obiettivo

• Il più piccolo oggetto che l’occhio umano può percepire è
quello che interessa almeno 10 cellule sensoriali, però se
avviciniamo l’oggetto all’occhio questo interesserà più
cellule e quindi apparirà più grande (dimensioni reali,
dimensioni apparenti).
• Ad occhio nudo non possiamo diminuire illimitatamente
la distanza tra l’oggetto e l’occhio perché a partire da una
distanza minima il cristallino non riesce più a mettere a
fuoco (250mm).
• Se vogliamo aumentare l’angolo che sottende l’oggetto e
vederlo ingrandito a maggiori dettagli dobbiamo mettere
una lente tra l’oggetto e l’occhio. La lente trasmette
un’immagine ingrandita su un piano che possiamo
comodamente osservare.
• Microscopio semplice: formato da una sola lente
(obiettivo)
• Microscopio composto: formato da almeno 2 lenti oltre alla
prima detta obiettivo, si usa una seconda lente detta
oculare che prende l’immagine proiettata dalla prima per
ingrandirla ulteriormente.
Microscopia: osservazioni superiori a 30
ingrandimenti
STEREOMICROSCOPI
MICROSCOPI OTTICI
•Campioni non preparati
•Ingrandimenti fino a 1500x
•Generalmente non piatti
•Elevata correzione ottica
•Effetto 3D
•Elevata risoluzione
•Ingrandimenti fino a 200x
•Elevata “qualità”
dell’immagine
•Alta distanza di lavoro
•Profondità di fuoco elevata
•Ampio campo visivo
•Tecniche di osservazione
“particolari” (interferenziale)
STEREOMICROSCOPI
MICROSCOPI OTTICI
Lo stereomicroscopio
• Uno stereomicroscopio trasferisce un’
immagine profonda di oggetti a tre dimensioni
• Come nell’osservazione comune, ognuno dei
due occhi vede l’oggetto da una direzione
diversa rispetto all’ altro
• Il cervello elabora le due immagini e le unisce
in una sola immagine stereoscopica
Componenti di uno
stereomicroscopio
•
•
Oculare
Tubo binoculare
•
Corpo ottico
Supporto
•
•
Obiettivo
Colonna e sistema di messa
a fuoco
•
Base
Il microscopio
• Il microscopio trasferisce un immagine ad alto
ingrandimento e ad alta risoluzione
• Il percorso ottico è singolo e viene sdoppiato
solo per rendere più ergonomica la visione
• Il cervello elabora le due immagini e le unisce
in una sola immagine non stereoscopica
Sistema di acquisizione immagini
Tubo fotografico
Osservatore
Stativo
Campione
Obiettivo
Diaframma di apertura
Condensatore
Specchio
Diaframma di campo
Filtri
Tecniche di osservazione
9Campo chiaro
9Campo oscuro
9Contrasto di fase
9Contrasto interferenziale
9Osservazioni in Luce polarizzata POL
9Fluorescenza
Il Campo Chiaro
• La luce passa direttamente attraverso l’obiettivo
• Difrazione, rifrazione e assorbimento della luce formano
l’immagine microscopica
• Luminosità, Risoluzione, Contrasto e Profondità di Campo
sono i parametri che determinano la qualità dell’immagine
Campo Oscuro
Con la microscopia in campo oscuro si osservano campioni
non visibili in campo chiaro, sia perché trasparenti o perché
al di sotto del potere di risoluzione del microscopio.
La luce non arriva perpendicolarmente
all’obiettivo ma viene difratta da un anello
che si trova nel condensatore
Solo la luce difratta è utilizzata per la
formazione dell’immagine.
Campo Oscuro
Effetti della ossidazione su metallo
Contrasto di Fase
La microscopia in Contrasto di Fase consente di
osservare oggetti viventi, cellule o tessuti molto sottili
oggetti trasparenti e non colorati
Contrasto Interferenziale
La microscopia in Contrasto Interferenziale o Nomarski (DIC)
viene utilizzato per l’osservazione di organismi vivi, oggetti
molto sottili non colorati e con minime differenze di indice di
rifrazione rispetto al mezzo o tra le loro parti
Larva di Riccio di mare
Micromanipolazione
Polarizzazione
•Polarizzazione lineare della luce
•Birifrangenza
•Componenti per il contrasto pol
•Immagini ed esempi
•LUCE POLARIZZATA:
Fibre Tessili
IMMAGINI PRESE CON I VARI METODI DI CONTRASTO
Campo chiaro
Campo scuro
ICR
Luce polarizzata
METODI DI CONTRASTO
Fibre Tessili
Campo chiaro
Luce polarizzata con lamina
lambda
Luce polarizzata
Potere di Risoluzione
Il Potere di Risoluzione è la possibilità di distinguere
distintamente 2 punti molto vicini
SEM (Microscopia Elettronica a Scansione)
Potente tecnica per l’osservazione e la caratterizzazione di
superficie di materiali organici ed inorganici eterogenei.
Storicamente il SEM è nato come tecnica a sé stante mentre in seguito
è stato combinato con l’EPA (Electron Probe Analyzer) in un’unica
apparecchiatura permettendo di ottenere contemporaneamente
informazioni topografiche e composizionali della stessa area del
polimero
• strumento sofisticato, ma relativamente semplice da usare
• l’interpretazione dei risultati può essere abbastanza
semplice
Limitazioni all’uso sui polimeri:
• i polimeri sono in genere cattivi conduttori
• gli elettroni accelerati possono danneggiare il campione
Gli elettroni vengono in genere
generati per emissione termoionica
da un filamento di W, ripiegato a V,
dalla zona in prossimità della punta.
e- convergono nella regione cross over
Anodo forato accelera e- (tensione
0-50 kV)
Sistema di lenti elettromagnetiche
Diaframma finale definisce l’apertura del
fascio sul campione
Il SEM viene usato sempre in condizioni di vuoto
dell’ordine di 10-4 mbar con una pompa meccanica più
una turbomolecolare
Perché?
In un ambiente con aria il fascio sarebbe instabile
I gas potrebbe reagire con la sorgente causandone la
combustione
I gas potrebbero ionizzarsi causando scariche
Si potrebbero formare composti tra le molecole
dell’atmosfera e quelle del campione
e- incidenti
e- retrodiffusi (E tra 50 eV e E incidente)
Raggi X
e- secondari (E tra 0 e 50 eV)
e- Auger
Fotoni
e- assorbiti
Conducibilità indotta
e- trasmessi
e- incidenti
Superficie campione
1 nm e- Auger
5-50 nm e- secondari
1-2 µm e- retrodiffusi
2-5 µm raggi X
caratteristici
raggi X del continuo
raggi X di
fluorescenza
CONTRASTO
Composizionale:le rese in elettroni secondari ed elettroni
retrodiffusi aumentano all’aumentare del numero atomico, ma l’effetto
è apprezzabile solo se le regioni a diversa composizione hanno confini
netti
Topografico: è il più importante visto che la maggior parte delle
applicazioni SEM sono volte allo studio della forma dei campioni. Trae
origine dal fatto che il numero e le traiettorie degli e- secondari ed eretrodiffusi dipende dall’angolo tra il fascio e la superficie del
campione.
Mappa X-rays:
Se lo strumento dispone di un detector per raggi X, il
segnale caratteristico di un particolare elemento può
essere mostrato sullo schermo contemporaneamente
alla scansione.
RISOLUZIONE
la risoluzione è limitata dalle dimensioni del fascio e
quindi dall’ottica dello strumento, ma dipende anche da
ciò che accade agli elettroni dopo l’impatto con il
campione
dimensioni medie del fascio: 5-10 nm
la massima risoluzione sarà maggiore
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
• Dimensioni variabili, tipicamente ∅ ca. 10mm
• Per i materiali non conduttori (polimeri) è indispensabile ricoprire
il campione con uno strato sottile di un conduttore
•
•
•
•
METALLIZZAZIONE:
Au, ca. 25 nm (alta resa SEI)
lega Au-Pd
Al
C, strato sottile (bassa resa SEI, indicato per X-rays)
• analisi di fratture
• sezioni
• etching (trattamenti fisici, solventi o miscele di solventi
p.es. HMnO4, HNO3)
ARTEFATTI
• oggetti estranei inglobati accidentalmente
• modificazioni intervenute durante la preparazione del
campione o durante l’analisi
– Decomposizione
– Aumento di temperatura
– Scissioni di catena
CONDIZIONI OPERATIVE
per l’uso su polimeri
•
Potenziale:
un potenziale più elevato garantisce una
migliore risoluzione, ma aumenta il rischio di
artefatti e il campione si carica in misura maggiore
• Corrente: un’elevata corrente aumenta la produzione di artefatti ed
acuisce il problema della carica, ma la corrente minima è
determinata dall’esigenza di mantenere un buon rapporto
segnale-rumore e dipende quindi dalle prestazioni del
detector
• Ingrandimento:
ad ingrandimenti elevati aumenta l’intensità di
corrente per unità di area, aumentando quindi il
rischio di danneggiare il campione
UHMWPE caricato con sferette di vetro
Adesione di macrofagi su film di poletilene
Fibre di poli(vinilalcol)
Retine in polipropilene
per il sostentamento
della parete
addominale
nuova
espiantata
14 mesi
Retine in
poli(etilentereftalato) per
il sostentamento della
parete addominale
nuova
espiantata
50 mesi