ANALISI SSCP AL LOCUS GH NELLA RAZZA OVINA ALTAMURANA
SINGLE STAND CONFORMATION POLYMORPHISM AT THE oGH IN ALTAMURANA SHEEP
CARNICELLA D., RICCI D., DARIO C., BUFANO G.
Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali –Università degli Studi di Bari
Str prov.le per Casamassima km3, 70010 Valenzano (Ba)
Parole chiave: polimorfismo genetico, GH, SSCP, Altamurana
Key words: genetic polymorphism, GH, SSCP, Altamurana
Abstract
The present preliminary study attempts to analyse genetic polymorphism at the GH gene in Altamurana sheep
breed in order to contribute to marker gene information about the oGH gene using a non radioactive SSCP
protocol. The DNA of animals belonging to indigenous Apulian sheep was evaluated.
Single strand conformation polymorphisms (SSCP) were identified at the exon five of the ovine growth hormone
gene (oGH). Since several conformational patterns were found and due to its role in the galactopoietic
metabolism and in the growth process, it’s reasonable that the oGH gene could be exploited as a possible
candidate gene for marker assisted selection in sheep breeds.
Introduzione
La conservazione delle risorse genetiche animali quindi della variabilità di una popolazione assume in
ambito zootecnico una valenza socio-culturale non trascurabile. Preservare le razze autoctone significa infatti
conservare e custodire usi e costumi di un territorio che spesso caratterizzano una precisa tipologia di
allevamento capace di formare un binomio perfetto al fine di ottimizzare le performance.
Conoscere diventa il mezzo quindi lo strumento con cui questo tentativo non resta vano e soprattutto
può, a seconda dei casi, essere efficace nel ristabilire un delicato equilibrio che nel tempo può risultare precario.
La razza ovina Altamurana costituisce uno degli ultimi baluardi della tradizione e della cultura pugliese; una
delle poche razze in grado di sfruttare al meglio le risorse modeste, sia alimentari che idriche, tipiche delle zone
marginali del Meridione d’Italia. (Pieragostini e Dario, 1996). Il tentativo di valorizzarla come risorsa zootecnica
passa attraverso studi decennali (Bufano et al., 1996; Pieragostini e Dario, 1996; Dario et al., 2000) che oggi
sono resi più attuali anche grazie all’uso delle biotecnologie (Dario et al., 2003; Dario et al., 2005).
Le tecniche che oggi abbiamo a disposizione per effettuare indagini molecolari utili per studiare la
variabilità genetica si basano sull’identificazione del polimorfismo lungo segmenti genomici. Questa peculiarità
è dovuta alla presenza di mutazioni puntiformi lungo la catena del DNA. Il presupposto è che tutti i cambiamenti
che si verificano a livello nucleotidico in una sequenza genomica possono influenzare le caratteristiche
biomolecolari, quindi la capacità di interagire con un substrato, quando posto in opportune condizioni
sperimentali. È inoltre importante cercare di localizzare queste mutazioni identificando i geni coinvolti poiché
sono in grado di modularne l’attività in vario grado consentendo così di spiegare, con il meccanismo di causaeffetto, il significato di queste variazioni.
Uno dei possibili approcci è quello del gene candidato che consente di studiare tra i diversi geni quello
che, per complessità di interazioni, sembra offrire maggiori informazioni; a tale riguardo l’asse ipotalamoipofisario ed in particolare il gene dell’ormone della crescita sembra costituire il candidato ideale. Il
polimorfismo genetico a carico di quest’ormone è stato studiato nelle diverse specie animali e con le più
disparate tecniche, tanto da costituire per noi un modello ed una fonte di ispirazione (Carnicella et al., 2003;
Dario et al., 2004; Dario et al., 2005). Tuttavia questi studi si sono maggiormente concentrati sulla specie bovina
e suina, lasciando a ovini e caprini un territorio sperimentalmente ignoto quindi impervio; non c’è da
meravigliarsi considerando il fatto che nel settore zootecnico accanto al valore biologico di ciascun animale
esiste un valore meno platonico e più universale….quello economico!!
Lo scopo del presente lavoro è quello di approfondire le conoscenze riguardanti la variabilità genetica
del gene GH e di contribuire alla caratterizzazione genetica della razza ovina Altamurana utilizzando uno dei
possibili protocolli SSCP ed offrire un potenziale strumento nella pratica della selezione assistita da marcatori.
Materiali e metodi
Il DNA è stato ottenuto con un protocollo di estrazione rapida di materiale genomico a partire da
quaranta campioni individuali di sangue ovino. Una quantità standard di DNA (3µl) è stato aggiunto ad una mix
di amplificazione contenente 200mM di dNTPs, 1mM di ciascun primer, 1.0 unità di Taq polimerasi e buffer
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 e 2,5 mM di MgCl2 , 50 mM di KCl) per essere successivamente sottoposto ad analisi
PCR. I primer sono stati disegnati per consentire di amplificare una regione compresa nell’esone 5 del gene
dell’ormone della crescita sulla scorta della sequenza completa di Orian et al. (1988) (Genebank X12546).
L’amplificazione è stata verificata con elettroforesi su gel di agarosio al 2% in tampone di corsa TBE
1X (2mM di EDTA, 90mM di Tris-Borato pH 8,3) e confrontato con marcatore a bande di grandezza nota per
poter ricavare la grandezza dei frammenti ottenuti; il tutto è stato colorato con etidio bromuro (1mg/ml).
Per il protocollo SSCP in fase preliminare sono state testate le condizioni sperimentali al fine di
standardizzare la metodica; inizialmente la mobilità elettroforetica risultava rallentata e la separazione tra i
filamenti non era soddisfacente. Sono state ottimizzate le quantità di prodotto PCR (da 4 µl a 10 µl) come anche
la soluzione denaturante, la concentrazione di acrilamide (da 8% a 15%), il voltaggio applicato (da 60 a 110V)
ed infine il tempo di corsa (da 4 a 17 ore) e la temperatura (tra i 15 e 20°C).
E’ stato possibile analizzare l’amplificato utilizzando le condizioni descritte di seguito. A 5 µl di
prodotto PCR sono stati aggiunti 10 µl di stop solution (95% di formamide, 10mM di NaOH, 0,05 % di xylene
cianolo e 0,05% di blu di bromofenolo).
I campioni opportunamente miscelati sono stati incubati a 95°C per 5 min, condizione che ha permesso
la denaturazione dei filamenti di DNA quindi l’allontanamento degli strands; tale reazione richiede un
successivo shock termico (0°C per qualche minuto) per potersi bloccare. Ciascun campione è stato caricato su un
gel non denaturante di poliacrilamide al 12%, per la migrazione sono state applicate le seguenti condizioni: 110V
a 15°C. Il preparato è stato sottoposto a colorazione con sali d’argento.
Risultati e conclusioni
Sulla base della sequenza depositata in banca dati da Orian et al. (1988) relativa alla specie ovina, è
stato possibile confrontare il frammento ottenuto dopo PCR con la grandezza presumibile compresa tra il
nucleotide 1634 ed il 1998, corrispondente all’esone 5 del gene GH.
Dopo analisi SSCP sono state evidenziate diverse bande presumibilmente corrispondenti ad altrettanti
patterns di conformazione . Non essendo ancora in possesso dei dati relativi al sequenziamento dei prodotti
abbiamo semplicemente numerato in modo progressivo da 1 a 5 i patterns elettroforetici ottenuti. Come si può
osservare dalla foto (fig 1 ) tale frammento mostra una elevata variabilità, tuttavia la posizione di alcune bande
quindi di alcune conformazioni sembra ripetersi con una certa frequenza, in particolare il pattern 1 (in foto la
corsa 6, 7 e 8) è stato osservato con frequenza del 55%, il pattern 2 (in foto la corsa 2 e 9) osservato con
frequenza pari al 17,5% come il pattern 3 (in foto 1 e 3); infine il pattern 4 e 5 che sono apparsi meno
frequentemente (5% rispettivamente corsa 4 e 5).
Tuttavia le fonti bibliografiche consultate relative a indagini SSCP in razze ovine autoctone portoghesi
(Bastos et al., 2001 ) si sono rilevate piuttosto utili per l’interpretazione dei tracciati ottenuti tanto da confermare
quanto osservato nel presente studio.
Va da se che trattandosi di una fase preliminare di un lavoro di ricerca di un più ampio respiro il numero
dei soggetti sottoposti ad analisi SSCP resta esiguo e da verificare con ulteriori indagini
Fig 1. L’immagine riporta l’analisi SSCP del frammento del gene GH in cui
è possibile evidenziare i diversi pattern conformazionali.
La conservazione di un numero elevato di razze ovine locali, allevate in condizioni diversificate in
funzione delle risorse del territorio, costituisce il tentativo di frenare la tendenza opposta atta a valorizzare razze
con standard più elevati e produzioni più omogenee. Tale fenomeno è da ascriversi prevalentemente a ragioni
economiche e si riflette negativamente sull’opera di salvaguardia della variabilità genetica (Flamant, 1991).
Tuttavia per consentire il lavoro di recupero delle risorse tipiche di un territorio è indispensabile
rivalutare le peculiarità delle diverse razze anche avvalendosi delle biotecnologie che trovano un’interessante
collocazione e applicazione in campo zootecnico.
Con questo studio preliminare ci siamo proposti di indagare, con un approccio di tipo molecolare, il
polimorfismo genetico a carico del gene del GH in una razza che vogliamo sperare continui ad appassionare i
colleghi ricercatori, al fine di aiutare concretamente quanti impegnati nell’arduo compito della salvaguardia delle
risorse genetiche animali.
Bibliografia
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