INTRODUZIONE - Davide Di Domenico

Tesi di Laurea Davide Di Domenico:
Studio del profilo d’espressione del gene VM32E in mutanti “femmina sterile” di Drosophila melanogaster
INTRODUZIONE
La facilità di allevamento, il breve ciclo riproduttivo e I’alto potenziale proliferativo della Drosophila melanogaster
hanno proposto questo brachicero come un potente modello sperimentale per gli studi genetici fin dal 1910,
quando T.H .Morgan ottenne la dimostrazione sperimentale della teoria cromosomica dell’ ereditarietà.
Più recentemente lo studio dei mutanti morfogenetici di Drosophila melanogaster ha permesso di chiarire i
meccanismi genetici che governano lo sviluppo embrionale, il quale viene diviso in una fase di oogenesi, per la
determinazione ed il differenziamento della cellula uovo, ed in una fase di embriogenesi, per lo sviluppo dello
zigote. Gli stadi larvali e quello pupale daranno infine origine all’insetto adulto. Quando si focalizza l’attenzione
alle prime fasi dello sviluppo embrionale i geni che appaiono coinvolti sono quelli della madre. Infatti la direzione
dello sviluppo è rappresentata dalle proprietà della cellula uovo, la quale oltre a costituire una struttura ideale
per svolgere le funzioni riproduttive, conferisce all’embrione tutto il nutrimento necessario ed esercita un ruolo
determinante per la corretta attivazione genetica dello zigote. Un gruppo di geni ad effetto materno codifica per
funzioni, necessarie solo dopo la fecondazione, che vengono localizzate in forma inattiva all’interno dell’oocita
durante I’oogenesi: le mutazioni di tali geni non alterano la morfologia dell’uovo, ma esclusivamente lo sviluppo
dello zigote. La funzione di un secondo gruppo di geni materni è invece necessaria fin dalle fasi di oogenesi e la
sua assenza comporta alterazioni nella morfologia dell’uovo. L’oogenesi rappresenta perciò un modello di grande
valore per lo studio dei processi differenziativi. Allo sviluppo di un uovo maturo, contribuiscono sia cellule di
origine somatica che cellule germinali, dalle quali l’embrione ricaverà il corredo genetico materno. Queste
componenti di diversa origine sono tra loro in stretta cooperazione e la loro attività genetica è regolata dal punto
di vista spazio-temporale.
LA MEMBRANA VITELLINA
La membrana vitellina è una struttura rigida che consente di mantenere la forma dell’uovo anche dopo la
rimozione dei rivestimenti più esterni, permettendo all’embrione di svilupparsi correttamente. Inoltre si suppone
che essa possa svolgere un ruolo importante nel posizionamento di segnali molecolari necessari per la
determinazione delle strutture terminali e della polarità dorso-ventrale durante le prime fasi dello sviluppo
embrionale. Tutte le proteine della membrana vitellina conosciute sono sintetizzate nelle cellule follicolari: esse
iniziano ad essere secrete nello spazio extracellulare durante lo stadio 9, sotto forma di piccole vescicole. Durante
lo stadio 10A i corpi vitellini si fondono tra loro, completando la formazione della membrana vitellina agli inizi
dello stadio 11. I geni che codificano per 4 proteine della membrana vitellina sono stati clonati: VM32E, VM34C,
VM26A(1) e VM26A(2). Come tutte le proteine della membrana vitellina, anche queste sono notevolmente ricche
in prolina ed alanina; inoltre presentano un dominio idrofobico molto conservato lungo 30 aminoacidi. Studi
riguardanti I’organizzazione del genoma, hanno rivelato ulteriori caratteristiche comuni a tali geni come la
mancanza di introni, la sintesi di un piccolo messaggero con lunghezza variabile tra 430 ed 800 pb e la
localizzazione nel braccio sinistro del cromosoma 2.
L’unico gene tra quelli che codificano per proteine della membrana vitellina di cui si conosce il fenotipo
mutante è VM26A(2) i cui alleli, quando in omozigosi, causano sterilità femminile associata ad alterazioni
morfologiche dell’oocita: le uova decorionate collassano evidenziando I’esistenza di un difetto nella struttura
della membrana vitellina. Mediante trasformazione della linea germinale, è stata introdotta una copia del gene
VM26A(2) nel mutante, ottenendo il completo recupero del fenotipo selvatico. Questi autori hanno dimostrato
che i costrutti contenenti il gene VM26A(2), “ingegnerizzato” in modo tale da preservare una regione composta
da solo 147 coppie di basi a monte del sito d’inizio per la trascrizione, sono in grado di ripristinare la fertilità
nell’allele fs(2)QJ42. Tale risultato evidenzia che gli elementi cis-regolatori dell’espressione selvatica di tale gene
sono contenuti in una corta regione posta all’estremità 5’ del gene.
Gli studi condotti sul gene VM32E hanno evidenziato I’esistenza di un meccanismo per la regolazione
spazio-temporale del tutto peculiare rispetto agli altri geni noti codificanti per proteine della membrana vitellina:
I’espressione iniziale è stata evidenziata, durante lo stadio 10A, in un gruppo ridotto di cellule follicolari colonnari
della regione ventrale; successivamente, durante lo stadio 10B, essa si estende dorsalmente interessando una
vasta zona che circonda I’oocita. Contrariamente agli altri geni, il trascritto del gene VM32E non compare mai
nelle cellule follicolari anteriori e posteriori l’oocita. La regolazione del gene VM32E è stata analizzata rilevando in
situ I’attività β-galattosidasica nelle camere ovariche ottenute dai trasformanti per un elemento P il cui reporter
lacZ era stato preventivamente posto sotto il controllo trascrizionale di frammenti della regione 5’ terminale del
gene in questione. L analisi ha rivelato che la regione -348/-39 è sufficiente per conferire al gene reporter lo
stesso profilo d’espressione spazio-temporale caratteristico per il gene endogeno. Questa sequenza contiene una
struttura modulare formata da diverse sub regioni, ciascuna in grado di svolgere una specifica funzione
nell’ambito dell’espressione spaziale e temporale del gene all’interno delle cellule follicolari.
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PREMESSA AL LAVORO SPERIMENTALE
Il gene VM32E è stato clonato, nel 1989, in seguito alla ricerca condotta per lo studio dell’informazione genetica
contenuta nel DNA delle bande 32 D-E dei cromosomi politenici (Gigliotti e coll., 1989 ). Questa regione è
localizzata sul braccio sinistro del cromosoma 2 ed era già nota per la presenza dei geni hold up (hup), wavoid-like
(wdl), daughterless-abo-like (dal) ed abnormal oocite (abo). La caratterizzazione del gene VM32E ha rivelato che
esso codifica per una proteina di 116 aminoacidi, particolarmente ricca in prolina (12%) ed alanina (18,8%),
avente un peso molecolare di 13Kd. I primi 17 aminoacidi sembrano costituire una sequenza di segnalazione per
la secrezione, mentre un dominio idrofobico di 30 aminoacidi mostra evidenti omologie con le altre proteine
appartenenti a questo gruppo. Ulteriori caratteristiche comuni sono la mancanza di introni nel DNA e la
localizzazione nel braccio sinistro del secondo cromosoma.
Il profilo d’espressione del gene VM32E è stato inizialmente studiato mediante esperimenti di
Northern blot con I’RNA estratto da maschi e femmine a diversi stadi dello sviluppo: usando come sonda il cDNA
specifico per il gene in questione, è stato dimostrato che esso viene espresso durante lo stadio 10 dell’oogenesi.
Successivamente, per localizzare I’espressione a livello cellulare, sono stati eseguiti esperimenti di ibridazione in
situ su camere ovariche selvatiche, usando come sonda I’estremità 3’ terminale del cDNA di VM32E, in modo tale
da escludere la regione di omologia che accomuna i vari geni coinvolti nel processo di formazione della
membrana vitellina. L’espressione iniziale è stata evidenziata, durante lo stadio 10A, in un gruppo ridotto di
cellule follicolari colonnari appartenenti alla regione ventrale della camera ovarica. Nello stadio l0B I’espressione
si estende dorsalmente interessando una vasta zona follicolare che circonda I’oocita. Contrariamente a quanto
visto negli altri geni codificanti per proteine della membrana vitellina, il trascritto di VM32E non compare mai
nelle cellule follicolari anteriori e posteriori l’oocita.
L’analisi molecolare del promotore ha evidenziato una struttura modulare formata da distinti elementi cis-agenti
coinvolti nella regolazione spaziotemporale del gene VM32E (Gargiulo e coll., 1991). Sono oggi note 4 sequenze
per la regolazione trascrizionale: due di queste consentono l’espressione nelle cellule follicolari dorsali, una nelle
cellule follicolari ventrali ed un elemento di controllo negativo impedisce I’espressione nelle cellule follicolari
anteriori (Cavaliere e coll., 1997).
IDEA DELLA TESI
Il complicato profilo d’espressione di VM32E suggerisce l’esistenza di più fattori, in grado di regolare la funzione
di tale gene all’interno dei vari gruppi di cellule follicolari. Al fine di poterne definire il ruolo fisiologico,
l’identificazione di un allele mutante specifico per VM32E è sicuramente uno degli obiettivi futuri più importanti. I
fenotipo atteso per questo mutante consiste nella sterilità femminile provocata da alterazioni strutturali della
membrana vitellina.
Una collezione di mutanti femmina sterile che mappano sul cromosoma 2 è stata ottenuta e
descritta, nel 1991, da Trudi Schϋpbach ed Eric Wieschaus. Questi autori hanno pubblicato i risultati di una
mutagenesi con EMS: gli adulti omozigoti, ricavati dai ceppi allestiti bilanciando i singoli cromosomi 2
mutagenizzati, sono stati sottoposti ad un test per la fertilità femminile. Questo tipo di analisi ha consentito
I’individuazione di 528 ceppi femmina sterile di Drosophila melanogaster, successivamente suddivisi in tre
categorie fenotipiche generali. All’interno di ogni classe fenotipica sono stati selezionati i ceppi ritenuti più
rappresentativi e, per ciascuno di essi, la mutazione responsabile è stata mappata geneticamente. In questo
modo è stato possibile definire vari loci genici, spesso rappresentati da alleli multipli. Successivamente sono stati
eseguiti test di complementazione con gli alleli appartenenti a loci già noti che mappano nella stessa regione
lungo il cromosoma2.
La mia attenzione si è focalizzata sui ceppi di Drosophila melanogaster che presentano mutazioni “femmina
sterile” in grado di influenzate la produzione dei rivestimenti dell’uovo, allo scopo di analizzarne I’effetto sulla
trascrizione del gene VM32E. Fra questi mutanti, solo 16 sono stati caratterizzati geneticamente mentre per i 51
ceppi rimanenti è noto il fenotipo dal punto di vista morfologico.
Inoltre, considerando il fenotipo delle camere ovariche e degli embrioni prodotti da femmine omozigoti per gli
alleli mutanti gurken ed fs(1)K10, rispettivamente “ventralizzato” e “dorsalizzato” per effetto della perdita
d’identità cellulare da parte di ampie porzioni dell’epitelio follicolare (Gonzàles-Reyes e coll., 1995; Schϋpbach,
1987; Wieschaus e coll., 1978), ho voluto analizzare I’espressione che il gene VM32E assume nel contesto delle
singole mutazioni. In base alla complementarità fenotipica mostrata da questi mutanti nei confronti dell’identità
acquisita dalle cellule follicolari, lo scopo della mia analisi è quello di verificare la dipendenza del profilo
d’espressione di VM32E dalla diversa identità che le cellule follicolari acquisiscono lungo l’asse dorso-ventrale
dell’oocita.
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Infine, ho analizzato i ceppi mutanti wavoid-like e porcellana. L’allele mutante wdl fu identificato da
L. Sandler, nel 1977, sul braccio sinistro del cromosoma 2 di Drosophila melanogaster in seguito a mutagenesi con
EMS. Le femmine omozigoti per la mutazione appaiono vitali e semi-sterili: questo implica l’esistenza di
alterazioni ipomorfiche a bassa espressività. Inoltre, la caratterizzazione genetica di wdl ha rivelato la sua
localizzazione nella banda 32 dei cromosomi politenici. Queste caratteristiche giustificano la decisione di
analizzare l’effetto del contesto genetico di wdl sull’espressione del gene VM32E, tanto più che esperimenti di
Northern Blot avevano precedentemente rivelato una netta riduzione della quantità del suo messaggero allo
stadio 10. La ricerca da me condotta in questo ambito si propone di analizzare il profilo d’espressione spaziotemporale che il gene VM32E assume nei mutanti wdl, allo scopo di chiarire con quali caratteristiche la riduzione
del messaggero è rappresentata all’interno dei vari gruppi di cellule follicolari.
Il ceppo denominato porcellana per la fragilità mostrata dalle uova, è un mutante “femmina sterile” ottenuto nel
laboratorio del Prof. Gargiulo in seguito ad incrocio disgenico. Le uova deposte dalle femmine omozigoti per la
mutazione inserzionale appaiono molto fragili e, in seguito all’eliminazione del corion, collassano
immediatamente. Questo fenotipo evidenzia alterazioni che coinvolgono il corretto assemblaggio della
membrana vitellina e del rivestimento corionico.
MATERIALI E METODI: IBRIDAZIONE IN SITU NELLE CAMERE OVARICHE
L’esperimento consiste nella caratterizzazione dei mutanti sopracitati in relazione al profilo d’espressione del
gene VM32E. La tecnica adottata è l’ibridazione in situ del suo mRNA mediante l’utilizzo di una sonda di DNA
marcata con Digossigenina.
1) IL PLASMIDE HH5
Il clone DH5α di Escherichia coli viene trasformato con il plasmide HH5 formando il clone HH5. Il plasmide HH5
deriva dall’inserzione della regione codificante di VM32E all’interno del plasmide pUC19, il quale contiene come
marcatore il gene per la ampicillino-resistenza.
Fasi operative: Preparazione delle cellule competenti. - Trasformazione. - Clonaggio ed estrazione del
plasmide HH5 - Purificazione del plasmide HH5 - Elettroforesi su gel d’agarosio - Valutazione della
concentrazione di plasmide.
2) SINTESI P.C.R. DELLA SONDA MARCATA CON Dig-dUTP
La sequenza della sonda deve essere specifica per il solo messaggero di VM32E e per questo motivo non deve
contenere la regione di omologia che accomuna i vari geni coinvolti nel processo di formazione della membrana
vitellina (Fig. 7).
Fig.7: Il plasmide HH5 contiene la porzione codificante del gene VM32E
La sonda antisenso marcata con digossigenina viene sintetizzata mediante una reazione di P.C.R. la cui lunghezza
del frammento amplificato viene determinata dall’estremità 5’ del taglio BamHI, effettuato sul plasmide, e dal
primer che interagisce con il filamento senso di VM32E (Fig. 8).
Fig. 8: La sonda-Dig è complementare alla regione +230 / +367 del filamento senso di VM32E.
Gli estremi della reazione di amplificazione sono formati dal primer + 337 / + 367 e dal taglio BamHI.
3) IBRIDAZIONE IN SITU
Per ogni ceppo mutante esaminato, circa 50 femmine omozigoti vengono messe ad invecchiare assieme ad alcuni
maschi su di un terreno ricco di lievito fresco per 3 giorni a25°C. Questo consente di ottenere ovarioli ben
sviluppati che contengono camere ovariche a tutti gli stadi di sviluppo. Gli ovari vengono raccolti mediante
dissezione: dopo aver addormentato le Drosophile con etere, si pongono alcune femmine su poche gocce di EBR
1X ghiacciato, in un vetrino porta oggetto. L’EBR è una soluzione isotonica, in grado di mantenere integra la
struttura delle ovaie per un certo intervallo di tempo.
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Mediante I’ausilio dell’ago di una siringa da 1 ml, si opera un taglio all’estremità posteriore del corpo e, mentre
con un altro ago si tiene fermo il moscerino, si estraggono gli ovari ripulendoli dalle strutture che li circondano. A
questo punto gli ovari vengono introdotti in tubi eppendorf da 1,5 ml contenenti EBR 1X e posti in ghiaccio fino al
momento della fissazione del preparato. Come controllo sull’affidabilità dei risultati ottenuti, ogni esperimento
viene eseguito con modalità identiche sulle camere ovariche di femmine del ceppo selvatico Canton S.
Fasi operative: Fissaggio delle camere ovariche - Preadsorbimento dell’ anticorpo - Determinazione
della stringenza di base per l’ibridazione – Ibridazione - Riduzione della concentrazione salina:
stringenza fine - Rilevazione della sonda con l’anticorpo anti-Dig.
RISULTATI
Sono qui riportati i risultati di solo alcuni dei differenti mutantr analizzati, poiché la maggior parte dei ceppi
"femmina sterile" esaminati non ha evidenziato alterazioni del profilo d'espressione di VM32E rispetto al
controllo selvatico.
Ceppo Canton S
Le camere ovariche di questo ceppo selvatico non mostrano alcuna colorazione fino allo
stadio 9 dell'oogenesi. Nello stadio 10A si rileva la presenza del messaggero di VM32E nelle
cellule follicolari ventrali appartenenti all'epitelio colonnare che avvolge I'oocita (Fig. 9).
La conferma dell'identità ventrale assunta dalle cellule follicolari e data dalla posizione del
nucleo oocitario visibile nella foto, il quale durante lo stadio 10A è sempre localizzato nella
regione dorso-anteriore dell'oocita.
Nello stadio 10B, I'espressione del gene VM32E si estende a tutta la fascia dorso-ventrale
dell' epitelio follicolare colonnare, escludendo quelle cellule che avvolgono l'oocita nei suoi
estremi anteriore e posteriore (Fig. 10)
Ceppo PU34
La comparsa della colorazione nelle camere ovariche delle femmine omozigoti è
temporalmente corretta poiché non visibile fino allo stadio 10A, quando inizia a visualizzarsi
all'interno di una ristretta regione dell'epitelio follicolare ventrale. L’analisi del profilo
d'espressione di VM32E rivela importanti alterazioni di tipo spaziale evidenti durante lo
stadio 10B: a questo punto dello sviluppo, l’mRNA compare nelle cellule dell'epitelio
follicolare che avvolge I'oocita escludendo una vasta area anteriore ed una zona più
ristretta del polo posteriore (Fig. 11).
Una tale alterazione appare evidente se confrontata con il fenotipo mostrato dal ceppo
selvatico di controllo allo stadio corrispondente: in questo caso la colorazione appare
estesa a tutta la regione dorso-ventrale dell'epitelio follicolare che circonda l'oocita
escludendo solo due piccoli gruppi di cellule colonnari che ne avvolgono gli estremi.
Ceppo HH32
L’analisi di questo ceppo è stata molto laboriosa in quanto le femmine omozigoti nascevano
con frequenza ridotta ed inoltre presentavano notevoli alterazioni nella struttura dell'intero
ovario. All'interno degli ovarioli erano contenute numerose camere ovariche a stadi precoci
dello sviluppo; lo stadio 10 e quelli successivi comparivano raramente.
Il trascritto di VM32E, all'interno delle cellule follicolari colonnari che circondano I'oocita, è
rilevabile allo stadio 10B: I'intensità della colorazione è notevolmente ridotta rispetto al
controllo ed in alcuni casi del tutto assente (Fig. 12).
Una caratteristica molto evidente in tutte le camere ovariche, anche in quelle agli stadi più
precoci, è la colorazione del citoplasma nelle cellule nutrici. L'espressione del gene VM32E,
in questo mutante, appare non correttamente regolata secondo l’aspetto temporale,
inoltre l'attività complessiva rimane quantitativamente bassa.
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Ceppo PR67
Per le femmine omozigoti di questo ceppo I'instaurarsi dell'attività di VM32E appare
regolare. L ibridazione rivela, nelle camere ovariche di stadio 10A (non illustrato), la
presenza del messaggero nella sua corretta localizzazione. Allo stadio di sviluppo
successivo, differentemente dal controllo selvatico, I'espressione del gene non si estende
totalmente al corpo principale dell'epitelio follicolare ed il segnale conferisce alle camere
ovariche un aspetto macchiettato, visibile per trasparenza lungo tutta la fascia epiteliale
(Fig. 13). Questo fenotipo può essere dovuto tanto all'alterazione di specifici elementi di
controllo del promotore di VM32E, quanto all'assenza di un fattore di trascrizione specifico
in alcune regioni dell'epitelio follicolare.
Ceppo RD77
La rilevazione in situ del trascritto di VM32E, nelle camere ovariche prodotte dalle femmine
omozigoti per la mutazione, ha mostrato una netta riduzione nell'intensità di colorazione
dell'epitelio follicolare rispetto a quella osservata in contesto selvatico. Questa alterazione,
visibile già allo stadio 10A (non illustrato), appare evidente in quello 10B dove I'epitelio
follicolare colonnare si colora solo nella regione ventrale (Fig. 14).
Questo risultato indica I'esistenza di un'alterazione nel meccanismo di regolazione
dell'espressione di VM32E all'interno delle cellule follicolari che hanno assunto l'identità
dorsale. La mutazione potrebbe coinvolgere direttamente i moduli del promotore che
governano l'espressione nelle cellule follicolari dorsali (Cavaliere e coll. 1997) oppure i loro
specifici fattori trans-agenti.
Ceppi gurken ed fs(1)K10
Le camere ovariche e gli embrioni di femmine omozigoti grk mostrano un fenotipo
"ventralizzato", che deriva dalla perdita dell'identità cellulare nei domini dorsali dell'epitelio
follicolare colonnare che avvolge I'oocita. Alterazioni nell'identità cellulare sono state
evidenziate anche in senso longitudinale, poiché nelle camere ovariche grk è possibile
osservare la migrazione cellulare centripeta, caratteristica dell'epitelio che separerà I'oocita
dalle cellule nutrici agli stadi tardivi dell'oogenesi, anche nel polo posteriore (GonzàlezReyes e coll., 1995).
Nelle camere ovariche grk, la trascrizione di VM32E inizia allo stadio 10° come nel ceppo
selvatico. Tuttavia la colorazione non è limitata ventralmente ma appare
contemporaneamente in tutto l'epitelio colonnare ad eccezione di quello che riveste i poli
dell'oocita (Fig. 15).
Questo risultato era atteso in base alle caratteristiche accertate del promotore di VM32E,
nel quale è stato riconosciuto un elemento positivo per I'attivazione ventrale del gene
(Gargiulo e coll., 1991; Cavaliere e coll., 1997).
Il successivo mutante analizzato, fs(1)K10, in accordo con le caratteristiche descritte per il
promotore, dovrebbe perciò mostrare un ritardo nell'inizio della trascrizione di VM32E.
Come si può vedere nella figura 16, che illustra una camera ovarica K10 allo stadio 10A, non
si osservano segnali di ibridazione.
I segnali compaiono su tutto I'epitelio follicolare colonnare, ad esclusione dei poli, soltanto
in camere ovariche di stadio 10B (Fig. 17).
L'evidente alterazione del profilo spazio-temporale nell'espressione del gene VM32E è
giustificata dalla dorsalizzazione che caratterizza le uova di questi mutanti. Durante lo
stadio 10A, le cellule follicolari di K10 non sono in grado di sintetizzare il messaggero
analizzato, poiché la loro condizione genetica impedisce l'elaborazione del segnale ventrale
per I'attivazione di VM32E. Allo stadio 10B invece, le cellule dell'epitelio follicolare
dorsalizzato possono attivare VM32E avvalendosi degli elementi dorsali del suo promotore.
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Ceppo wavoid-like
Nelle camere ovariche allo stadio 10A di questo mutante, il profilo d'espressione del gene
VM32E non mostra differenze di tipo spaziale rispetto al controllo: in questo stadio
I'espressione è limitata alla regione ventrale dell'epitelio follicolare. Nello stadio 10B,
l'attività trascrizionale si differenzia da quella del ceppo selvatico in quanto la colorazione
delle camere ovariche appare in una regione notevolmente ristretta dell'epitelio follicolare
colonnare che fascia I'oocita lungo I'asse dorso-ventrale. Le regioni in cui I'espressione del
gene VM32E non avviene, sono localizzate ai due poli dell'oocita ed appaiono più ampie
rispetto a quelle osservate nel controllo selvatico (Fig. 18).
Questo risultato permette di chiarire il motivo della riduzione quantitativa dell'mRNA di VM32E, riscontrata mediante
Northern blot, allo stadio 10 dell'oogenesi nel contesto mutante wdl (Gigliotti e coll., 1989). Infatti, l'analisi in situ rivela una
netta alterazione, nel profilo d'espressione spaziale, caratterizzata dalla diminuzione del numero di cellule follicolari in grado
di trascrivere il gene VM32E durante lo stadio 10B.
Ceppo porcellana
Il profilo d'espressione di VM32E in questo mutante è visibilmente alterato allo stadio 10B
dell'oogenesi. La distribuzione spaziale del trascritto, all'interno dell'epitelio follicolare,
appare ridotta nei poli anteriore e posteriore dell'oocita (Fig. 19).
Tuttavia, la colorazione del preparato ha richiesto tempi di esposizione molto inferiori
rispetto alle camere ovariche del controllo, indicando che la quantità complessiva di
trascritto prodotta dalle cellule follicolari competenti per l'espressione di VM32E è
maggiore che nel selvatico.
DISCUSSIONE
Nella formazione di strutture come la membrana vitellina, un ruolo di fondamentale importanza è svolto dal
processo di assemblaggio mediante il quale le varie proteine vengono posizionate in stretta relazione le une con
le altre. Alla guida di questo meccanismo si trova il diverso profilo d'espressione spazio-temporale a cui sono
soggetti i vari geni coinvolti: in sostanza I'assemblaggio delle proteine sulla membrana vitellina dovrebbe essere
coordinato da quei processi di determinazione cellulare che portano alla differenziazione regionale dell'epitelio
follicolare.
Le analisi molecolari condotte sul promotore del gene VM32E ne hanno rivelato una struttura modulare nella
quale sono state riconosciute particolari sequenze cis-agenti poste nella regione 5' terminale del gene, necessarie
per la sua corretta espressione nei diversi domini dell'epitelio follicolare. Con alta probabilità, queste sequenze
rappresentano dei siti per il legame con fattori di regolazione distinti, i quali vengono elaborati all'interno di
specifiche sottopopolazioni cellulari dell'epitelio follicolare, secondo un processo temporale ben definito.
La ricerca da me svolta conferma I'importanza della corretta identità dorso-ventrale che le cellule dell'epitelio
follicolare devono possedere per assumere la competenza a trascrivere il gene VM32E, come emerge
chiaramente dall'analisi condotta nei contesti mutanti gurken ed fs(1)K10.
Inoltre I'analisi dei 53 ceppi mutanti "femmina sterile" mi ha permesso di identificare delle alterazioni nel profilo
d'espressione di VM32E, le quali potrebbero essere dovute a mutazioni dei geni coinvolti nella regolazione
trascrizionale di tale gene, oppure a mutazioni dirette del suo promotore (vedi ceppi RD77 e PR67). La verifica di
queste ipotesi richiede uno studio più approfondito dei mutanti in questione. Ad esempio, sarebbe molto
interessante analizzare il comportamento che i geni reporter-lacZ assumono, quando posti sotto il controllo di
specifiche porzioni del promotore di VM32E nell'ambito dei contesti mutanti che hanno evidenziato le alterazioni
descritte nei risultati. Un'altra analisi che si può condurre è la determinazione dell'assetto della regione genomica
posta al 5' del gene VM32E tramite PCR.
Questi approcci, integrati con lo studio in situ della proteina VM32E mediante l'utilizzo di anticorpi, condurranno
ad una caratterizzazione più completa dei mutanti analizzati. Si potranno infatti riconoscere anche le alterazioni
che interferiscono con il processo d'espressione di VM32E in livelli successivi alla trascrizione.
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