitico del citotocromo P450 con le sue reazioni di disaccoppiamento
Discutere il ruolo dei citocromi P450 nel metabolismo dei farmaci.
L’enzima nativo del citochromo P450 BM3 e’ capace di catalizzare l’idrossilazione dell’acido laurico con un
rapporto stechiometrico NADPH:O2 di 1:1 per ogni molecola di acido laurico idrossilato che viene prodotto.
Un mutante di questo enzima, ottenuto per evoluzione diretta, catalizza la stessa reazione ma con un
rapporto stechiometrico NADPH:O2 di 3:2, con la formazione del 50% del prodotto idrossilato, paragonato
all’enzima nativo.
Spiegare questi risultati alla luce del ciclo catalitico di questa classe di enzimi.
Discutere come l’ingegneria proteica ha contribuito allo studio della struttura/funzione dei citocromi P450
Discuti la struttura-funzione dei citocromi P450 umani con particolare riferimento alla isoforma 2E1
Discuti la struttura-funzione dei citocromi P450 batterici con particolare riferimento al P450 BM3
Discuti gli enzimi coinvolti nel metabolismo di fase I e fase II dei farmaci.
Discuti il ruolo del polimorfismo nel metabolismo dei farmaci
Discuti il ruolo delle flavine monossigenasi (FMO) nel metabolismo dei farmaci, con particolare riferimento al
ciclo catalitico.
Illustra e valuta criticamente i metodi e protocolli sperimentali e in silico disponibili per HTS (high-throughputscreening) di farmaci.
Illustra e discuti che cosa si intente per QSAR (quantitative structure-activity relationship) nello sviluppo di
nuovi farmaci.
BIOSENSORI – TRASFERIMENTO ELETTRONICO
Descrivi esempi di biosensori di prima, seconda e terza generazione, facendo chiaro riferimento a tecniche
disponibili per lo studio delle proteine/enzimi immobilizzati.
Descrivi le tecniche elettrochimiche e di microscopia disponibili per lo sviluppo e lo studio di biosensori
amperometrici.
Ti e’ chiesto di pianificare un progetto di immobilizzazione di un enzima ossidoreduttasico per la costruzione
di un biosensore (ottico o amperometrico, a tua scelta).
Descrivi e discuti l’approccio che useresti nel raggiungere questo obiettivo tenendo conto della
massimizzazione della sensibilita’ del biosensore.
Ti e’ chiesto di pianificare un progetto di immobilizzazione di un enzima ossidoreduttasico per la costruzione
di un biosensore (ottico o amperometrico, a tua scelta).
Descrivi e discuti l’approccio che useresti nel raggiungere questo obiettivo tenendo conto della
massimizzazione della sensibilita’ del biosensore.
Discutere come l’ingegneria proteica ha contribuito allo studio del trasferimento elettronico mediato da
proteine
Descrivere e discutere i parametri che regolano il processo del trasferimento elettronico nelle biomolecole.
Data l’equazione di Marcus sul traferimento elettronico in matrici proteiche:
ket = (2!/h)V21,2 FC
Indicare il significato e il ruolo dei diversi termini dell’equazione.
RATIONAL DESIGN –EVOLUZIONE DIRETTA
Descrivere i due approcci usati in ingegneria proteica ‘disegno razionale’ e ‘evoluzione diretta’; indicare i
pre-requisiti richiesti dai due approcci, i loro vantaggi e svantaggi illustrandoli con due esempi in particolare.
Descrivi le procedure di PCR random e di DNA shuffling. Spiega con un esempio specifico come il metodo
di phage display puo’ essere usato per lo screening di libraries di binding proteins.
Descrivi le procedure di PCR random e di DNA shuffling e descrivi un esempio dove questi metodi sono stati
usati.
Spiega con un esempio specifico come il metodo di phage display puo’ essere usato per lo screening di
libraries di binding proteins.
Discuti in termini strutturali, cinetici e termodinamici il processo del folding delle proteine, con riferimento alle
teciche sperimentali disponibili per il loro studio.
Ti e’ dato da svolgere un progetto in cui devi produrre dei mutanti di un citocromo P450 batterico per mezzo
di evoluzione diretta.
Descrivi e discuti il protocollo che sceglieresti per la produzione di mutanti e, ispirandoti agli esempi della
letteratura descritti nelle lezioni, quale metodo di selezione useresti.
Illustrare il processo di sintesi peptidica in fase solida con un esempio di applicazione di questo campo di
ingegneria proteica
Ti e’ stato assegnato un progetto il cui obiettivo e’ di cambiare la specificita’ della “maltose binding protein”
da E. coli in modo che leghi selettivamente l’arabinosio e non il maltosio. Formula e descrivi in dettaglio le
procedure che sceglieresti per svolgere questo progetto. La risposta deve includere una discussione critica
dei vantaggi e svantaggi presentati dalle procedure scelte.
Hai risolto la struttura cristallografica di un enzima con un analogo dello stato di transizione legato nel sito
attivo. L’enzima ha un’attivita’ fosfatasica e tu rilevi dalla struttura tridimensionale che un residuo di arginina
interagisce con un gruppo fosforico dell’analogo dello stato di transizione. Proponi due mutazioni che tu
introdurresti per verificare l’importanza di questo residuo nell’interazione con il gruppo fosforico. La risposta
deve includere una discussione degli effetti esercitati sia sullo stato basale che sullo stato di transizione.
DE NOVO DESIGN
Descrivi i principi da seguire per il design de novo di fasci a quatto alfa-eliche.
Ti e’ stato chiesto di costruire una library combinatoriale di fasci di quattro alfa-"eliche. Descrivi nel dettaglio
le procedure che sceglieresti per lo svolgimento del progetto, con particolare riferimento alle tecniche che
useresti per fare uno screening funzionale della library.
Descrivi la procedura di sintesi peptidica in fase solida e fai un esempio in cui questa sia stata applicata alla
creazione di proteine de novo.
Dato il peptide di sequenza:
VKQLEDK-VEELLSK-VYHLENE-VARLKKL-VGE
a. Fare delle predizioni sulla struttura che adottera’;
b. Sulla base della tua predizione, conduci un’analisi strutturale in termini dell’orientamento degli
amino acidi nella struttura;
c. Identifica e descrivi le tecniche ed i metodi che useresti per lo studio della sua struttura e
stabilita’.
Descrivi la struttura secondaria, supersecondaria e terziaria delle proteine, con riferimento ai suoi vari
sottotipi. Discuti inoltre i parametri da considerare nella loro ingegnerizzazione.
Fai una rassegna dei principali metodi sperimentali a disposizione per lo studio della struttura e funzione
delle proteine ingegnerizzate.
Descrivi i vari tipi di eliche e strutture beta con riferimento alla loro accessibilita’ in termini di ingegneria
proteica de novo.
Descrivi la procedura che sceglieresti sia per costruire che per selezionare una library combinatoriale di
fasci di quattro !-"eliche.
