5. terapia genica e doping genetico
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DOPING: SOSTANZE E METODI La definizione di doping secondo la LEGGE 14 dicembre 2000, n°376 (art. 1) del Ministero della Salute è la seguente: Costituiscono doping: la somministrazione o l’assunzione di farmaci o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive e l’adozione o la sottoposizione a pratiche mediche non giustificate da condizioni patologiche ed idonee a modificare le condizioni psichiche o biologiche dell’organismo al fine di alterare le prestazioni agonistiche degli atleti” DOPING E’ l'uso (o abuso) di sostanze o medicinali con lo scopo di aumentare artificialmente il rendimento fisico e le prestazioni dell'atleta. Il doping è vietato dai regolamenti sportivi che: •Regolano l’utilizzo dei farmaci •Stabiliscono controlli anti-doping Il Comitato Internazionale Olimpico e le Federazioni Nazionali, nel 1998 formarono l’Agenzia Mondiale Anti-Doping: WORLD ANTI-DOPING AGENCY (WADA) WADA emette e aggiorna costantemente il Codice Mondiale Anti-Doping DOPING IL RENDIMENTO SPORTIVO PUÒ ESSERE IMPLEMENTATO CON SOSTANZE che aumentano il rendimento muscolare • Ormoni steroidei (androgeni, estrogeni, progestinici) • Eritropoietina • Ormone GH • IGF-1 che agiscono a livello del SNC • • • • Amfetamine Cocaina Efedrina Metilefedrina UNA DELLE MAGGIORI SFIDE PER I LABORATORI ANTI-DOPING È QUELLA DI : RICONOSCERE e RILEVARE l’abuso di sostanze illecite Sostanze Proibite sempre «in e out» competizione: S.1 Agenti anabolizzanti S.2 Ormoni e sostanze correlate S.3 Beta-2 agonisti S.4 Agenti con attività anti-estrogenica S.5 Diuretici ed agenti mascheranti Sostanze Proibite in competizione: S.6 Stimolanti S.7 Narcotici S.8 Derivati della cannabis S.9 Farmaci Corticosteroidi Sostanze proibite in particolari discipline sportive P1.Alcool, proibito nelle competizioni di automobilismo (>0.10 g/L), arco (>0.10 g/L), biliardo (>20 g/L), karate (>0.10 g/L), ecc. P2.Beta-bloccanti (es. atenololo, labetalolo, metoprololo, nadololo, sotalolo, timololo, ecc.) , proibito nelle competizioni di automobilismo, arco, bridge, ginnastica, nuoto sincronizzato, ecc. L’uso di qualsiasi sostanza dopante è accompagnato da effetti collaterali. Meccanismi d’azione e reazioni avverse delle principali sostanze dopanti SOSTANZE PROIBITE E REAZIONI AVVERSE Sostanze Proibite sempre «in e out» competizione: S.1 Agenti anabolizzanti S.2 Ormoni e sostanze correlate S.3 Beta-2 agonisti S.4 Agenti con attività antiestrogenica S.5 Diuretici ed agenti mascheranti Sostanze Proibite in competizione: S.6 Stimolanti S.7 Narcotici S.8 Derivati della cannabis S.9 Farmaci Corticosteroidi Steroidi anabolizzanti: S1. Anabolizzanti Testosterone, Nandrolone…. Acne Effetti •Aumento della massa muscolare Aumento sintesi dei globuli rossi Danni epatici •Diminuzione della massa grassa •Aumento della resistenza alla fatica •Diminuzione azione catabolica dei glucocorticoidi •Aumento della sintesi dei globuli rossi •Aumento della densità ossea Blocco crescita ossa lunghe Aumento Densità ossea Massa muscolare Massa grassa Danni funzione riproduttiva Aumento trigliceridi e colesterolo Lesioni tendinee Reazioni avverse Nel maschio (età prepuberale) • Blocco crescita ossa lunghe • Inibizione della spermogenesi Nel maschio (età adulta) • Oligospermia/azospermia • Atrofia testicolare • Ipertrofia prostatica • Alterazione della funzione epatica con possibilità di tumori • Aumento dei lipidi plasmatici Nella donna • Soppressione della funzione ovarica • Atrofia della ghiandola mammaria • Virilizzazione • Alterazione della funzione epatica con possibilità di tumori Gli steroidi anabolizzanti Jennifer Capriati Possono trasformare un atleta in meno di due anni Qualche volta sono così efficaci… ....da trasformare direttamente una donna in un uomo come Heidi Krieger Heidi Krieger Heidi Krieger oro Oggi Andreas Krieger nel lancio del peso agli Europei 1986 all’età di 21 anni S2. ORMONI E SOSTANZE CORRELATE 1. Agenti stimolanti l’eritropoiesi [es. eritropoietina EPO]; 2. Gonadotropina corionica (CG) e Ormone luteinizzante (LH) proibiti negli uomini; 3. Insuline; 4. Corticotropine; 5. Fattori di crescita: Ormone della crescita (GH), fattore di crescita insulino-simile (IGF-1), Fattori di crescita meccanici (MGF), fattori di crescita di derivazione piastrinica (PDGF), fattori di crescita del fibroblasto (FGF), fattore di crescita vascolare-endoteliale (VEGF) e fattore di crescita degli epatociti (HGF) ed altri fattori di crescita riguardanti muscoli, sintesi/degradazione delle proteine dei tendini o dei legamenti, vascolarizzazione, utilizzazione di energia, capacità rigenerativa o commutazione del tipo di fibra S2- Eritropoietina (EPO) Effetti Reazioni avverse • Poliglobulia • Stimola la produzione dei globuli rossi Stimolo produzione di globuli rossi • Aumenta la capacità di trasporto dell’ossigeno Poliglobulia trombosi Insufficienza cardiaca • Aumento della viscosità del sangue • Infarto del miocardio • Trombosi • Ictus • Embolia polmonare • Convulsioni S2. Ormone della crescita (GH) Aumento sintesi proteica EFFETTI REAZIONI AVVERSE Cardiopatia Ipertensione •Aumento della sintesi proteica •Acromegalia nell’adulto (gigantismo) Diabete •Aumento della crescita del tessuto muscolare Stimolo crescita ossea •Incremento della crescita staturale nel giovane (gigantismo) •Aumento della lipolisi •Aumento della glicemia Aumento degli organi interni •Ritenzione idrica ed edema (generalizzato e periferico) •Artropatie; sindrome del tunnel carpale Danni muscolari ed articolari •Cardiomiopatia •Ipertensione arteriosa Aumentata immissione in circolo delle sostanze energetiche •Iperglicemia •Diabete Aumento dimensioni estremità S2. Ormone della crescita (GH) Flo Jo” Griffith morì a 38 anni nel 1998 per aver assunto l’ormone della crescita al fine di migliorare la propria massa muscolare. In quel periodo non esisteva ancora la formulazione artificiale e il rischio che si correva con l’utilizzo di ormone estratto da cadavere era di contrarre la malattia di Creutzfeldt-Jacob, Encefalopatia Spongiforme Bovina, comunemente detta malattia della “mucca pazza”, un virus a lenta azione che si può manifestare anche dopo parecchio tempo. Questo fu un caso clamoroso, ma si contano ben 150 altri decessi fra coloro che hanno assunto l’ormone estratto da cadavere. (December 21, 1959 – September 21, 1998) S.3 BETA-2 AGONISTI Sono anabolizzanti non ormonali: antiasmatici o broncodilatatori S6. STIMOLANTI Gli stimolanti (es. cocaina, oppioidi, amfetamine,cannabinoidi) alterano le aree cerebrali che mediano le sensazioni di motivazione e di piacere: area “reward” cioè della gratificazione. S6. STIMOLANTI Effetto dell’ecstasy sulle capacità del ragno a tessere la tela Condizioni basali Dopo ecstasy S6. STIMOLANTI Emorragia cerebrale da cocaina S6. Stimolanti: Amfetamina, Efedrina, Cocaina… EFFETTI •Spiccata azione stimolante sul sistema nervoso centrale (aumento dell’attenzione della competitività, senso di benessere, euforia, riduzione del senso di fatica EFFETTI INDESIDERATI Riduzione fatica, euforia •Aumento della frequenza cardiaca •Aumento della glicemia e degli acidi grassi liberi •Riduzione del senso di fame (effetto anoressizzante) Ictus Sistema nervoso centrale Colpo di calore Aumento Frequenza cardiaca Eccitazione, Irrequietezza, Insonnia, aggressività Dipendenza Tossicomania Dispnea Stimolo metabolismo energetico Vomit o • Tremori, eccitazione, aggressività • Perdita del senso critico • Cefalea • Insonnia • Vomito, anoressia • Iperpiressia (colpo di calore) • Convulsioni • Forte stato depressivo, psicosi Sistema cardiocircolatorio • Vasocostrizione • Ipertensione • Tachicardia • Disturbi del ritmo • Infarto del miocardio S9. Glucocorticosteroidi farmaci anti-infiammatori e analgesici Proibiti per via orale, rettale, im. o ev. per le altre vie è richiesta certificazione medica EFFETTI Euforia Aumentata Resistenza a stimoli nocivi •Potente azione anti-infiammatoria •Effetto euforizzante •Aumentata capacità di resistere a stimoli nocivi Azione Alterazioni idroelettrolitiche Ipertensione Osteoporosi EFFETTI INDESIDERATI • Alterazione del bilancio elettrolitico • Ipertensione • Iperglicemia Ulcera gastroduodenale • Iperlipidemia • Iperuricemia Aumentata suscettibilità alle infezioni anti-infiammatoria Iperglicemia • Aumento della suscettibilità alle infezioni • Ulcera peptica • Osteoporosi • Insonnia • Cataratta Risultati (2012) dei laboratori accreditati dell'Agenzia mondiale antidoping (WADA) tramite antidoping Amministrazione e Management System (ADAMS). METODI DI DOPING Metodi vietati in e fuori competizione M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO Doping ematico Uso di prodotti che aumentano l’assorbimento, il trasporto o il rilascio dell’ossigeno Camera ipobarica M2. MANIPOLAZIONE FARMACOLOGICA, CHIMICA E FISICA uso di sostanze e metodi che possano alterare l’integrità e la conformità dei campioni raccolti nei controlli antidoping M3. DOPING GENETICO uso non terapeutico dei geni, elementi genetici e/o cellule, che hanno la capacità di migliorare la prestazione sportiva M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO Doping Ematico a. Emotrasfusione b. Uso di Emoglobine sintetiche c. Utilizzo della Camera ipobarica M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO Doping ematico a. Emotrasfusione • Due possibilità: – Doping ematico omologo (sangue proveniente da un’altra persona) • Sangue e sostituti plasmatici utilizzati in medicina • ”Donor Doping” (generalmente compagni di squadra) – Doping ematico autologo (autotrasfusione) • Estrazione di es. 900 ml sangue - 5 sett. prima della gara • Infusione del sangue centrifugato (cellule impaccate) 1 o 2 giorni prima della gara M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO a. Emotrasfusione Vantaggi e svantaggi del doping ematico omologo (sangue proveniente da un’altra persona) • Vantaggi – Nessuna diminuzione della performance • Svantaggi – Possibilità di essere individuati!!! (individuazione degli antigeni minori dei GR del donatore) – Contrarre malattie dal donatore – Reazioni da trasfusione M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO a. Emotrasfusione Vantaggi e svantaggi del doping ematico autologo (autoemotrasfusione) • Vantaggi – “Nessun metodo di detenzione” – Evitare patologie tipo AIDS ed epatiti – Evitare reazioni da sangue non compatibile • Svantaggi – Diminuita performance durante l’allenamento dopo l’estrazione del sangue M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO a. Emotrasfusione Doping ematico: Autoemotrasfusione In Italia, questa tecnica nasce a Ferrara nella prima metà degli anni 80 (1984: F. Moser record dell’ora) con l’autoemotrasfusione M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO a. Emotrasfusione Doping Ematico Autoemotrasfusione (per sport di resistenza) Un mese prima della gara vengono estratti 700-900 ml di sangue, che vengono poi conservati e rimessi in circolo uno o due giorni prima dell'impegno agonistico. In seguito alla trasfusione si verifica un repentino miglioramento della capacità aerobica e della prestazione nelle prove di resistenza (ciclismo, maratona, nuoto di durata, trhiatlon, sci nordico ecc.). L'autoemotrasfusione non determina significativi benefici agli atleti impegnati in discipline anaerobiche (sollevamento pesi, gare di salto e di sprint, lancio del peso, ecc). M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO b. Uso di Emoglobine sintetiche Doping ematico Eritropoietina ricombinante (r-HUEPO) Nel 1987 è stata introdotta l’EPO ricombinante (r-HuEPO) con struttura ed azione sovrapponibili a quella endogena. La somministrazione di r-HuEPO consente di aumentare la massa eritrocitaria e i livelli di emoglobina per 3-4 settimane, con aumento del VO2max (il massimo volume di ossigeno consumato per minuto) pari al 10%. La somministrazione di r-HuEPO consente quindi di migliorare la capacità aerobica dell’atleta. Gli effetti sono additivi a quelli dell’allenamento, che consente di aumentare il VO2max fino ad un massimo del 20%. M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO b. Uso di Emoglobine sintetiche Doping ematico Darbepoietin α Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP) Eritropoietina sintetica analoga all’eritropoietina ricombinante umana EPO iperglicosilata: cinque catene carboidratiche elevato contenuto in acido sialico elevato peso molecolare. clearance plasmatica rallentata Laboriosa metabolizzazione Lunga emivita plasmatica darbepoietin α = 25 ore rHuEpo = 8,5 ore (MacDougall et al, 2001) La NESP può produrre in breve tempo un aumento dell'ematocrito dai valori normali di 42%-44% fino a valori del 60% mantenendoli elevati a lungo. M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO Effetti S2- Eritropoietina (EPO) Reazioni avverse • Poliglobulia • Stimola la produzione dei globuli rossi Stimolo produzione di globuli rossi • Aumenta la capacità di trasporto dell’ossigeno Poliglobulia trombosi Insufficienza cardiaca • Aumento della viscosità del sangue • Infarto del miocardio • Trombosi • Ictus • Embolia polmonare • Convulsioni M1. AUMENTO DI TRASPORTO DI OSSIGENO c. Camera ipobarica Doping Ematico La camera ipobarica riduce la percentuale di ossigeno presente nell'aria. L'organismo quindi viene stimolato a produrre globuli rossi, aumentando la massa plasmatica. Dunque aumenta la resistenza, crea l'effetto altitudine, migliora anche la capacità di recupero. M2. MANIPOLAZIONE FARMACOLOGICA, CHIMICA E FISICA Uso di sostanze e metodi che possano alterare l’integrità e la conformità dei campioni raccolti nei controlli antidoping Le manipolazioni vanno dallo scambio dei campioni d´urina alla diluizione con altri liquidi, fino all´inserimento in vescica, tramite catetere, dell´urina altrui. Possono inoltre essere usati i diuretici chiamati mascheranti, perché in grado di eliminare più velocemente, favorendo la diuresi, le sostanze proibite rintracciabili ai test antidoping. Inoltre, la prima cosa che si esamina nei campioni di urina è il pH, in quanto è possibile facilitare l´eliminazione di farmaci vietati alcalinizzando o acidificando l´urina; la seconda è la densità: un´urina con basso peso specifico, può indicare una manipolazione finalizzata ad abbassare la concentrazione di un farmaco al di sotto della soglia di rilevazione. M3. DOPING GENETICO Il WADA ha inserito nella lista dei metodi proibiti il DOPING GENETICO E’ definito come “ l’uso non terapeutico di cellule, geni, elementi genici o la modulazione dell’espressione genica che possano aumentare la performance sportiva”. Il DOPING GENETICO usa le stesse tecniche della TERAPIA GENICA allo scopo di migliorare la prestazione sportiva. Modelli di terapia genica Definizione e background Sistemi di rilascio Strategie di terapia genica Esempi di trials clinici Prospettive future Terapia Genica: perché ? Molte patologie, dovute a proteine malfunzionanti, non sono trattabili con terapie tradizionali Negli anni ‘70 nasce l’idea della Terapia Genica (rilascio intracellulare di materiale genetico per generare un effetto terapeutico, con diverse strategie di intervento a seconda dello scopo prefissato) DNA Farmaco RNA DNA e mutazioni A C G T GCA GCA Ala Ala AAA AGA Lys Arg GAT GAT Asp Asp GENOMA UMANO 3 miliardi di basi (A,C,G,T) circa 30.000 geni circa 250.000 proteine AAT AAT Asn Asn Sequenza Sequenza mutata normale MUTAZIONI TGT TGT Cys Cys … … Proteina anomala normale Proteina ereditarie (patologie genetiche) acquisite (tumori) dovute a virus (malattie infettive) Patologie bersaglio Monogeniche Immunodeficienze - Distrofia muscolare - Fibrosi cistica - Emofilie Retinopatie - Emoglobinopatie - Ipercolesterolemia fam Xeroderma pigmentosum Multifattoriali Malattie cardiovascolari e neurodegenerative - Diabete Artrite reumatoide Tumorali Leucemie - Carcinomi Infettive AIDS - Epatite B e C Acquisite Traumi (fratture ossee, ferite, ustioni) - Ischemie Terapia genica: quale tipo? SOMATICA manipolazione dell’espressione genica in cellule differenziate dell’individuo adulto l’alterazione genica riguarda esclusivamente il paziente su cui è stata realizzata GERMINALE manipolazione dell’espressione genica in cellule riproduttive eventuali modificazioni geniche verrebbero trasmesse alla progenie non autorizzata !!!! Terapia genica: Rogers et al. papilloma virus 3 pazienti affetti da arginemia: nessun risultato 1970 1980 1990-92 Cline et al 2 pazienti con β-tal Maj: presenza per 3-9 mesi del transgene nel m.o. un po’ di storia Blase e Bordignon pazienti affetti da ADA-SCID: risultati parziali in termini di cura definitiva Cavazzana-Calvo et al 2 pazienti affetti da X-SCID: correzione completa difetto immunitario 1999 2000 Morte del paziente (Jesse G.) dopo trial clinico con AdV per deficit OTC 2002-3 Aiuti et al 2 pazienti con ADA-SCID: reversione completa fenotipo clinico fino a 1 anno Casi di leucemia cellule T dopo 3 anni da trial clinico con RV per XSCID (2/15) Terapia genica: come? ex vivo in situ Le cellule bersaglio (es. SC) sono prelevate dal paziente, modificate geneticamente in laboratorio e reintrodotte nello stesso individuo il transgene viene rilasciato localmente nel sito di azione mediante iniezione i.m. o intratumorale o per inalazione ecc… il transgene viene somministrato per via sistemica e.v. nel corpo del paziente tumori localizzati; patol. dell’apparato respiratorio (es. FC); tessuto cutaneo ecc… cellule e tessuti poco accessibili scarsa efficienza di trasduzione, barriere no problemi immunologici efficienza delle metodiche di trasduzione in vitro solo alcune malattie (immunologiche, ematologiche, metaboliche) in vivo TERAPIA GENICA: come ? IN VIVO Rilascio gene modificato EX-VIVO Rilascio cellule modificate Trasferimento Genico in vivo Aerosol Iniezione diretta (miocardio) Perfusione organo Uso di cateteri (tumori solidi) Gene gun/elettroporazione (miofibrille, epidermide) Via sistemica TERAPIA GENICA: come ? DNA nudo elettroporazione pistola genica microiniezione liposomi non-virali Vettore per rilasciare e proteggere il gene terapeutico virali adenovirus adenoassociati retrovirus lentivirus herpesvirus VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali: Vettori non virali: • Adenovirus •Plasmidi nudi • Retrovirus •Liposomi e polimeri • Virus adeno-associati •Elettroporazione in vivo • Lentivirus (derivati da HIV) • Herpesvirus Vettori virali Adenovirus Retrovirus* Lentivirus* Herpes-simplex virus Vantaggi altamente efficienti nel trasferimento genico espressione a lungo-termine* Svantaggi reazione immunitaria tossicità integrazione random/mutagenesi inserzionale* AAV* Vettori virali Retrovirus • Genoma di RNA singolo filamento. • Possono infettare solo cellule proliferanti • Integrazione casuale nel genoma. • Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Poco immunogeni. • L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono i vettori più utilizzati per la terapia genica. Vettori virali Adenovirus • Genoma di DNA doppio filamento. • infettano le vie respiratorie, • Possono infettare cellule proliferanti e postmitotiche. • Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. • Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Forti reazioni immunologiche. Vettori virali Herpes Simplex Virus (HSV) Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni). Spiccato neurotropismo (infettano preferenzialmente le cellule nervose). Nelle cellule infettate spesso rimane in uno stato latente in forma episomica. Possibile inserire geni molto grandi. Forti reazioni immunologiche. Presenza di anticorpi contro il virus in un’elevata percentuale di casi. Vettori virali Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) Scarsissime reazioni immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione. Ottime prospettive per la terapia genica in vivo. Vettori non virali: PLASMIDI La conoscenza degli enzimi di restrizione in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, hanno portato i biologi molecolari ad utilizzare i plasmidi per introdurre del DNA estraneo, al fine di produrre proteine oppure per amplificare tratti di DNA. Inserendo un gene in un plasmide, ed immettendo il plasmide in un batterio, posso AMPLIFICARE E PRODURRE quantità enormi del DNA RICOMBINANTE. Qui vediamo uno schema dei processi di clonaggio di un plasmide in una cellula batterica. Vettori non virali DNA nudo – Elettroporazione - Microiniezione Iniezione diretta Vantaggi assenza di immunogenicità alta efficienza ex-vivo rilascio di grossi geni utile per le vaccinazioni a DNA Svantaggi inefficiente nel trasferimento genico instabilità nella maggior parte dei tessuti espressione transitoria in vivo solo per tessuti superficiali (cute), muscolo, cuore, fegato Elettroporazione Microiniezione Vettori non virali Liposomi: minuscole sfere cave costituite da una membrana lipidica - DNA Vantaggi non contengono geni virali limitata immunogenicità anche costrutti molto grandi - - ++++ liposomes Svantaggi poco efficienti nel rilascio genico in vivo espressione transitoria difficoltà a rilasciare il DNA nel nucleo - Cosa succede al DNA quando è entrato nella cellula ospite? 1. Vettori virali 2. Vettori non virali Integrazione casuale O sito-secifica integrazione del transgene nel genoma ospite espressione stabile il transgene non si integra nel genoma espressione temporanea Vettore ideale di facile produzione e in elevate quantità esprimibile per un lungo periodo e regolabile sicuro, cioé inerte dal punto di vista immunologico selettivo per determinati tipi cellulari capace di trasportare geni piccoli e grandi capace di integrarsi in siti specifici del genoma capace di infettare sia cellule in divisione che quiescenti Strategie di terapia genica Compensazione genica introduzione di copie funzionali del gene difettivo o assente Riparo genico correzione del gene difettivo Inattivazione introduzione di RNA antisenso per inibire l’espressione genica Suicida introduzione di “geni suicidi” che producono tossine o pro-farmaci Anti-angiogenica interruzione del nutrimento ai tumori Anticorpale introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari Anti-infiammatoria prevenzione del riconoscimento dei tessuti da parte dell’organismo Vaccinazione introduzione di geni che inattivano agenti infettivi Terapie cellulari trapianto di cellule geneticam modif Strategie e patologie trapianti cellulari patologie multifattoriali tp. riparativa patologie acquisite (neurodegen, diabete ecc) (traumi, ischemie ecc) tp. compensativa patologie ereditarie tp. ablativa – suicida – di inattivazione – anticorpale – anti-angiogenetica immunoterapia tp. anti-infiammatoria (mendeliane) patologie tumorali patologie infettive (++AIDS, epatite) patologie autoimmuni Strategie a confronto Compensativa (x patologie AR. Trials clinici:FC, emofilia, SCID) gene X gene mutato espressione della proteina normale no proteina Riparo (anche x patologie AD da gain-of-function) wt m gene X X X wt m m wt m wt wt wt gene mutato no proteina gene corretto espressione della proteina normale Riparo genico Vantaggi Mantiene il gene integro Mantiene la relazione tra sequenze regolatrici e codificanti Assicura un livello di espressione accurato Dovrebbe essere a lungo-termine Svantaggi Efficienza può essere bassa Rischio di mutagenesi inserzionale Degradazione del DNA terapeutico Strategie a confronto VETTORE VIRALE CELLULA BERSAGLIO RISULTATO ATTESO TERAPIA GENICA COMPENSATIVA per patologie ereditarie cellula epitelio respiratorio VETTORE VIRALE CELLULA BERSAGLIO TERAPIA GENICA ABLATIVA RISULTATO ATTESO timidin-kinasi ganciclovir (SILENZIAMENTO GENICO) per patologie tumorali cellula tumorale ganciclovir-fosfato Terapia genica in Cellule Staminali Cellula staminale CSE Introduzione del gene terapeutico Gene terapeutico verrà espresso in tutte le cellule del sangue Perché usare le cellule staminali ematopoietiche? Cellule che si autorinnovano: nessuna necessità di ripetute somministrazioni Poco numerose e facilmente rimovibili Facilmente identificabili, manipolabili e reintroducibili Il gene terepautico risiederà in tutte le cellule derivate CSE possono migrare in numerosi distretti corporei (midollo osseo, fegato, milza, linfonodi) e funzionare come vettori di trasferimento genico Terapia cellulare e genica Trapianti cellulari Trapianto cellule staminali geneticamente modificate ex-vivo Plasticità cellule staminali SUCCESSI ADA-SCID, Aiuti, 2002 X-SCID, Hacein-Bey-Abina, 2002 Epidermolisi bullosa, De Luca, 1998 Ferite epidermide, Quesenberry, 2002 POTENZIALITA’ Malattie metaboliche Malattie ematologiche M. Parkinson M. di Alzheimer Infarto Diabete Artrite reumatoide Terapia genica: risultati Buoni risultati in modelli animali Pochi esempi di risultati a lungo termine nell’uomo (X-SCID, ADA-SCID, Emofilia A) Procedure di rilascio genico relativam sicure (sviluppo risposta infiammatoria sistemica, sviluppo di leucemia) Alcune patologie più facilmente trattabili (espressione non regolata, tessuti accessibili: m.metab, emofilia) Alcune aree più promettenti (vaccini a DNA, angiogenesi per m. cardiovascolari, trapianti cell) Terapia genica: limiti e prospettive Limiti attuali bassa efficienza di rilascio genico bassa specificità di bersaglio Prospettive future sviluppo di nuovi vettori sviluppo di strategie cellulo-specifiche espressione transiente e nonfisiologica approcci di gene-targeting reazione immunitaria contro i vettori sviluppo di vettori nonimmunogenici Terapia genica: passaggi-chiave comprensione dei meccanismi patofisiologici della malattia individuazione dell’appropriato bersaglio cellulare individuazione del metodo di trasferimento ottimale creazione di un modello animale della patologia per studi pre-clinici in vivo Sicurezza e Terapia Genica Morte di un giovane paziente in seguito a trial clinico per OTC Integrazione retrovirale in vicinanza di un oncogene e sviluppo di leucemia in trial clinico per X-SCID (2/15 pazienti) Necessità di procedimenti sicuri e criteri selettivi nella scelta dei pazienti Terapia genica: quale futuro? Terapia in utero Enhancement Trapianto di midollo o cellule staminali in utero (X-SCID; SCID T-B+) Terapia genica ? Performance atletica ? Altezza ? Aspetto fisico ? Doping Genetico e sport cellula cromosomi geni DNA proteine Le proteine agiscono da sole o in complessi per esplicare molte funzioni cellulari i geni contengono le istruzioni per la produzione delle proteine Doping Genetico e Sport I tre possibili livelli del doping genetico nello sport Prima della competizione (indurre effetti anabolizzanti) Durante la competizione (per il miglioramento della performance) Manipolazione genetica Dopo la competizione (per il riparo di traumi) Quali approcci di ingegneria genetica si possono ipotizzare come doping genetico nello sport? ex vivo, tessuto emopoietico: modificare l’emopoiesi (recettore EPO, trasporto O2...) in vivo locale (es. muscolo): fattori di crescita, modificatori fibre muscolari cardio-modulatori, ecc. in vivo locale (es. articolazioni): sostanze antidolorifiche, inibitori dell’infiammazione, fattori di riparo, ecc. in vivo sistemico: anabolizzanti, fattori ormonali, killer del dolore, controllo vascolare, ecc. Doping Genetico e Sport IL TESSUTO MUSCOLARE COME TARGET DI TERAPIA GENICA È OTTIMALE IN QUANTO: •È molto abbondante nell’organismo • Ottimamente vascolarizzato • Facilmente accessibile Studi di laboratorio su animali, hanno dato risultati positivi utilizzando metodi in vivo ed ex vivo. GENI CANDIDATI nel DOPING GENETICO per migliorare le prestazioni sportive GENI CORRELATI ALLA RESISTENZA ALLO SFORZO (ENDURANCE) GENI CORRELATI ALL'AUMENTO DELLA MASSA MUSCOLARE - Eritropoietina (EPO) - Fattori per il controllo della crescita muscolare: MGF e IGF-1; - recettore PPARD che attiva la proliferazione dei perossisomi - Fattori per il controllo della massa muscolare: GH; - Geni correlati all’angiogenesi: VEGF, TGF, HGF - Fattori ipertrofici: miostatina che è considerato un regolatore negativo della crescita muscolare: l'assenza di miostatina stimola l'ipertrofia e l'iperplasia muscolare. COME PUO’ ESSERE UTILIZZATO IL “GENE DOPING” Introducendo 1. ERITROPOIETINA (EPO) 1. Svensson E et al. Human Gene Therapy (1997): utilizzarono vettori adenovirali per il trasferimento del gene per l’EPO in topi e scimmie Effetto: aumento dell’ematocrito dal 49 a 81% nel topo e dal 40 al 70% nelle scimmie dopo iniezione intramuscolo. Durata: l’effetto perdurava più di un anno nel topo e circa 12 settimane nella scimmia. 2. Zhou S et al. Gene Therapy 1998: ottennero gli stessi risultati ripetendo esperimenti simili in altri primati. COME PUO’ ESSERE UTILIZZATO IL “GENE DOPING” Introducendo 1. ERITROPOIETINA (EPO) PROBLEMI: • Livelli eccessivi di ematocrito possono causare trombosi • In famiglie in cui sono presenti mutazioni del gene EPO sono frequenti casi di morte precoce per infarto o episodi acuti cerebrali. • Iniezioni ripetute possono avere effetto ridotto per lo sviluppo di risposta immunitaria verso il vettore virale. • Rischio di mutagenesi inserzionale: cancro GENI CORRELATI ALLA RESISTENZA (ENDURANCE) 2. PPARD (peroxisome proliferator-activated receptor delta) L’ espressione di PPARD promuove il passaggio delle fibre muscolari da tipo IIb a contrazione rapida a quelle di tipo IIa e di tipo I lente che è quello che accade fisiologicamente in seguito ad esercizio fisico costante. E’ stato prodotto un composto sintetico (GW501516) in grado di legarsi al recettore del PPARD e di attivarlo e potrebbe quindi rappresentare un possibile agente dopante nell’uomo. GENI CORRELATI ALLA RESISTENZA (ENDURANCE) 3. GENI CORRELATI ALL’ANGIOGENESI • fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) • fattore di crescita tissutale (TGF) • fattore di crescita degli epatociti (HGF) L’ espressione di questi geni infatti è correlata all’aumento della formazione di nuovi vasi sanguigni e quindi ad un maggiore apporto di ossigeno ai tessuti con conseguente aumento della capacità di resistenza allo sforzo fisico. Terapia genetica su umani con VEGF (vascular endothelial growth factor) Vasi sanguigni di un paziente che ha ricevuto l’inoculazione di un “vettore” in cui è stato inserito il gene VEGF PRIMA DOPO Baumgartner et al. Circulation (1998) 97:1114-1123 GENI CORRELATI ALL'AUMENTO DELLA MASSA MUSCOLARE e ALLA RIGENERAZIONE CRESCITA E RIGENERAZIONE DEL TESSUTO MUSCOLARE AUMENTANDO L’ ESPRESSIONE DI GENI CHE HANNO UN’ AZIONE STIMOLANTE COME: IGF1 e GH INIBENDO GENI CHE DI SOLITO AGISCONO COME REPRESSORI DEI PROCESSI DI CRESCITA COME: MIOSTATINA GENI CORRELATI ALL'AUMENTO DELLA MASSA MUSCOLARE e ALLA RIGENERAZIONE 1. IGF-1 MUSCOLARE (mIGF-1) Il gene IGF-1 ha il compito di riparare il muscolo, quando, durante l’esercizio, subisce microtraumi. La fibra si ripara e cresce, ritrovandosi con più miofibrille rispetto a prima della lesione. Il segnale di stop alla crescita viene dato da un'altra proteina, la miostatina. L’inserimento di un extra-gene IGF–1, permetterebbe di aggirare il meccanismo di equilibrio, inducendo l’ipertrofia del muscolo e la crescita incontrollata delle fibre. GENI CORRELATI ALL'AUMENTO DELLA MASSA MUSCOLARE e ALLA RIGENERAZIONE 2. ORMONE DELLA CRESCITA (GH) L'attività sportiva rappresenta un forte stimolo per la secrezione di GH La secrezione di GH nel corso di attività fisica è influenzata in modo particolare da: • Intensità dello sforzo • Allenamento del soggetto • Temperatura ambiente SINTESI PROTEICA TESSUTO ADIPOSO EFETTI CONTROINSULARI Collabora con gli ormoni tiroidei, con gli ormoni sessuali steroidei e con l'IGF-1 al processo di sviluppo e accrescimento dell'apparato scheletrico Il GH favorisce la mobilizzazione dei grassi, stimola la lipolisi. La somministrazione cronica di GH ha effetti iperglicemizzanti con ridotta utilizzazione di glucosio, ridotta glicogenosintesi ed insulino resistenza Garantisce il trofismo muscolare ed osseo nell'adulto Aumenta l'ossidazione degli acidi grassi, favorendo il dimagrimento e la sintesi di corpi chetonici nei tessuti GENI CORRELATI ALL'AUMENTO DELLA MASSA MUSCOLARE e ALLA RIGENERAZIONE 3. Inattivazione Miostatina Gene della miostatina La miostatina è una proteina regolatrice della crescita muscolare. Appartiene alla superfamiglia dei TGF-beta (trasforming growth factor-beta) E’ responsabile del differenziamento dei muscoli scheletrici Ha una funzione inibitoria della proliferazione delle cellule satelliti alle fibre muscolari. Mutazioni genetiche del gene miostatina provocano abnormi crescite dei muscoli: es. ceppo bovino Belgium blue bull Approcci al doping genetico 1. modificare per mutagenesi il gene miostatina 2. somministrare un inibitore della miostatina: follistatina. Topi Schwarzenegger Rimozione del Gene Miostatina in topi: Arto anteriore di un topo normale Arto anteriore di un topo privo del gene della miostatina Topo normale Topo know-out: rimosso il gene miostatina Lee et al. Curr. Opin. Gen. Dev. (1999) 9:604-607 Esperimenti su topi Topi privati del gene della miostatina (topi knock out) sviluppano una muscolatura ipertrofica: GENI CORRELATI ALLA CRESCITA E ALLA RIGENERAZIONE MUSCOLARE Gene MIOSTATINA nell’uomo: Nel 2004, studiando un bambino tedesco di 5 anni che presentava uno sviluppo abnorme della forza e della massa muscolare venne identificata per la prima volta nell'uomo la presenza di una mutazione nel gene che codifica per la miostatina. Schuelke M, Wagner KR, Stolz LE et al. Myostatine mutation associate with gross muscle hypertrophy in a child. New England Journal Medicine 350:2682-88 (2004). RISCHI POTENZIALI DEL GENE DOPING -Reazioni immunitarie anche letali -Problemi correlati alla preparazione dei vettori in laboratori non controllati (contaminazioni o produzione di vettori virali virulenti) -Problemi correlati all’eccessivo sviluppo delle masse muscolari con effetti dannosi su tendini e ossa -Problemi legati alla integrazione del vettore nel genoma dell’individuo: possibile mutagenesi o danneggiamento di geni endogeni. -Sviluppo di neoplasie sia per mutagenesi inserzionale sia per overespressione di sostanze (come GH) che sono potenti mitogeni e anti-apoptotici Si può scoprire il doping genetico? • La proteina prodotta è uguale alla proteina endogena • Il DNA artificiale è presente solamente in sede locale quando si pratica un’iniezione col DNA puro o con cellule modificate geneticamente • Si dovrebbe conoscere la sequenza del DNA artificiale per poterla rilevare EPO ricombinante EPO endogena da urine e siero EPO nel siero dopo trasferimento genico Rischi ipotizzabili con il doping genetico A breve-medio termine Autoimmunità Sindrome similinfluenzale Shock tossico A lungo termine Fibrosi Tumori Effetti avversi tipici dei fattori stimolati Impossibilità di terapia genica futura (immunità) Legati alle modalità di trattamento Malpratica (vettore o via somministrazione inadeguati) Materiale contaminato (patogeni o allergeni) Mancanza di follow-up Anti-Doping Administration & Management System (ADAMS) Cosa è ADAMS ? é uno strumento che assiste nell’implementazione di controlli anti-doping. E’ in pratica un calendario messo su rete a cui accedono atleti e controllori. Gli atleti forniscono la propria reperibilità, i laboratori riportano i dati e le autorità coordinano le azioni ADAMS PER SPORT DI SQUADRA • ADAMS contiene un modulo per squadre compilato da un responsabile di squadra. Questi inserisce le info dei suoi giocatori relative alla reperibilità • ADAMS quindi informa il singolo atleta delle info fornite dal responsabile e chiede conferma • Gli atleti sono responsabili della propria reperibilità e non vi è possibilità di palleggiamento di responsabilità con il responsabile di squadra. Funzioni principali di ADAMS Reperibilità degli atleti Essendo via web, l’atleta può aggiornare da dove vuole; se non ha accesso alla rete, può inviare sms Strumento cruciale per i controlli a sorpresa Clearing House – Contiene tutte le informazioni dell’atleta e consente a tutte le organizzazioni di avere semplice e rapido accesso alle informazioni. Rappresenta garanzia di trasparenza. É la “banca dati” in cui i dati dell’atleta sono conservati, in particolare: Risultati di laboratorio Autorizzazioni TUE (Therapeutic Use Exemption) Violazioni delle norme anti-doping Doping Control Platform Strumento fondamentale per pianificare, coordinare, ordinare controlli e serve per la loro gestione. Consente, per esempio, di evitare duplicazioni non necessarie dei controlli.
