TEST PER FARMACI ANSIOLITICI
E BENZODIAZEPINE
DEFINIZIONE DI ANSIA
componente comune a molte condizioni biologiche
emozione universale dell’uomo
l’ansia è nella maggior parte dei casi utile per adattamenti di
tipo psicobiologico
l’ansia diventa un problema patologico solo in una minoranza
di casi
CARATTERISTICHE DELL’ANSIA
l’ansia può essere una componente di altri disturbi psichiatrici, e
presenta a sua volta diverse forme che possono complicare la sua
diagnosi e il suo trattamento
CAUSE DELL’ANSIA
generalmente, l’ansia è incrementata da
attesa di eventi inevitabili
esposizione a un ambiente nuovo
Paura
sensazione di incertezza
incapacità di esprimere impulsi o desideri
creazione di un conflitto interiore che
blocca il comportamento
Conflitto
CAUSE DELL’ANSIA
l’ansia è un fenomeno che si autoalimenta, e la sua genesi è
spiegata in genere con anomalie del sistema adrenergico,
serotoninergico e, soprattutto, GABAergico farmaci
MECCANISMO GABAERGICO E FARMACI
Il recettore GABA-A ha un ruolo
cruciale nell’ansia e può legare
numerose molecole con azione
agonista o modulatoria
MECCANISMO GABAERGICO E FARMACI
le benzodiazepine sono i farmaci più utilizzati per il trattamento
dell’ansia
le benzodiazepine agiscono da modulatori del canale al GABA
in assenza di GABA il canale ionico non si apre
il loro meccanismo d’azione li rende farmaci molto più sicuri di altri
come i barbiturici che prima venivano usati per il trattamento
dell’ansia
NUOVI FARMACI PER L’ANSIA
lo sviluppo di nuovi
farmaci per l’ansia
riflette
il
coinvolgimento
di
sistemi diversi dal
GABA e cerca di
superare gli effetti
collaterali e i limiti
delle benzodiazepine
NUOVI FARMACI PER L’ANSIA
gli agonisti del recettore 5-HT1A sono farmaci molto promettenti
i loro effetti sarebbero dovuti a un’azione sul nucleo del rafe
magno che proietta all’ippocampo
MODELLI SPERIMENTALI CHE VALUTANO
FARMACI ANSIOLITICI
MODELLI SPERIMENTALI
si possono essenzialmente suddividere in due grandi categorie
etologici impiegano un comportamento naturale dell’animale
condizionati impiegano un comportamento appreso
entrambe le categorie di modelli hanno vantaggi e svantaggi
MODELLI ETOLOGICI
VANTAGGI
non richiedono addestramento
usano apparecchiature semplici
non necessitano di privazione di cibo e/o acqua
SVANTAGGI
hanno una forte componente motoria che può essere
influenzata dai farmaci valutati
devono essere impiegati una sola volta su un particolare
animale
può esistere una marcata variabilità dei risultati ottenuti
MODELLI CONDIZIONATI
VANTAGGI
l’addestramento degli animali consente
riproducibilità dei risultati
il test può essere ripetuto sugli stessi animali
una
maggiore
SVANTAGGI
ci possono essere effetti non specifici dei farmaci valutati (es:
effetto miorilassante)
necessitano di addestramento
spesso necessitano di privazione di acqua e/o cibo
TEST PER LA VALUTAZIONE DEI FARMACI
SPECIFICI PER LE BENZODIAZEPINE
1) binding
2) antagonismo aggressività
ADATTI PER TUTTI GLI ANSIOLITICI
1) labirinti sopraelevati (a quattro bracci, 0 maze)
2) open field
etologici
3) test dell’interazione sociale
4) test del “marble burying”
5) gabbia a due comparti test di evitamento
6) test delle vocalizzazioni ultrasoniche
7) test del conflitto
8) test della discriminazione
condizionati
STUDI DI COMPETIZIONE CON IL BINDING
presenza di GABA
assenza di GABA
la curva mostra la competizione tra il flumazenil (RO 15-1788, antagonista del sito per le
benzodiazepine), l’oxazepam (agonista) e il RO 14-7437 (antagonista) la presenza di
GABA influisce esclusivamente sulla competizione con un agonista
STUDI DI COMPETIZIONE CON IL BINDING
agonisti
antagonisti
agonisti inversi
GABA ratio
KD in assenza di GABA
KD in presenza di GABA
TEST DELL’AGGRESSIVITA’
si utilizzano animali selezionati per la loro aggressività. è
anche possibile indurre aggressività negli animali
lasciandoli in isolamento prolungato o, nel caso del ratto,
introducendo un topo nella gabbia
le benzodiazepine contrastano l’aggressività il test è
poco utilizzato
TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI
SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE)
versione originale due bracci
sono aperti e due presentano
delle pareti nel senso della
lunghezza
varianti due bracci sono aperti e
due presentano delle pareti nel
senso della lunghezza e della
larghezza, oppure un solo braccio
presenta pareti laterali
TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI
SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE)
un animale deve essere esposto una sola volta al
labirinto il test non deve essere ripetuto sullo stesso
animale
parametri misurati numero di ingressi in ciascun
braccio, tempo trascorso in ciascun braccio (in 5 minuti)
animale di controllo tende a trascorrere un tempo
maggiore nei bracci chiusi
ansiolitico incrementa gli ingressi nei bracci aperti e il
tempo trascorso in essi
TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI
SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE)
parametri critici per il test illuminazione uniforme in
tutto il labirinto
parametri accessori misurati distanza totale coperta
nel labirinto, tempo trascorso nel quadrato centrale,
numero di “head dips” (indice di impulsività), numero di
boli fecali emessi durante il test
TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI
SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE)
l’incremento del tempo trascorso nei
bracci aperti non va inteso in senso
assoluto, ma relativamente agli
animali di controllo
questo esperimento dimostra perché
il test con l’elevated plus maze deve
essere effettuato una sola volta
TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO
(O ELEVATED ZERO MAZE)
è
un
evoluzione
dell’elevated plus maze, in
cui il labirinto è circolare e
presenta delle zone protette
e non protette in genere
si preferisce all’elevated
plus maze nel caso si usino
topi
TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO
(O ELEVATED ZERO MAZE)
un animale deve essere esposto una sola volta al
labirinto il test non deve essere ripetuto sullo stesso
animale
parametri misurati numero di ingressi in ciascuna
area, tempo trascorso nelle aree aperte e chiuse (in 5
minuti)
animale di controllo tende a trascorrere un tempo
maggiore nelle zone chiuse
ansiolitico incrementa gli ingressi nelle zone aperte e il
tempo trascorso in esse
TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO
(O ELEVATED ZERO MAZE)
parametri critici per il test illuminazione uniforme in
tutto il labirinto
parametri accessori misurati distanza totale coperta
nel labirinto, numero di “head dips” (indice di
impulsività), numero di boli fecali emessi durante il test
TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO
(O ELEVATED ZERO MAZE)
come nel caso dell’elevated plus maze, l’incremento del tempo trascorso nelle
aree aperte non va inteso in senso assoluto, ma relativamente agli animali di
controllo
il grafico mostra che i risultati ottenuti utilizzando i due apparati sono
sovrapponibili
TEST DELL’OPEN FIELD
valuta gli effetti del farmaco esaminato sui parametri
comportamentali misurabili in un open field distanza percorsa,
numero di spostamenti, grooming, rearing, tempo trascorso nella
zona centrale
i farmaci ansiolitici tendono ad incrementare il tempo trascorso
dagli animali nella zona centrale
i farmaci ansiolitici inoltre tendono ad incrementare parametri
quali rearing, grooming e distanza percorsa
TEST DELL’OPEN FIELD
il test dell’open field è inoltre
utilizzabile per verificare la presenza
di effetti sedativi in seguito alla
somministrazione di un agente
ansiolitico questo deve essere
sempre considerato quando si
valutano questi farmaci
TEST DELL’INTERAZIONE SOCIALE
1.
2.
3.
4.
Esplorazione del partner
Ispezione ano-genitale
Monta
Autopulizia
5.
6.
7.
8.
Morsicature
Inseguimento
Scalciamento
Collutazione
TEST DELL’INTERAZIONE SOCIALE
interazione sociale è favorita da fattori quali il buio e la
permanenza in un ambiente familiare; è sfavorita da forte
illuminazione e ambiente non familiare
farmaci ansiolitici non agiscono sulle interazioni sociali in
condizioni “favorevoli”, ma le possono promuovere in caso di
condizioni non gradite agli animali
in questo test è fondamentale chiarire se il farmaco valutato
possiede effetti non specifici che possono interferire con le
interazioni sociali es: effetti stimolanti motori o deprimenti
motori
TEST DEL “MARBLE BURYING”
è un test specifico per i topi misura l’ansia e la neofobia, può
essere usato anche per alcuni farmaci antidepressivi che
agiscono sul comportamento ossessivo compulsivo
protocollo si mette un topo per 30 minuti in una gabbia nuova
che contiene 24 biglie disposte a intervalli regolari. al termine del
test si contano il numero di biglie che sono sotterrate per almeno
2/3
TEST DEL “MARBLE BURYING”
farmaci ansiolitici riducono il numero di biglie sotterrate
il test può essere
sensibile
anche
ad
alcuni antidepressivi
TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE
vocalizzazioni ultrasoniche modalità di comunicazione dei
roditori usata per veicolare informazioni aventi vario significato
vocalizzazioni a 22-kHz lunga durata, frequenza costante,
veicolano segnali “negativi”
vocalizzazioni a 50-kHz corta durata, frequenza variabile,
veicolano segnali “positivi”
TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE
vocalizzazioni che si
valutano per l’ansia
vocalizzazioni
ratto neonato
di
TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE
il test può essere effettuato secondo protocolli differenti il più utilizzato
impiega delle sessioni di foot-shock in ratti adulti alle quali segue l’emissione di
vocalizzazioni condizionate a 22-kHz da parte del ratto
il test può essere effettuato anche valutando le vocalizzazioni emesse da un
ratto appena nato separato dalla madre
i farmaci ansiolitici riducono il numero di vocalizzazioni a 22-kHz emesse
ratti neonati
ratti adulti
TEST DELL’INIBIZIONE DELL’EVITAMENTO
il ratto tenderà a preferire il compartimento scuro della
gabbia e cercherà di dirigersi verso questo
si basa sull’evitamento condizionato
di una scarica elettrica veicolata
nell’ambiente scuro preferito
dall’animale
TEST DELL’INIBIZIONE DELL’EVITAMENTO
durante i primi due giorni del test gli animali vengono lasciati all’interno dello
shuttle-box per 20 minuti, per consentire loro l’ambientamento.
i tre giorni successivi l’animale viene testato sottoponendolo ad un training di
80, 40, 20 trial per un tempo totale di 40, 20, 10 minuti rispettivamente in
comparto scuro
La durata de singolo trial è di 6.5 sec. così suddivisa:
•Stimolo acustico/luminoso 6,5 sec
•Stimolo elettrico ultimi 3 sec dell’intensità di 1 mA fastidioso ma non
doloroso
Ogni trial è distanziato dal precedente di 30 sec e per ottenere una migliore
risposta si usano due stimoli (sonoro e visivo) contemporaneamente.
il trattamento con il farmaco ansiolitico si fa il giorno del test, non dovrebbe
essere fatto durante l’addestramento
TEST DELL’INIBIZIONE DELL’EVITAMENTO
si registrano i seguenti parametri:
stop = numero di shock subiti e nessun passaggio del ratto
durante stimolo
fuga = numero di passaggi in presenza di shock
evitamento = numero di passaggi in presenza di solo stimolo
acustico/visivo
attraversamenti = attraversamenti spontanei durante test
latenza = tempo latenza (sec) tra stimolo acustico/visivo e
passaggio
TEST DELL’INIBIZIONE DELL’EVITAMENTO
gli ansiolitici riducono l’evitamento l’animale non percepisce più
lo stato d’ansia anticipatorio connesso all’arrivo della scarica
elettrica
TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL
in questo test l’animale deve essere privato dell’acqua per almeno
24h prima di iniziare il test
il beccuccio della bottiglia è collegato ad un generatore di scariche
elettriche in modo da generare una situazione di conflitto
nell’animale sete contro scarica elettrica
TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL
esempio di protocollo
privazione dell’acqua
24h
primo test (3 min) in cui agli animali è consentito bere per
verificare se trovano la bottiglia gli animali che non la
individuano si scartano
24h, senza acqua
test vero e proprio (3 min) in cui agli animali è consentito bere fino
ad un certo limite (es 20 leccate), oltre il quale ricevono la scossa
l’arrivo della scossa può essere segnalato da uno stimolo
luminoso o sonoro
risposte non punite leccate fatte prima dello shock
risposte punite leccate fatte dopo che lo shock è stato veicolato
TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL
i farmaci ansiolitici aumentano il numero di risposte punite
riducono lo stato d’ansia associato alla scossa
MTEP = antagonista mGlu5, SB-399835 = antagonista 5-HT6
fattori da considerare nel test di Vogel effetto dei farmaci sulla
sensazione della sete ed effetti sedativi (le risposte non punite
non devono modificarsi)
TEST DEL CONFLITTO DI GELLER
la leva è elettrificata
in questo test l’animale deve essere privato del cibo per almeno
24h prima di iniziare il test
si utilizza un box di Skinner, in cui è presente una leva che
l’animale dovrà manovrare per ottenere il cibo, e che sarà
collegata ad un generatore di scariche elettriche in modo da
generare una situazione di conflitto nell’animale fame contro
scarica elettrica
TEST DEL CONFLITTO DI GELLER
esempio di protocollo
privazione del cibo
24h
primo test (3 min) in cui agli animali è consentito azionare la leva
per verificare se apprendono il collegamento tra cibo e leva gli
animali che non lo fanno si scartano
24h, senza acqua
test vero e proprio (3 min) in cui agli animali è consentito premere
la leva fino ad un certo limite (es 20 pressioni), oltre il quale
ricevono la scossa l’arrivo della scossa può essere segnalato
da uno stimolo luminoso o sonoro
risposte non punite pressioni fatte prima dello shcok
risposte punite pressioni fatte dopo che lo shock è stato
veicolato
TEST DEL CONFLITTO DI GELLER
i farmaci ansiolitici aumentano il numero di risposte punite
riducono lo stato d’ansia associato alla scossa
fattori da considerare nel test di Geller effetto dei farmaci sulla
sensazione della sete ed effetti sedativi o stimolanti motori (le
risposte non punite non devono modificarsi)
TEST DELLA DISCRIMINAZIONE
si basa sulla capacità dei farmaci di provocare specifiche
sensazioni che l’animale è in grado di riconoscere ed associare a
uno stimolo
è un test complesso che richiede un addestramento degli animali
molto impegnativo
impiega un box che contiene due leve che possono essere
azionate per ottenere cibo o acqua la specifica leva che sarà
azionata è determinata dalla sensazione che il farmaco provoca
nell’animale
TEST DELLA DISCRIMINAZIONE
addestramento
Veicolo - leva A
H2O / cibo
Farmaco A - leva B H2O / cibo
si prosegue fino a che l’animale non
impara ad associare gli stimoli alle
leve con un’efficienza di circa 85%
esperimento
somministrazione del farmaco da valutare e verifica del comportamento operante
Farmaco B - leva B H2O / cibo
Farmaco C - leva A H2O / cibo
se il farmaco A e il farmaco B inducono le stesse sensazioni, l’animale premerà
la leva associata al farmaco A durante l’addestramento
se il farmaco C e il farmaco B inducono sensazioni differenti o se il farmaco C
antagonizza gli effetti mediati dal farmaco B, l’animale premerà la leva che
durante l’addestramento era stata associata al veicolo
TEST DELLA DISCRIMINAZIONE: PROCEDURA
addestramento
gli animali si addestrano o somministrando un farmaco ansiogeno
(PTZ, b-carboline) oppure un farmaco ansiolitico è più difficile
valutare effetti ansiolitici in condizioni basali, ma comunque è
possibile farlo
esperimento
durante l’esperimento si somministra nuovamente il farmaco che
l’animale ha imparato a discriminare l’animale premerà la leva
secondo quello che ha imparato durante l’addestramento
successivamente si somministra il farmaco ansiolitico da valutare
la leva che sarà azionata dall’animale dipenderà dalle proprietà
del farmaco
TEST PER FARMACI ANSIOLITICI
i test che valutano farmaci ansiolitici devono essere
necessariamente accompagnati da valutazioni dell’attività
sedativa dei farmaci
valutazioni interne al test es: distanza percorsa in un labirinto,
numero di risposte totali nei test di conflitto, etc
valutazioni accessorie es: attività motoria, rotarod, etc.
MODELLI GENETICI DI ANSIA
