- Scuola di Microscopia
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I llum inazione strutturata, spinning disk e deconvoluzione Tecniche di Super Risoluzione XYZ a confronto Alessandro Rossi Bio-imaging specialist Outline: 1. Risoluzione di un sistema ottico 2. Sistemi confocali spinning disk 3. Sistemi superconfocali a illuminazione strutturata 4. Deconvoluzione 5. Il sistema perfetto? Uno, nessuno, centomila (l’applicazione è tutto) 1. Cosa vuol dire risoluzione in un sistema ottico ππππππ λ = 600ππππ, ππππ = 1.4, πππ΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ ≅ 261ππππ • La fisica descrive la luce come un flusso di particelle e come un’onda elettromagnetica. Le onde interferiscono (in questo caso purtroppo!) tra di loro • I fotoni che attraversano un obiettivo convergendo sul piano immagine creano quindi un pattern di interferenza, detto Airy pattern • Il disco centrale, o primo disco di Airy, ha raggio pari a πππ΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ λ = 0,61 ππππππππππ • Due punti luminosi infinitamente piccoli posti a una distanza “d” l’uno dall’altro, visti attraverso un sistema ottico, si considerano “risolti” se: ππ ≥ πππ΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ ≡ π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π ππππ (πΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆ ππππ π π π π π π π π π π π π π π π ) E’ il limite di risoluzione in qualunque sistema di microscopia ottica: lo scopo è superarlo… • Anche lungo l’asse z si produce un pattern di diffrazione periodico, in cui la prima discontinuità, o minimo, si trova a distanza zmin dal punto di fuoco (“n” in questo caso è l’indice di rifrazione del mezzo): π§π§ππππππ = 2 λππ ≡ π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π π ππ (ππππππππππ )2 ππππππ λ = 600ππππ, ππππ = 1.4, ππ = 1.518 π§π§ππππππ ≅ 929ππππ Infine allontanando l’obiettivo dal punto luminoso si otterranno sui vari piani z immagini fuori fuoco di esso via via più grandi e meno intense. Qualunque microscopio ottico trasforma quindi ogni singola sorgente luminosa secondo una funzione di trasporto detta PSF = Point Spread Function che definisce quindi un limite imposto alla risoluzione XYZ del sistema ottico Piano XY ππππππππππ Piano XZ ππππππππ Come superare il limite di diffrazione dato dalla PSF intrinseca di un sistema ottico per ottenere una Super Risoluzione? 1. Confocale Spinning Disk: rimozione ottica dei contributi fuori fuoco durante l’acquisizione 2. Sistemi a illuminazione strutturata: il campione viene illuminato con maschere periodiche. L’interazione tra pattern di illuminazione, la matrice di acquisizione e la PSF della struttura osservata permette di estrarre informazioni aggiuntive. 3. Deconvoluzione: applicazione matematica di una funzione inversa alla PSF sull’immagine già acquisita 1. Confocale Spinning Disk, l’idea di Nipkow: rimozione ottica dei contributi fuori fuoco durante l’acquisizione Layout ottico del sistema confocale spinning disk X-Light V2, Crest Optics (sessione pratica in Aula Nipkow) Miglioramento della risoluzione XY e Z in un confocale ottico: Attenuando i piani fuori fuoco si ottiene un aumento del contrasto in XY e in Z: la risoluzione aumenta al massimo di ~ 2 , se e solo se ππππππππ π»π»π»π»π»π»π»π» < πππ΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ π π π π π π ππππππππππππ π π π π π π ππππππππππ λ = 0,61 ππππππππππ λππ =2 (ππππππππππ )2 π π π π π π πππππΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆ ≥ 0,4 λ ππππππππππ λππ π π π π π π πππΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆπΆ ~1,4 (ππππππππππ )2 Vantaggi: uniformità di campo e velocità di acquisizione • • • 12 spirali di pin holes Copertura completa del campo di vista in 30° di rotazione (12 settori) Rotazione a 15.000 rpm (250 rps) • • 3000 immagini complete al secondo (il limite è quindi la telecamera) Disuniformità massima di illuminazione per esposizioni di 1 ms: ππ1 ππππ ≤ 1 = 2,7% 3 β 12 Risoluzione assiale (misurata con pinholes da 60 μm, ππππππππππππππππππ = 605ππππ, Obiettivo 60x oil 1,4 NA) Campione: Singolo bead fluorescente da 200 nm di diametro Axial Resolution (FWHM) 641 nm xy yz xz Nella sessione pratica in aula Nipkow vedremo molti di questi esempi… Spinning disk: Vantaggi… 1. Velocità di acquisizione: fino a 3000 immagini al secondo, il bottleneck reale è dato dalla telecamera e dal segnale di fluorescenza. L’acquisizione è simultanea su tutto il campo di vista, al contrario di quanto avviene nei Laser Scanning Microscopes 2. Bassissima fototossicità per long term timelapse: la densità ottica di illuminazione sul campione è molto bassa perché la scansione sul campo di vista viene fatta dai pin holes, non da un fascio laser focalizzato 3. Ottimizzato per sorgenti LED: rispetto ai laser non è richiesto alcun allineamento fine periodico, e i costi di acquisto e manutenzione sono molto bassi 4. Totalmente quantitativo: nessun algoritmo viene applicato all’immagine e il sistema non genera effetti non lineari …e svantaggi: 1. La risoluzione, soprattutto in z, è inferiore a quella dei sistemi a luce strutturata 2. Il cross-talk tra pin holes può produrre con campioni spessi un background che diminuisce il contrasto dell’immagine 2. Sistemi a illuminazione strutturata: tecniche di estrazione del picco Esistono diverse tecniche di illuminazione strutturata e conseguenti metodi di analisi: 1. Alcune sfruttano le informazioni contenute nello spazio delle frequenze, analizzandone la Trasformata di Fourier 2. Altre lavorano sul piano immagine e sull’ampiezza (intensità) del segnale, illuminando il campione attraverso una maschera e analizzando le conseguenti distribuzioni di intensità per ogni pixel del detector VCS video confocal super-resolution Il sistema X-Light V2 con VCS è stato sviluppato sulla base di un’idea di Pier Alberto Benedetti del CNR di Pisa: la scansione 2D di un campione tramite una illuminazione multi-spot permette di migliorare notevolemente la risoluzione 3D rispetto a sistemi widefield e confocali. Come funziona? L’acquisizione in luce strutturata prevede le seguenti fasi: 1. Illuminazione multipunto del campione (ossia narrow-field, non widefield) , ottenuta filtrando la luce di acquisizione con una maschera posta in un piano di fuoco coniugato a quello del campione 2. Scansione dell’intero campo di vista, spostando la maschera su direzioni ortogonali (u,v). É necessaria la velocità e la precisione di movimentatori piezo 3. Acquisizione di una immagine per ogni posizione della maschera, tramite CCD o sCMOS. In funzione del numero “n” di passi di scansione, le immagini acquisite saranno ππ β ππ = π΅π΅ 4. Grazie alla scansione, per ogni pixel della telecamera si ottiene una distribuzione di intensità πΌπΌ π’π’,π£π£ (π₯π₯, π¦π¦) 5. L’immagine in super risoluzione viene calcolata applicando algoritmi di detection ed estrazione del picco di intensità alle distribuzioni di intensità per ogni pixel sulle N immagini preliminari. Layout ottico del sistema a luce strutturata VCS Video Confocal System, Crest Optics (sessione pratica in Aula Nipkow) La maschera può avere pattern con diverse geometrie, a pin hole circolari, a fori quadrati o con linee parallele. La grandezza ottimale dei fori dipende dalla dimensione del pixel della telecamera e dalle caratteristiche di diffrazione dell’obiettivo (inutile andare sotto il limite di diffrazione). La distanza ottimale tra i fori è di circa 6 volte la grandezza dei fori stessi, per minimizzare il crosstalk e ottimizzare i tempi di scansione Esempio: se la CCD o sCMOS ha pixel da 6,5 μm… - fori quadrati con lato da 13 μm - distanza tra i fori (pitch) di circa 78 μm Quali algoritmi sono applicabili alle N immagini? Innumerevoli, lineari o non lineari, ognuno produrrà immagini con caratteristiche differenti. ALGORITMO LINEARE: π°π° ππ ∝ π΄π΄π΄π΄π΄π΄ ππ + π΄π΄π΄π΄π΄π΄ ππ − ππ π¨π¨π¨π¨π¨π¨(ππ) Distribuzione di intensità per ogni pixel Scansione campione con pattern Quali dati posso trarne e perché si ottiene la super risoluzione? La MEDIA: ∑ππ ππ=1 ππππππππ ππ π΄π΄π΄π΄π΄π΄ ππ = ππ L’iimmagine ottenuta con la MEDIA delle distribuzioni è fortemente correlata con il segnale widefield Il massimo: ππ ππππππ ππ = πππππ₯π₯ππ=1 [ππππππππ (ππ)] E’ composto principalmente dal valore del picco della distribuzione nell’acquisizione multipunto, ma include anche dati di background e di crosstalk tra pin holes. Il minimo: ππ Min ππ = ππππππππ=1 [ππππππππ (ππ)] Contiene soprattutto dati di background e contributi dei piani fuori fuoco (cross-talk tra pin holes) Quindi calcolando solamente ππππππ π₯π₯ − ππππππ π₯π₯ Verrebbero soltanto rimossi dalla distribuzione i contributi indesiderati di background e segnale fuori fuoco. Ricostruendo l’immagine pixel per pixel si ottengono immagini simili a quelle di un microscopio laser scanning Invece includendo nel calcolo anche la media delle distribuzioni… ππππππππππ ππ = ππππππ ππ + ππππππ ππ − 2π΄π΄π΄π΄π΄π΄(ππ) L’immagine ricostruita in questo modo ha caratteristiche SUPER CONFOCALI, soprattutto perché i componenti a fuoco del campione non vengono illuminati per la maggior parte delle posizioni del pattern di illuminazione π π π π π π ππππππππππππππππππππππππππ Dipende da campionamento, dai pixel della telecamera e dall’algoritmo utilizzato, può essere uguale e in molti casi migliore di quella di un confocale a pin hole π π π π π π ππππππππππππππππππππππππππ ≤ 0,4 π π π π π π πππΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ ππππππππππππππππππππππ λ ππππππππππ Il maggior vantaggio dell’illuminazione strutturata è un fortissimo miglioramento della risoluzione assiale. La risoluzione Z migliora almeno di un fattore 2 rispetto ai confocali a pin hole (quasi 3 rispetto a un sistema widefield): 1,4 λππ π π π π π π ππππππππππππππππππππππππ ~ ππ (ππππππππππ )2 Le intensità misurate sperimentalmente sul beads fluorescenti da 100nm forniscono i seguenti risultati di RISOLUZIONE LUNGO L’ASSE Z ACQUISIZIONE WIDEFIELD RICOSTRUZIONE 3D ACQUISIZIONE CONFOCALE SPINNING DISK RICOSTRUZIONE 3D ACQUISIZIONE CON VCS - LUCE STRUTTURATA RICOSTRUZIONE 3D ACQUISIZIONE CON VCS - LUCE STRUTTURATA (Spartaco Santi) Astrocita di una fettina di corteccia peririale (in verde), proBDNF (in rosso) e colocalizazione (in bianco). L’illuminazione strutturata permette di identificare le aree di colocalizzazione nelle zone degli endfeet astrocitari. 4. Deconvoluzione: applicazione matematica di una funzione inversa alla PSF sull’immagine già acquisita Ogni immagine acquisita deriva dalla convoluzione tra segnale reale del campione e PSF del sistema ottico, a cui va aggiunto il rumore totale del sistema (ambientale, poissoniano legato al segnale stesso, termico e di read out della telecamera) La deconvoluzione è l’applicazione di una funzione inversa alla PSF a una immagine già acquisita Es. Deconvoluzione iterativa on PSF fissa Senza entrare nel dettaglio, gli algoritmi di deconvoluzione possono portare a un forte miglioramento della risoluzione XY e assiale di uno stack di immagini già acquisite. Il fattore di miglioramento dipende dal campione e dal sistema di acquisizione. Vantaggi: - Utilissimo per dinamiche molto veloci (>1000fps), da acquisire necessariamente in widefield Applicabile con ottimi risultati alle immagini acquisite con un confocale spinning disk (il crosstalk tra pin hole viene eliminato) Rialloca i contributi dei piani fuori fuoco quindi da un punto di vista quantitativo mantiene tutto il segnale Svantaggi: - - Per la deconvoluzione 3D non è possibile vedere online il risultato I tempi di processing sono proporzionali alla quantità di informazioni presenti nello stack z e sono tipicamente molto lunghi (minuti) La risoluzione lungo Z è strettamente inferiore a quella di un sistema a luce strutturata 4. Il giusto giusto? Dipende dall’applicazione Confocalità Confocale Spinning Disk Risoluzione XY Velocità di acquisizione Velocità di analisi RISPETTO A SINGLE MOLECULE Luce Strutturata VCS RISPETTO A SINGLE MOLECULE Deconvoluzion e IN MIGLIORAMENTO CUDA PROCESSING RISPETTO A SINGLE MOLECULE Il sistema X-light V2 + VCS + deconvoluzione integra i tre approcci complementari, adattandosi come vedremo nella sessione pratica in Aula Nipkow a molteplici esigenze sperimentali (dinamiche veloci, bassi segnali, necessità di super risoluzione) Alessandro Rossi Bio-imaging specialist
