indice - UniCA Eprints

INDICE
1
2
INTRODUZIONE
4
1.1
MECCANISMO D’AZIONE DELLA METH
8
1.2
EFFETTI DELLA METH: DATI CLINICI
19
1.3
METH: MODELLI ANIMALI
23
1.4
RECUPERO DEL DANNO INDOTTO DALLA METH
26
1.5
COABUSO DI METH CON ALTRE DROGHE
28
1.6
CANNABINOIDI
30
1.7
CANNABINOIDI:
NEUROINFIAMMAZIONE
E
PATOLOGIE
NEURODEGENERATIVE
36
1.8
39
SCOPO DEL LAVORO
MATERIALI E METODI
41
2.1
ANIMALI
41
2.2
FARMACI E DISEGNO SPERIMENTALE
41
2.3
PESI E TEMPERATURE
45
2.4
IMMUNOISTOCHIMICA
46
1
2.5
2.6
3
PREPARAZIONE DEL TESSUTO
46
IMMUNOFLUORESCENZA
46
ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI E ANALISI QUANTITATIVA
48
WESTERN BLOT
51
PREPARAZIONE DEL TESSUTO
51
IMMUNOBLOTTING
51
ANALISI STATISTICA
53
RISULTATI
3.1
EFFETTO DELLA METH E DEL Δ9-THC SULLA TEMPERATURA CORPOREA,
SUL PESO E SULLA MORTALITA’
3.2
62
IL Δ9-THC RIDUCE L’INCREMENTO DELL’ESPRESSIONE DELLA GFAP E DEL
nNOS INDOTTO DALLA METH
3.4
nNOS
55
EFFETTO DELLA METH SULLA IMMUNOREATTIVITA’ DELLA GFAP E DEL
nNOS
3.3
55
64
EFFETTO DEL SR SULL’IR DELLA GFAP E SULL’ESPRESSIONE DEL
70
2
3.5
EFFETTO DEL POST-TRATTAMENTO CON Δ9-THC SULL’ESPRESSIONE
DELLA TH INDOTTA DALLA METH
3.6
IL Δ9-THC RIDUCE L’AUMENTATA ESPRESSIONE DI IBA-1 INDOTTA
DALLA METH
3.7
4
81
ESPRESSIONE DELLA NEUROTROFINA BDNF NEI RATTI TRATTATI CON
METH E POST-TRATTATI CON Δ9-THC
3.8
77
85
ESPRESSIONE DEL RECETTORE CB2 NEI RATTI TRATTATI CON METH E
POST-TRATTATI CON Δ9-THC
87
DISCUSSIONE
89
BIBLIOGRAFIA
100
3
1
INTRODUZIONE
La N-metil-O-fenil-isopropilamina o Metanfetamina (METH) (Fig.1) è una
molecola cationica lipofilica con una potente azione psicostimolante e con effetti
neurotossici [Maxwell JC and Brecht ML, 2011]. Fu sintetizzata per la prima volta nel
1893 e venne immessa in commercio per il trattamento di numerosi disordini, come
il deficit dell’attenzione, l’iperattività, la narcolessia, l’asma e l’obesità *Marshall JF
and O’Dell SJ, 2012+. Tuttavia negli anni ‘50, a causa degli effetti avversi e
neurotossici che induce, il suo utilizzo nel trattamento di questi deficit è stato
soppiantato da altri farmaci più sicuri. Da quel momento il commercio illegale di
METH è cresciuto notevolmente, e a causa delle sue proprietà euforiche, della sua
larga diffusione e del basso costo, la METH è diventata la droga più popolare tra le
amphetamine-type stimulant (ATS) [UNODC 2013].
Questa enorme diffusione della METH è dovuta soprattutto alla semplicità
della sua sintesi chimica. Infatti essa viene sintetizzata illegalmente a partire dal
fenilacetone, o fenil-2-propanone chiamato anche P2P, e N-metil-formammide, due
sostanze organiche facilmente reperibili, che quando reagiscono tra loro portano
alla formazione della miscela racemica della METH (Fig.2A) [Maxwell JC and Brecht
ML, 2011]. La METH presenta un centro chirale a livello del Carbonio 1 e sebbene
entrambi gli isomeri d e l, siano attivi, la forma isomerica d viene associata a effetti
4
fisiologici e comportamentali più potenti ed effetti stimolatori più intensi. La l-METH
invece, produce effetti psicomotori di più breve durata, ma una dose massiccia di
questo isomero è comunque capace di produrre un’intossicazione paragonabile a
quella della d-METH [Mendelson J, et al. 2006]. Infine, anche la miscela racemica dei
due isomeri è capace di indurre effetti di euforia e gratificazione simili a quelli
dell’isomero più attivo.
Nel corso degli anni ’80 negli Stati Uniti ci fu un aggiornamento degli elenchi
delle sostanze la cui sintesi illegale era maggiormente diffusa, e pertanto la P2P
venne “schedata” come sostanza per il commercio illegale di droghe d’abuso.
Questo non intimorì le gangs del commercio illegale che raggirarono il problema
imparando a sintetizzare la METH a partire dalla Pseudoefedrina, un’altra sostanza
facilmente reperibile e venduta nelle farmacie come decongestionante nasale. A
differenza della vecchia sintesi col P2P, questa non porta alla formazione di una
miscela racemica, ma solo all’isomero più attivo della METH, l’isomero d (Fig.2B).
Ancora oggi il mercato illegale di METH utilizza entrambi i metodi di sintesi della
droga, e nonostante intorno al 2005 ci sia stato un calo della richiesta di questa
potente droga stimolante, oggi il suo utilizzo è nuovamente in aumento in tutto il
mondo [Maxwell JC and Brecht ML, 2011].
5
Fig.1
CH3
N
H
METANFETAMINA
Figura 1. Struttura e forme nelle quali viene commercializzata la METH
La METH è una N-metil isopropil-amina, con un gruppo fenilico sul Carbonio 2. La
droga viene spesso commercializzata in cristalli sotto il nome di “ice” “crystal” o
“tina”; viene spesso venduta anche sotto forma di Sali di colore azzurro col nome di
“blue-meth”; infine è anche molto diffusa sotto forma di pastiglie colorate.
6
Fig.2
A.
O
H3C
O
+
N
H
H
N-metil-formammide
Fenil-acetone (P2P)
CH3
CH3
N
N
H
H
CH3
CH3
D-Metanfetamina
L-Metanfetamina
B.
CH3
OH
CH3
N
H
CH3
N
Li
H
NH3
CH3
Pseudoefedrina
CH3
N
H
CH3
D-Metanfetamina
Figura 2. Schema rappresentativo delle reazioni di sintesi della METH
A. Reazione di amminazione riduttiva tra il P2P o fenil-acetone e la N-metilformammide, con formazione di una miscela racemica contenente per il 50% DMETH e per il restante 50% L-METH. B. Riduzione di Birch della Pseudoefedrina che
in presenza di Litio (Li) e Ammoniaca (NH3) porta alla formazione solo dell’isomero D
della METH.
7
1.1
MECCANISMO D’AZIONE DELLA METH
La METH agisce come un “falso neurotrasmettitore” che viene trasportato nel
citoplasma del neurone dal trasportatore di membrana della Dopamina (DAT) e una
volta fatto il suo ingresso nella cellula neuronale, viene captato dal trasportatore
vescicolare delle monoammine VMAT2, causando una fuoriuscita di Dopamina (DA)
dalla vescicola al citoplasma. Questo aumento della concentrazione di
neurotrasmettitore, inverte la direzione del trasporto del DAT che, in condizioni
fisiologiche si occupa del re-uptake della DA, ma in questo caso provoca la
fuoriuscita di quest’ultima nello spazio extracellulare (Fig.3) *Itzhak Y and AchatMendes C, 2004].
8
Fig.3
Neurone DAergico
DA
VMAT2
METH
DA
DAT
DA
METH
Figura 3. Ingresso della METH nel neurone Dopaminergico (DAergico)
La METH grazie alla sua lipofilia e alla sua somiglianza strutturale con la DA, riesce a
entrare nel neurone sia per diffusione sia attraverso il DAT. Una volta dentro la
cellula neuronale, essa agisce sulla VMAT2 aumentando la concentrazione
intracellulare di DA. Questo permette di invertire il senso di trasporto del DAT, che
induce una fuoriuscita di neurotrasmettitore. La DA nello spazio sinaptico può a
questo punto, esplicare le sue azioni e attivare una serie di pathways a cascata.
9
Il meccanismo d’azione appena descritto è possibile solo grazie alla forte
somiglianza strutturale della METH con la DA, caratteristica che fa della METH un
substrato dei trasportatori delle monoammine, come il DAT il quale, permettendo
l’ingresso del falso neurotrasmettitore, induce un aumento delle concentrazioni di
monoamine, in particolare DA, nello spazio sinaptico.
Come conseguenza all’accumulo di monoammine nello spazio extracellulare,
si attivano una serie di circuiti cerebrali i cui effetti sono cruciali nel danno dei
terminali monoaminergici prodotto dalla METH. Tra questi, il circuito di maggior
rilevanza nella tossicità da METH è quello che collega i gangli della base con talamo
e corteccia, e che induce come effetto finale il rilascio di Glutammato (GLU) dalle
fibre corticali e un conseguente effetto di eccitotossicità [Marshall JF and O’Dell SJ,
2012]. Una volta entrata nei neuroni monoaminergici, la METH scatena una varietà
di effetti che nel loro insieme sono la causa della neurotossicità di questa droga
d’abuso.
Questi effetti, schematizzati in Fig. 4, possono essere sintetizzati in 4 punti
principali:
10
1) Aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto
(RNS)
La METH è capace di indurre un aumento di DA nel citoplasma neuronale. Tale
aumento è causato dalla sua azione sui trasportatori delle vescicole sinaptiche
(VMAT) che sono attivate dalla METH permettendo la fuoriuscita di DA nel
citoplasma neuronale. La DA in eccesso nel citoplasma neuronale può essere
trasformata enzimaticamente producendo l’acido 3,4-diidrossifenil-acetico (DOPAC)
e il perossido di idrogeno (Fig.4-a); oppure, la DA in eccesso, può anche autoossidarsi in semi-chinoni e chinoni della DA portando alla contemporanea
formazione dell’anione superossido e quindi all’accumulo di ROS (Fig.4-b) [Berman
SB, et al. 1996+. L’eccessiva produzione di ROS da parte della METH, può sovrastare
la capacità dei sistemi antiossidanti endogeni, causando danno ai lipidi, alle proteine
e agli acidi nucleici cellulari [Kuhn DM, et al. 2006].
E’ stato dimostrato, infatti, che gli effetti neurotossici delle anfetamine, possono
essere attenuati con la somministrazione di sostanze antiossidanti o attraverso una
over-espressione degli enzimi antiossidanti capaci di neutralizzare l’accumulo di ROS
e quindi di impedire il danno cellulare [Yamamoto BK, et al. 2010]. Per esempio,
Fukami e collaboratori hanno dimostrato che nei ratti trattati con METH, il pretrattamento con N-Acetil-L-Cisteina induce protezione contro la deplezione dei
11
terminali monoaminergici indotta dalle droghe psicostimolanti [Fukami G, et al.
2004].
Inoltre, è stato anche dimostrato che, il trattamento con METH nei topi transgenici
che over-esprimono la Rame-Zinco Super Ossido Dismutasi (CuZnSOD), enzima
citoplasmatico che catalizza la reazione di dismutazione dei radicali superossidi,
sono protetti dalla neurotossicità indotta dalla METH [Cadet JL, et al. 1994; Hirata H,
et al. 1996]
La METH inoltre, stimola il circuito neuronale gangli della base-talamocorteccia, inducendo il rilascio di GLU il cui accumulo extracellulare causa il danno da
eccitotossicità (Fig.4-c): il GLU attiva i recettori N-methyl-D-aspartate (NMDA)
causando un flusso intracellulare di Ca2+, il quale a sua volta attiva delle pathways
enzimatiche che aumentano la produzione di ROS e di RNS. Ad esempio, l’aumento
intracellulare di Ca2+ può attivare l’enzima neuronale Ossido Nitrico Sintasi (nNOS)
aumentando i livelli di ossido nitrico (NO), il quale può direttamente danneggiare la
cellula, oppure reagire con l’anione superossido, dando origine al perossinitrito e
causando pertanto l’accumulo di RNS (Fig.4-d) [Radi R, et al.1991]. La generazione di
RNS è altamente tossica in quanto attiva la via apoptotica che si conclude con il
malfunzionamento dei mitocondri, del reticolo endoplasmatico (RE), e col danno al
DNA [Uehara T 2007]. Il coinvolgimento di questo enzima neuronale nella
neurotossicità indotta dalla METH, è stato rivelato dal gruppo di ricerca di Itzhak nel
12
1996. Questo gruppo ha dimostrato che il pretrattamento con il 7-NitroIndazolo (7NI), un inibitore del nNOS, di topi sottoposti a un regime neurotossico di METH,
fornisce una piena protezione contro la deplezione di DA e dei suoi metaboliti
(DOPAC e acido omovanillico) riportando i livelli di questi ai valori basali [Itzhak Y
and Ali SF 1996].
2) Danni metabolici al mitocondrio
La METH e la DA accumulati nel citosol cellulare sono in grado di inibire i
complessi della catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio. In questo modo
gli elettroni ad alta energia lasciano prematuramente la catena di trasporto
causando la riduzione di ossigeno incompleta, inducendo quindi la formazione
dell’anione superossido senza permettere la formazione dell’ATP necessario alla
cellula stessa per il riparo dal danno da METH (Fig.4-e) [Brown JM, et al. 2005].
3) Induzione di risposte infiammatorie
Nel sistema nervoso centrale (SNC) la microglia svolge un ruolo similmacrofagico, pertanto si occupa della risposta iniziale al danno cerebrale e svolge la
funzione di antigen presenting cell. Allo stato fisiologico le cellule microgliali
13
presentano una morfologia altamente ramificata, per meglio monitorare l’ambiente
neuronale; in risposta a un’infiammazione o in caso di danno cerebrale, la cellule
microgliali si ingrossano, migrano nella sede del danno e fagocitano le cellule morte
e/o morenti [Krasnova IN and Cadet JL, 2009+. L’aumento di GLU extracellulare e
l’accumulo di chinoni e semi-chinoni della DA, indotti dalla METH, sono tra i fattori
che possono attivare le cellule microgliali. Tuttavia, mentre l’attivazione della
microglia è essenziale per la risposta immunitaria in loco, la loro over-attivazione
può scatenare il rilascio di fattori di danno cellulare e quindi indurre a loro volta
effetti neurotossici (Fig.4-f). Infatti è stato dimostrato che la microglia over-attivata
rilascia: citochine, ROS, RNS e prostaglandine, tutti fattori che causando danno
neuronale, possono essere coinvolti nella neurodegenerazione [Perry VH, et al.
2007; Block ML, et al. 2007]. Infatti la microglia sembra avere un ruolo importante in
diversi disordini neurodegenerativi, come il Parkinson [Kim YS and Joh TH, 2006]
l’Alzheimer *Xiang Z, et al. 2006]e l’Huntington *Sapp E, et al. 2001+. Pertanto l’overattivazione della microglia sembra essere uno degli eventi precoci nella cascata della
neurotossicità indotta dalla METH [Krasnova IN and Cadet JL, 2009+. E’ stato
dimostrato che la METH induce nello striato di ratti Sprague Dowley (SD) una
robusta attivazione della microglia evidente soprattutto due giorni dopo il
trattamento [LaVoie MJ, et al. 2004].
14
Anche gli astrociti giocano un ruolo fondamentale nell’infiammazione indotta
dalla METH. Essi regolano le concentrazioni extracellulari di GLU attraverso l’uptake
del neurotrasmettitore e quando vengono attivati attraverso l’aumento di Ca2+
intracellulare, sono anche in grado di rilasciare GLU. In condizioni fisiologiche
inoltre, gli astrociti sopprimono l’attivazione della microglia rilasciando citochine
antinfiammatorie (trophic growth factor-β o TGF-β e interleuchina-10 o IL-10) e
fattori neurotrofici. Gli astrociti però, in determinate condizioni di stress cellulare,
possono rilasciare sostanze coinvolte nello sviluppo dell’infiammazione del SNC
come tumor necrosis factor-α (TNF-α) e interleuchina 1-β (IL-1 β) [Yamamoto BK, et
al. 2010]. Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato il ruolo preminente
dell’attivazione astrocitaria nella neurotossicità indotta dalla METH. Per esempio, è
stato dimostrato da diversi gruppi di ricerca, che la METH nello striato di topo e di
ratto induce un aumento dell’espressione del marker astrocitario glial fibrillar acidic
protein (GFAP) indice di gliosi e associata a fenomeni infiammatori [Thomas DM, et
al. 2004; Pu C and Vorhees CV, 1993]. Inoltre è stato dimostrato mediante un’analisi
“temporale” dell’astrogliosi che il picco dell’attivazione astrocitaria, nei topi trattati
con METH, si aveva due giorni dopo la somministrazione della droga e che
l’astrogliosi si manteneva per almeno sette giorni dopo il trattamento [O’Callaghan
JP and Miller DB, 1994+. Pertanto si può affermare che l’attivazione astrocitaria è un
15
evento che si scatena rapidamente in seguito alla somministrazione di METH e che
perdura nel tempo [LaVoie MJ, et al. 2004].
4) Collasso della Barriera Emato-encefalica (BEE)
Il collasso della BEE indotto dalla METH avviene in seguito alla produzione di
ROS, all’ipertermia, e attraverso un meccanismo che coinvolge le metalloproteinasi
MMP-2 e MMP-9. Queste, una volta attivate dalla METH, alterano l’integrità delle
giunzioni tra le cellule endoteliali vascolari della BEE e digeriscono i componenti
della matrice extracellulare che compone la lamina basale della barriera. Il collasso
di quest’ultima, permette quindi l’ingresso di ioni e proteine nel cervello, che
richiamano osmoticamente H2O causando edema cerebrale (Fig.4-g) [Cadet JL and
Krasnova IN, 2009].
16
Fig.4
Terminale DAergico
proteine
e
Terminale
GLUergico
GLU
DOPAC
c
H2O2
Ca2+
GLU
GLU
NO
d
+
.O-
a
DA
b
2
Chinoni
.ONOOf
g
acqua
e-
O2
Ca2+
ioni
ATP
mitocondrio
ROS
ROS
Cellula
microgliale
Chinoni
DA
neurone post-sinaptico
Figura 4. Meccanismo di neurotossicità della METH
La DA che si accumula nel neurone viene degradata enzimaticamente, producendo
specie reattive dell’ossigeno (ROS) come il perossido di idrogeno (H2O2) (a)e lo ione
superossido (O2-) (b). La METH è anche capace di stimolare le terminazioni corticali
glutammatergiche, inducendo il rilascio di GLU (c) che attiva i recettori NMDAr
presenti sul terminale DAergico cousando un aumento intracellulare di Ca2+.
L’accumulo di quest’ultimo stimola l’enzima nNOS e la produzione di NO, il quale
reagisce con lo ione superossido portando alla formazione di RNS come perossinitriti
(d). La DA accumulata nel neurone scatena il danno al mitocondrio inducendo a sua
volta la formazione di ROS (e). La METH è in grado di stimolare anche le cellule
microgliali (f) causando un ulteriore accumulo di GLU a livello extracellulare. Infine la
METH causa il danno alla BEE, permettendo a proteine, ioni e H2O di fare il loro
ingresso nel cervello, causando edema cerebrale (g).
17
5) Ipertermia
L’ipertermia è l’evento tossico a breve termine più evidente nei modelli
animali trattati con METH. Nei ratti la temperatura corporea può superare i 40°C
dopo ciascuna singola somministrazione, e ciò può scatenare la morte dell’animale.
Per questo motivo i ricercatori, oggi, tentano di controllare le temperature corporee
degli animali durante l’esperimento mediante bagni di ghiaccio o utilizzando camere
fredde, con lo scopo di diminuire l’effetto ipertermico della droga e quindi diminuire
la mortalità [Davidson C, et al. 2001].
18
1.2
EFFETTI DELLA METH: DATI CLINICI
L’uso di METH negli ultimi trent’anni è aumentato considerevolmente in tutto
il mondo, e con esso sono aumentati anche i casi di emergenze dovuti
all’intossicazione acuta di questa droga d’abuso. Infatti i casi di morte per l’uso di
METH, tra gli anni ’80 e ’90 sono stati il doppio rispetto a quelli per l’utilizzo di
cocaina [Cadet JL, et al. 2003].
La METH sia che sia ingerita, sniffata o somministrata per via intravenosa,
riesce ad attraversare la barriera emato-encefalica (BEE) e ad entrare nei terminali
monoaminergici, inducendo il rilascio dei neurotrasmettitori (Dopamina, DA e
Serotonina, 5HT). Quando la METH è assunta in maniera acuta induce un senso di
euforia,
aumento
dello
stato
di
vigilanza,
iperattività,
e
modificazioni
cardiovascolari; effetti comuni a tutte le droghe psicostimolanti [Marshall JF and
O’Dell SJ, 2012]. Questi effetti possono persistere per numerose ore dopo
l’assunzione, a causa della lunga emivita della METH, che ha un range di 10-12 ore
[Schepers RJ, et al. 2003]. Tuttavia, quando la METH viene assunta ripetutamente
(binge di METH) o a dosi elevate, nell’uomo è associata a numerosi effetti avversi
come, agitazione, ansia, allucinazioni, delirio, psicosi, deficit cognitivi e psicomotori,
assenze e anche morte. I pazienti che abusano di METH e che sono soccorsi negli
ospedali, spesso si trovano in uno stato di incoscienza dovuto sia all’effetto diretto
19
della droga quando viene assunta per via intravenosa, sia alle assenze indotte da
questa famiglia di droghe d’abuso ATS *Cadet JL, et al. 2003+. L’assunzione di dosi
massicce di questa droga può causare effetti ancora più drammatici, come
insufficienza epatica e renale, aritmie cardiache e attacchi di cuore, emorragie
cerebrovascolari, infarti e ipertermia.
L’uso cronico di METH inoltre, contribuisce a indurre una personalità ansiosa,
depressa e aggressiva, all’isolamento sociale e all’evidenziarsi di psicosi e disfunzioni
psicomotorie. Diversi studi neuropsicologici hanno dimostrato l’instaurarsi di deficit
dell’attenzione, disturbi della memoria e delle capacità decisionali, nei soggetti che
abusano della droga [Krasnova IN and Cadet JL, 2009; Gonzalez R et al, 2004]. Infine
l’astinenza da METH può produrre anedonia, irritabilità, fatica e l’irrefrenabile
desiderio della droga stessa.
Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato che questi effetti negativi
neuropsichici indotti dall’abuso di METH sono dovuti, almeno in parte, alle
modificazioni neuropatologiche del SNC che la droga induce. Studi di immagine del
SNC hanno dimostrato infatti che, nei soggetti che fanno uso di METH, vi sono delle
modificazioni cerebrali che sono patognomoniche della neurodegenerazione [Chang
L et al, 2007]. Per esempio, studi che utilizzano la positron emission tomography
(PET) documentano gli effetti neurodegenerativi della droga, evidenziando una
20
diminuzione sostanziale del trasportatore della DA, il DAT, negli utilizzatori di METH
anche dopo un periodo di astinenza di circa 1-3 anni [Cadet JL, et al. 2003].
Studi più recenti hanno dimostrato anche una forte attivazione della microglia
in diverse aree cerebrali degli utilizzatori di METH. Nei soggetti in fase di astinenza
prolungata questa prominente attivazione è però diminuita. [Sekine Y, et al. 2008].
Inoltre, analisi post-mortem hanno evidenziato una diminuzione della DA, della
Tirosina idrossilasi (TH) e dei livelli del DAT nel caudato putamen e nel nucleo
accumbens dei soggetti che hanno fatto un uso cronico di METH [Kitamura O, et al.
2007; Moszczynska A, et al. 2004; Wilson JM, et al. 1996]. Infine, nella stessa
tipologia di soggetti, sono stati trovati aumentati i livelli dei marker di attivazione
gliale e i livelli dei composti antiossidanti come la CuZn-Superossidodismutasi (CuZnSOD), il glutatione e l’acido urico *Krasnova IN and Cadet JL, 2009].
L’utilizzo compulsivo di METH da parte dei soggetti che ne fanno uso, prevede
numerose somministrazioni di dosi elevate (0.3-1.0 g) della droga ad intervalli di
tempo molto ravvicinati (di circa 2 ore). Questo tipo di assunzione permette di avere
sempre elevati livelli plasmatici della droga e di non arrivare mai al cosidetto steadystate plasmatico. In questo modo però, il soggetto che fa uso di METH può
sviluppare una tolleranza agli effetti letali della droga, la quale nei casi più estremi,
può arrivare ad essere pari a 5 o 6 volte la LD50 (lethal dose 50) di un soggetto naive.
Questo effetto di tolleranza è spesso la causa dell’overdose di METH con
21
conseguente morte del soggetto, che viene preceduta da una forte ipertermia,
attacchi epilettici, ipossia e crisi ipertensive.
22
1.3
METH: MODELLI ANIMALI
Il modello animale che riflette le condizioni di accumulo e overdose di METH
nell’uomo, è chiamato acute toxic dosing (ATD) model e prevede 4 somministrazioni
sotto cute (s.c.) di METH alla dose di 10mg/Kg ogni 2 ore [Davidson C, et al. 2001]
(binge di METH). Questo modello di somministrazione è il più utilizzato nei ratti ed è
in grado di indurre la degenerazione dei terminali DAergici e 5HTergici, la perdita di
TH, DAT e triptofano idrossilasi (5HT-H), tutti segni di neurodegenerazione. [Itzhak Y
and Achat-Mendes C, 2004; Cadet JL, et al. 2003; Axt KJ and Molliver ME, 1991]. Gli
effetti indotti da questo regime neurotossico sono effetti a lungo termine che
persistono per circa 8 mesi, quando si evidenziano segni di recupero sui terminali
monoaminergici [Davidson C, et al. 2001+. E’ stato inoltre dimostrato che il binge di
METH induce perdita dei neuroni DAergici che vanno incontro a morte cellulare
apoptotica [Cadet JL, et al. 2003; Deng X and Cadet JL, 2000].
Esistono anche i modelli animali di abuso cronico di METH; questi modelli
prevedono l’utilizzo, nel ratto, di piccole pompe osmotiche che somministrano
infusioni continue di METH alla dose di 16-20 mg/Kg/day [Davidson C, et al. 2001].
Tuttavia, più di recente è stata introdotta la self-administration di METH, che mima
la somministrazione cronica di dosi sempre più elevate da parte degli utilizzatori
abituali della droga [Marshall JF and O’Dell SJ, 2012].
23
Come riportato precedentemente, i soggetti che abusano di METH mostrano
numerosi deficit cognitivi, che includono la compromissione della memoria, disturbi
dell’attenzione e incapacità decisionale. L’interpretazione dei test cognitivi
sull’uomo però, è molto complessa in quanto può essere influenzata non solo
dall’utilizzo della droga, ma anche dalla storia e dal tipo di educazione di ciascun
soggetto. Pertanto i modelli animali rappresentano un approccio ideale per lo studio
degli effetti cognitivi della METH, in quanto negli animali è possibile elimimare
influenze o variabili di altro tipo.
L’esposizione dei ratti ad un binge di METH, che produce un danno ai sistemi
DAergico e 5HTergico, induce anche un deficit della memoria che può essere
valutato tramite diversi test incluso il novel object recognition (NOR) memory. Tale
test valuta la capacità di riconoscere un nuovo oggetto, abilità che dipende
dall’integrità della corteccia peririnale. Per testare questo tipo di memoria, gli
animali sono sottoposti a un test che valuta la capacità dei ratti di ricordare
l’identità degli oggetti posti in posizioni fisse in un’arena. Inizialmente vi è la fase di
presentazione e familiarizzazione degli oggetti, seguita dalla fase di test, che
prevede la sostituzione di uno degli oggetti con uno nuovo. Gli animali di controllo
trattati con il veicolo, spendono la maggior parte del tempo a esplorare il nuovo
oggetto, mentre gli animali trattati con METH esplorano in maniera indistinta sia
l’oggetto familiare sia il nuovo oggetto [Belcher AM, et al. 2005].
24
La METH induce anche un deficit dell’apprendimento motorio, in particolare
del response learning, che dipende dall’integrità delle terminazioni nervose
DAergiche striatali, e del place learning, che viene controllata dall’ippocampo.
Questi due tipi di memoria sono analizzati mediante il test del radial arm maze e il
test del Cincinnati water maze, rispettivamente. Entrambi i test utilizzano dei
labirinti e analizzano la memoria mediante l’uso di riferimenti; il primo test utilizza
un punto di riferimento interno al labirinto per testare la response learning; mentre
il secondo utilizza un punto di riferimento esterno al labirinto, che in questo caso si
trova in acqua, per testare la place learning. In entrambi i casi i ratti esposti a un
binge di METH, mostrano un basso apprendimento dei punti di riferimento a cui
vengono esposti, rispetto ai ratti di controllo naive [Marshall JF and O’Dell SJ, 2012].
25
1.4
RECUPERO DEL DANNO INDOTTO DALLA METH
E’ stato dimostrato che un periodo di astinenza dalla METH che va dai 6 ai 12
mesi nel ratto, induce un ripristino dei terminali DAergici e 5HTergici [Cass WA and
Manning MW, 1999; Cass WA, 2000a+. Inoltre, vi sono degli studi sull’uomo che
dimostrano che i livelli striatali del DAT misurati tramite PET, sono aumentati di circa
il 20% nei soggetti che non fanno uso di METH da 12-17 mesi, rispetto ai soggetti
che ancora ne fanno uso [Volkow ND, et al. 2001].
Questo recupero del danno ai terminali monoaminergici può essere in parte
spiegato dalla up-regolazione dei fattori neurotrofici indotta dalla METH. E’ possibile
infatti che i cambiamenti nell’espressione di questi fattori, indotti dalla METH, siano
responsabili almeno in parte, del recupero spontaneo e tardivo di alcuni markers
della DA, sia negli animali che nell’uomo *Cadet JL, et al. 2003; Volkow ND, et al.
2001]. Tuttavia, il recupero spontaneo del danno DAergico e 5HTergico indotto dalla
METH, avviene in un periodo molto lungo che va da alcuni mesi, fino a anni;
pertanto è interessante studiare nuovi approcci che possano accelerare questo
recupero.
Ad esempio è stato dimostrato che i fattori neurotrofici quali BDNF (brain
derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), GDNF (glial cell line-derived
neurotrophic factor), EGF (epidermal growth factor), e FGF (fibroblast growth factor)
26
esercitano effetti trofici e protettivi in diversi modelli di neurodegenerazione sia in
vitro che in vivo [Cadet JL, et al 2003]. In particolare Cass e collaboratori [Cass WA,
1996; Cass WA, et al. 2000b] hanno dimostrato che la somministrazione di GDNF un
giorno prima del trattamento con METH è capace di prevenire le diminuzioni di DA
nello striato dei ratti; e inoltre la somministrazione di GDNF in ratti pretrattati con
un binge di METH, ristabilisce il contenuto striatale di DA.
27
1.5
COABUSO DI METH CON ALTRE DROGHE
Come descritto in precedenza, numerosi studi preclinici e clinici dimostrano
che la METH può avere effetti neurotossici e neurodegenerativi, e osservazioni
cliniche associano l’abuso di METH con numerosi deficit neurocognitivi.
L’interpretazione di questi dati clinici tuttavia, è alterata in quanto la METH
raramente viene utilizzata da sola, ma spesso vi è l’abuso contemporaneo e
sequenziale di altre sostanze psicoattive [Gonzalez R, et al. 2004]. Tossmann e
collaboratori nel 2001 hanno condotto uno studio in sette capitali Europee su 3500
soggetti, abituali frequentatori dei “techno parties”, che ha rivelato un uso
sostanziale di più droghe d’abuso durante questo tipo di feste. Le diverse sostanze
maggiormente co-abusate da questi soggetti, sono la METH e altri derivati
anfetaminici (come la metilen-diossi-metanfetamina o MDMA), cocaina e cannabis
[Tossmann P, et al. 2001]. Quest’ultima è la droga più comunemente coabusata
dagli utilizzatori di METH. Uno studio condotto da Gonzalez e collaboratori nel 2004
sulla base di dati estrapolati dai self-report, evidenzia che i partecipanti del loro
centro di ricerche sono abituali consumatori di METH e marijuana [Gonzalez R, et al.
2004].
28
Tuttavia, ancora non è noto quale sia il reale vantaggio dei soggetti che fanno
uso contemporaneo delle due droghe d’abuso: i) potenziare gli effetti stimolatori ed
euforici della METH, oppure ii) attenuare gli effetti avversi della METH.
29
1.6
CANNABINOIDI
I cannabinoidi sono i componenti attivi della cannabis sativa (marijuana); tra
questi il composto con maggiore attività è il Δ9-tetraidrocannabinolo (Δ9-THC), un
terpene fenolico che è stato isolato come sostanza pura solo nel 1964 [Gaoni Y and
Mechoulam R, 1964+. Tuttavia il meccanismo d’azione di questa sostanza
psicoattiva è stato scoperto solo alla fine degli anni ’80 e inizio anni ’90 grazie alla
caratterizzazione di due recettori [Devane WA, e al. 1988; Munro S, et al. 1993],
oggi chiamati CB1 e CB2, e dei due agonisti endogeni (endocannabinoidi):
l’anandamide (AEA) *Devane WA, et al. 1992] e il 2-arachidonil glicerolo (2-AG)
[Mechoulam R, et al. 1995] (Fig.5).
30
Fig.5
OH
O
Δ9-THC
O
O
H
OH
OH
N
AEA
O
OH
2-AG
Figura 5. Strutture chimiche del Δ9-THC, dell’AEA e del 2-AG
31
Con la scoperta dei due recettori, il termine cannabinoidi ha assunto una
definizione più generale che racchiude tutte quelle sostanze capaci di interagire con
i recettori CB1 e/o CB2; mentre tutti i ligandi endogeni di questi ultimi, raggruppati
sotto il nome di endocannabinoidi, fanno parte del sistema endocannabinoide (EC).
Il sistema EC, identificato e caratterizzato come il circuito neuronale attraverso il
quale il Δ9-THC interagisce per esplicare i suoi effetti fisiologici e psicotropi, è
composto
da
ligandi
endogeni
dei
recettori
cannabinoidi
denominati
endocannabinoidi, dai recettori cannabinoidergici (CB), dalle proteine e dagli enzimi
che regolano la sintesi e la degradazione degli endocannabinoidi.
Gli endocannabinoidi sono coinvolti in numerosi processi fisiologici, come la
termoregolazione, il consumo di cibo, le funzioni immunitarie, le percezioni, le
funzioni cognitive e le funzioni motorie. Inoltre il sistema endocannabinoide viene
considerato come facente parte di un network protettivo, in quanto lavora in stretta
“collaborazione” col sistema immunitario, e pertanto viene implicato in un largo
numero di condizioni patologiche [Pope C, et al. 2010]. Nel SNC, gli
endocannabinoidi agiscono come neuromodulatori ed esplicano le loro funzioni
grazie alla presenza dei due recettori per i cannabinoidi, CB1 e CB2. Questi sono
entrambi dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) ma hanno una diversa
distribuzione nel SNC; il primo è molto più abbondante e ha una localizzazione
neuronale, mentre il secondo è prevalentemente situato nelle cellule microgliali
32
[Fowler CJ, et al. 2010+. Inoltre l’AEA non si lega solo al CB1 e al CB2, ma è capace
anche di stimolare i recettori vanilloidi, TRPV1 [Grotenhermen F, 2006].
Gli endocannabinoidi non vengono sintetizzati e immagazzinati nelle vescicole
sinaptiche neuronali, come avviene per i neurotrasmettitori, ma essi vengono
sintetizzati on-demand a partire dal N-arachidonil-fosfatidilietanolamina (NArPE),
precursore biosintetico dell’AEA, e dal diacilglicerolo (DAG) e acido arachidonico da
cui viene invece sintetizzato il 2-AG. Una volta sintetizzati, gli endocannabinoidi
vengono rilasciati dalle cellule nello spazio sinaptico dove esplicano le loro azioni
legandosi ai recettori, quindi vengono inattivati rapidamente tramite re-uptake
neuronale e successiva idrolisi enzimatica. Gli enzimi maggiormente responsabili
della reazione di degradazione sono la fatty acid amide hydrolase (FAAH) e la
monoacylglycerol lipase (MAGL); la prima si occupa della reazione di idrolisi amidica
dell’AEA, la seconda invece si occupa dell’idrolisi esterea del 2-AG [De Petrocellis L
and Di Marzo V, 2009]. I cannabinoidi, che siano endogeni o esogeni, interagiscono
con i recettori CB1 e CB2.
Il
recettore
CB1
ha
una
localizzazione
presinaptica
pertanto
gli
endocannabinoidi hanno un ruolo molto importante nella regolazione della
trasmissione sinaptica. Essi sono coinvolti nella cosidetta depolarization-induced
suppression of inhibition (DSI) e nella depolarization-induced suppression of
33
excitation (DSE); cioè l’attivazione del recettore presinaptico CB1 accoppiato alla
proteina Gi/o induce l’inibizione dell’apertura dei canali al Ca2+ impedendo l’ingresso
dello ione nella cellula neuronale e inibendo il rilascio del neurotrasmettitore (NT)
dalle vescicole sinaptiche. In questo modo i cannabinoidi bloccano la risposta
inibitoria o eccitatoria del neurone in cui si trova il recettore CB1 che hanno attivato.
Oltre a questa via di trasduzione del segnale, la stimolazione del recettore CB1 attiva
numerose altre pathways, tra cui quella della proteina chinasi A (PKA). L’attivazione
del recettore CB1 accoppiato alla proteina Gi/o , induce l’inibizione dell’adenilato
ciclasi (AC) che porta ad una riduzione del AMP ciclico (cAMP), che stimola la PKA. La
ridotta attività della PKA , può causare diversi effetti, ad esempio nei neuroni
ippocampali quest’azione del CB1 attenua gli effetti eccitotossici mediati
dall’attivazione dei recettori NMDA *Howlett AC, et al. 2010+. L’attivazione dei
recettori CB1 mediata dai cannabinoidi, attiva anche le proteine chinasi MAPK
(mitogen-activated protein kinase) inducendo le ERK 1/2 (extracellular-signal
regulated kinases) che stimolano , a seconda della cellula in cui si trovano, diversi
fattori di trascrizione.
Anche il recettore CB2 è capace di attivare le proteine Gi/o inducendo le
risposte intracellulari cellule-specifiche, appena descritte [Howlett AC, 2002].
34
Inoltre il CB1 può attivare altri pathways mediati da diversi secondi
messaggeri, attraverso l’attivazione di proteine G di tipo q. Queste includono la via
della fosfolipasi C/inositolo-trifosfato/Ca2+ intracellulare, la via del fosfatidilinositolo3-chinasi (PI3K)/Akt, e la via delle chinasi Jun N-termiali (JNK) 1 e 2 [Howlett AC,
2002].
Infine è importante ricordare l’esistenza di due proteine specifiche che
interagiscono con i recettori per i cannabinoidi, chiamate CRIP1a e CRIP1b, che
hanno un ruolo importante nella regolazione del trafficking intracellulare, nella
desensitizzazione e nell’attività costitutiva del recettore CB1 *Howlett AC, et al.
2010].
35
1.7
CANNABINOIDI: NEUROINFIAMMAZIONE E PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE
Col termine neuroinfiammazione si esprime un concetto relativamente
recente che indica una risposta infiammatoria localizzata a livello cerebrale e che si
distingue dall’infiammazione localizzata a livello del sistema periferico. Nel caso
della neuroinfiammazione, le cellule che giocano il ruolo più importante sono le
cellule gliali, quali gli astrociti e le cellule microgliali, i linfociti, i monociti e i
macrofagi. Una delle maggiori conseguenze dell’attivazione delle cellule gliali
secondaria a un danno, è la sintesi e il rilascio di molecole citotossiche, come le
citochine, le chemochine, il glutammato, le interleuchine, la NO e i ROS. L’obiettivo
finale di questa risposta infiammatoria è quella di eliminare gli eventuali agenti
patogeni ed eventualmente riparare il tessuto nervoso danneggiato. Durante la
neuroinfiammazione insieme al rilascio di molecole citotossiche vengono rilasciate
dalle cellule gliali, anche molecole di altro tipo quali i fattori di crescita, al fine di
bilanciare l’omeostasi cerebrale *Fattore L, 2015]. Nelle malattie neurodegenerative
è spesso presente un forte stato di neuroinfiammazione che viene considerato uno
dei fattori eziologici della malattia [Minghetti L, 2005]. Anche durante il normale
invecchiamento si osserva l’attivazione delle cellule gliali, ma nelle condizioni
neurodegenerative associate all’età, tale attivazione è esacerbata. Infatti, è stato
dimostrato che l’uso di sostanze con proprietà antinfiammatorie aiuta ad arginare i
sintomi delle patologie neurodegenerative, e in particolare i cannabinoidi hanno
36
mostrato avere questo tipo di attività antinfiammatoria che induce effetti
neuroprotettivi in diversi tipi di paradigmi neurodegenerativi [Correa F, et al. 2005;
van der Stelt M and Di Marzo V, 2005].
L’azione antinfiammatoria dei cannabinoidi, come il THC, è mediata dalla
presenza dei recettori, CB1 e CB2, nelle cellule gliali in particolare negli astrociti e
nella microglia. Queste cellule esprimono entrambi i recettori per i cannabinoidi,
hanno sia gli enzimi di biosintesi che quelli di degradazione degli endocannabinoidi,
e sotto stimolazione hanno la capacità di rilasciare gli endocannabinoidi [Stella N,
2009; Stella N, 2010]. Uno studio condotto dal gruppo di ricerca di Baker nel 2000 ha
dimostrato che il trattamento con Δ9-THC o WIN 55212-2, due agonisti dei recettori
CB1 e CB2, nel topo diminuisce i sintomi di spasticità e tremori su un modello di
sclerosi multipla, patologia caratterizzata da infiammazione cronica nel SNC.
Quest’azione neuroprotettiva viene bloccata sia dal SR141716A che dal SR144528,
rispettivamente antagonisti del recettore CB1 e CB2 [Baker D, 2000].
Numerosi studi hanno infine, evidenziato gli effetti neuroprotettivi degli agonisti dei
recettori CB1 e CB2, in diversi modelli animali di neurodegenerazione [FernandezRuiz J, et al. 2010].
In un modello di Alzheimer, ratti dell’età di 23 mesi sono stati trattati per 21
giorni con l’agonista misto dei recettori CB1 e CB2, il WIN. Tale tipo di trattamento
37
riduce l’espressione della microglia attivata nell’ippocampo e diminuisce i livelli di
mRNA delle citochine pro-infiammatorie, come l’interleuchina-6 (IL-6). Inoltre sono
diminuiti anche i livelli delle proteine pro-infiammatorie tumor necrosis factor- α
(TNF-α) e interleuchina 1-β (IL-1 β) *Marchalant Y, et al. 2009].
Gli effetti neuroprotettivi dei cannabinoidi neturali e sintetici sono stati dimostrati
non solo in modelli animali neurodegenerativi come quelli di Parkinson [GarciaArenciba M, et al. 2009] e della malattia di Hantington [Valdeolivas S, et al. 2012],
ma anche in modelli animali di danno cerebrale come eccitotossicità da GLU, ipossia,
ischemia e stress ossidativo [Panikashvili D, et al. 2001; Marsicano G, et al. 2002].
38
1.8
SCOPO DEL LAVORO
Scopo del nostro studio è stato quello di valutare in un modello animale di
neurotossicità indotta da METH gli effetti neuroprotettivi del Δ9-THC. E’ stato
utilizzato un protocollo di trattamento di METH (binge di elevate dosi di METH) che,
come riportato in precedenti studi, è in grado di indurre neurotossicità [Krasnova,
2009]. In particolare, i ratti sottoposti al regime neurotossico di METH (4 iniezioni
sottocute (s.c.) alla dose di 10 mg/Kg, ad intervalli di 2h) sono stati pretrattati (PRE)
o post-trattati (POST) con Δ9-THC somministrato per via intraperitoneale (i.p.) alla
dose di 1 o 3 mg/Kg. Gli animali sono stati quindi sacrificati tramite perfusione o per
decapitazione tre giorni dopo l’ultima somministrazione di Δ9-THC.
L’azione neuroprotettiva del Δ9-THC è stata determinata valutando la
riduzione dell’astrogliosi mediante l’immunoreattività in immunoistochimica (IHC)
per la GFAP e l’espressione di nNOS, i quali sono aumentati nella neurotossicità
indotta dalla METH. Inoltre, allo scopo di determinare un possibile ruolo del
recettore CB1 nel trattamento con Δ9-THC, i ratti post-trattati con Δ9-THC alla dose
di 1mg/Kg sono stati pre-trattati per via i.p. con l’antagonista dei recettori CB1,
SR141716A (SR) alla dose di 1 mg/Kg.
Per evidenziare altri fattori coinvolti nel meccanismo neuroprotettivo del Δ9THC, nei ratti sottoposti al regime neurotossico con METH e post-trattati con Δ9-THC
39
(1 mg/Kg) sono stati valutati mediante western blot (WB) o IHC, altri marcatori di
neurotossicità e neuroinfiammazione quali la TH, il BDNF e l’IBA1.
Infine negli stessi animali è stata valutata, tramite WB, l’espressione dei
recettori CB2, responsabili della regolazione di alcuni di quei marcatori implicati
nella neuroinfiammazione e nella neurotossicità indotte dalla METH.
40
2
MATERIALI E METODI
2.1
ANIMALI
In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague Dowley maschi adulti
(Charles River, Como, Italy) del peso di circa 300-350 g , stabulati in gabbie
individuali alla temperatura di 22°C e con il 60% di umidità, con un ciclo luce/buio di
12 ore (luce dalle h: 7,00).
Tutte le procedure sperimentali descritte in tale studio sono state condotte in
accordo con la legge Italiana sulla ‘’Protezione degli animali usati per gli esperimenti
da laboratorio o per altri scopi scientifici’’. Lo stato di salute e benessere degli
animali è stato regolarmente monitorato dallo staff veterinario dello stabulario.
2.2
FARMACI E DISEGNO SPERIMENTALE
La (+) Metanfetamina Cloridrata (METH, Sigma-Aldrich, MO, USA) è stata
diluita (1mg/ml) in soluzione salina sterile e somministrata per via sottocutanea
(s.c.) ad un volume di 1ml/Kg.
Il Δ9-Tetraidrocannabinolo (Δ9-THC, RTI International, Research Triangle
Park,NC, USA) alla concentrazione iniziale di 50mg/ml in etanolo, e l’SR141716A (SR,
41
fornito gentilmente dalla Sanofy Synthelabo, Montpellier, France) sono stati diluiti in
Tween 80 (al 2%), etanolo (al 2%) e soluzione salina (al 96%), e somministrati per via
intraperitoneale (i.p.) ad un volume di 1ml/Kg.
I ratti sono stati divisi in maniera casuale in due differenti gruppi i quali hanno
ricevuto rispettivamente quattro iniezioni s.c. di METH alla dose di 10mg/Kg
(calcolata come base libera) o di soluzione salina (SAL) a intervalli di due ore. Il
trattamento e la dose di METH sono stati scelti sulla base di dati riportati in
letteratura che dimostrano che a queste dosi essa induce effetti neurotossici sui
sistemi DAergico e 5HTergico, e danni neuronali a lungo termine comparabili a quelli
trovati nei soggetti che abusano di questa sostanza [Krasnova IN and Cadet JL, 2009;
Marshall JF, O’Dell SJ 2012].
Come mostrato in figura 6, i ratti trattati con METH o con SAL, hanno ricevuto
anche iniezioni i.p. di Δ9-THC (alle dosi di 1 o 3 mg/Kg; Δ9-THC1, Δ9-THC3) o di
veicolo (VEH, al volume di 1ml/Kg) 30 minuti prima di ciascuna somministrazione di
METH o SAL (pre-trattamento, PRE; Fig 6A), o 0.5, 12, 24, 36 e 48 ore dopo l’ultima
iniezione di METH o SAL (post-trattamento, POST; Fig 6B).
I gruppi del post-trattamento con Δ9-THC1 o VEH, sono stati anche pre-trattati con
SR alla dose di 1mg/Kg per via i.p. o con VEH (1ml/Kg) 15 minuti prima di ciascuna
somministrazione di Δ9-THC o VEH (Fig 6C).
42
Fig.6
Pre-trattamento
IHC
Post-trattamento
IHC
SR + Post-trattamento
IHC
Figura 6. Schema riassuntivo del disegno sperimentale
A. Pre-trattamento: i ratti hanno ricevuto un’iniezione di Δ9-THC alla dose di 1mg/Kg
o di 3mg/Kg o di VEH, 30 minuti prima di ciascuna somministrazione di METH o SAL.
Tre giorni dopo l’ultima somministrazione di METH o di SAL, i ratti sono stati
sacrificati mediante perfusione transcardiaca e i cervelli utilizzati per le analisi di
immunoistochimica (IHC). B. Post-trattamento: 30 minuti e 12, 24, 36 e 48 ore dopo
l’ultima somministrazione di METH o SAL, i ratti hanno ricevuto un’iniezione di Δ9THC alla dose di 1mg/Kg o di 3mg/Kg o di VEH. Dopo tre giorni dall’ultima
somministrazione di METH o SAL, i ratti sono stati sacrificati tramite perfusione e i
cervelli degli animali sono stati quindi utilizzati per le analisi di IHC. C. Trattamento
con SR: gli animali che hanno ricevuto il post-trattamento con THC alla dose di
1mg/Kg, sono stati pre-trattati con l’SR alla dose di 1mg/Kg o di VEH 15 minuti prima
di ciascuna iniezione di Δ9-THC o VEH. Tre giorni dopo l’ultima somministrazione di
METH o SAL, i ratti sono stati perfusi e i cervelli degli animali sono stati utilizzati per
le analisi di IHC.
43
Infine è stato effettuato un quarto trattamento (Fig.7) con il medesimo regime
neurotossico di METH, che prevede quattro iniezioni alla dose di 10mg/Kg, e il posttrattamento con la dose inferiore di Δ9-THC. Tre giorni dopo l’ultima
somministrazione di METH, metà dei ratti sono stati perfusi per gli studi di IHC,
mentre l’altra metà è stata sacrificata tramite decapitazione e i cervelli sono stati
processati per gli esperimenti in WB.
Fig.7
Post-trattamento
WB o IHC
Figura 7. Schema riassuntivo del secondo disegno sperimentale
I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.6B.
44
2.3
PESI E TEMPERATURE
Il peso e la temperatura rettale dei ratti sono stati misurati prima di iniziare il
trattamento al tempo T0, 1 ora dopo ciascuna somministrazione di METH o SAL e 30
minuti dopo ciascuna somministrazione di Δ9-THC o VEH.
Durante il trattamento con METH, quando la temperatura dei ratti ha raggiunto i
40°C, questi vengono sottoposti a doccia fredda o spostati in una gabbia con
ghiaccio, al fine di abbassare la temperatura corporea.
45
2.4
IMMUNOISTOCHIMICA
PREPARAZIONE DEL TESSUTO
Tre giorni dopo l’ultima somministrazione di METH, gli animali sono stati
anestetizzati con Cloralio Idrato alla dose di 400mg/Kg e sottoposti a perfusione
transcardiaca con Paraformaldeide al 4% (PF 4%) e Gluteraldeide allo 0.1% (Glu
0.1%) in tampone salino fosfato 0.1M (PBS, pH=7.4). Successivamente i cervelli sono
stati rimossi rapidamente, post-fissati nello stesso liquido fissativo per 6h e dopo
ripetuti lavaggi in PBS, sono stati crioprotetti in una soluzione di saccarosio al 30% in
PBS per 48h.
IMMUNOFLUORESCENZA
La reazione di immunoistochimica è stata effettuata in free-floating su sezioni di
cervello coronali dello spessore di 40μm, tagliate al criostato a livello delle due aree
cerebrali di interesse: corteccia prefrontale (PFC) e caudato putamen (CPu). Per
facilitare il riconoscimento delle aree cerebrali da raccogliere, alcune sezioni
adiacenti a quelle raccolte sono state colorate con Neutral Red e osservate al
microscopio ottico. Successivamente è stato effettuato un blocco delle sezioni che
prevede l’incubazione per 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione al 10% di
46
normal goat serum (NGS) e 1% di bovine serum albumin (BSA) in PBS con lo 0.2% di
Triton X-100 (PBS-T).
Le sezioni sono state poi incubate con gli anticorpi primari che sono stati diluiti in
una soluzione di PBS-T con l’1% di NGS e lo 0.1% di BSA. Gli anticorpi (Ab) utilizzati
sono i seguenti: Ab monoclonale di topo anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP;
marcatore astrocitario) (Millipore Temecula, CA, USA) diluito 1:5000 e incubato per
due notti a +4°C; Ab policlonale di coniglio anti-neuronal Nitric Oxide Synthase
(nNOS; marcatore dell’enzima neuronale nNOS) (Millipore Temecula, CA, USA)
diluito 1:3000 e incubato per due notti a +4°C; e Ab policlonale di coniglio antiionized calcium binding adapter molecule 1 (IBA1; marcatore della microglia) (Wako
Chemicals, USA) diluito 1:2000 e incubato per una notte a +4°C. Dopo
l’incubazione,vengono effettuati alcuni lavaggi in PBS-T e successivamente le sezioni
vengono incubate per 1 ora a temperatura ambiente con i rispettivi anticorpi
secondari: Alexa Fluor goat anti-mouse 594 IgG (1:500, Molecular Probes , Eugene,
OR, USA); Alexa Fluor goat anti-rabbit 488 IgG (1:500, Molecular Probes , Eugene,
OR, USA); Alexa Fluor goat anti-rabbit 594 IgG (1:500, Molecular Probes , Eugene,
OR, USA).
Infine le sezioni sono state lavate in PBS e montate su vetrino utilizzando il
VectaShield anti-fade mounting media(Vector Inc.).
47
Sono stati effettuati anche esperimenti di controllo paralleli omettendo
l’anticorpo primario; in questi non è stata riscontrata alcuna positività di marcatura.
ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI E ANALISI QUANTITATIVA
Per le osservazioni è stato utilizzato un microscopio Olympus IX 61 dotato di
obiettivi 2.5, 4, 10, 20 e 60x a immersione in olio.
Per l’acquisizione delle immagini è stata utilizzata una fotocamera Olympus
12-bit cooled F View II (Hamburg, Germany) e la luce di eccitazione è stata filtrata
con un filtro al 6% di trasmittanza.
Per ciascun animale l’analisi dell’immunoreattività per GFAP, nNOS e IBA1 è
stata effettuata su una sezione ogni 3 successive, per un totale di 8 sezioni
contenenti tutta l’estensione dell’area della corteccia cingolata 1 e 3 (Cg1 e Cg3), e
del Caudato Putamen (CPu). In accordo con l’atlante di Paxinos e Watson [Paxinos G
and Watson C, 1997], i livelli coronali selezionati per le aree interessate
corrispondono alle plates 6-8 per la Cg1 e Cg3 (AP: da +4.20 a +3.20) e alle plates 1129 per il CPu (AP: da +1.70 a -0.3).
Per l’analisi semi-quantitativa del marcatore per la GFAP, è stato utilizzato un
obiettivo 20x e sono state acquisite 3 immagini della regione di interesse (regions of
interest, ROI) non sovrapposte fra loro e di area pari a 140000 μm2, per ciascuna
48
sezione. Per quanto riguarda l’acquisizione, la profondità di fuoco è stata ottenuta
utilizzando il modulo z-stack (Olympus Soft Imaging Solution, GNHB, Munster,
Germany) e sommando le intensità massime di 8 immagini acquisite a step di fuoco
da 0.25 μm di profondità ciascuno, per un totale di 2 mm di spessore. Dopo la
cattura, le immagini sono state analizzate utilizzando il software Cell P AnalySIS che
ha permesso di applicare la densità soglia al singolo canale in scala di grigi per
individuare le fibre positive. Successivamente, è stata stimata per ciascuna
immagine la percentuale di area occupata da fibre positive; e per ciascun animale è
stata espressa la media delle immagini di tutte le sezioni analizzate ± SEM.
L’acquisizione delle immagini delle cellule immunoreattive per nNOS è stata
eseguita utilizzando un obiettivo 20x e catturando 3 immagini ROI non sovrapposte
per emisfero con area pari a 0.15 mm2 ciascuna. I limiti delle ROI sono stati definiti
basandosi su dettagli strutturali del tessuto e al fine di assicurare la non
sovrapposizione delle stesse ROI, la distanza tra le 6 immagini catturate per ogni
sezione, è stata fissata come pari a circa il doppio del diametro medio di un neurone
(20μm). Le 6 immagini per sezione così ottenute, sono state analizzate col software
Cell P AnalySIS che ha permesso di effettuare la conta. Le cellule nNOS positive che
toccavano i bordi superiore o destro della ROI, sono state escluse dalla conta. I
neuroni nNOS immunoreattivi (-IR) che sono stati contati in ciascuna immagine di
49
una sezione, sono stati sommati tra loro e infine le somme per ciascun animale sono
state espresse come media/mm2 ± SEM.
L’acquisizione delle immagini per la marcatura di IBA1 è stata effettuata,
come per nNOS, utilizzando un obiettivo 20x e catturando 3 ROI non sovrapposte
per emisfero, per un totale di 6 immagini per sezione. L’analisi delle cellule positive
per IBA1 è stata effettuata utilizzando il software Cell P AnalySIS mediante la conta
al tocco e le cellule IBA1-IR contate in ciascuna immagine di una sezione sono state
sommate e infine le somme per ciascun animale sono state espresse come
media/mm2 ± SEM.
50
2.5
WESTERN BLOT
PREPARAZIONE DEL TESSUTO
Tre giorni dopo l’ultima somministrazione di METH i ratti sono stati sacrificati
per decapitazione, i cervelli sono stati rapidamente rimossi, le aree cerebrali di
interesse (Corteccia e CPu) isolate e rapidamente congelate in azoto liquido, e infine
conservate a -80°C fino all’utilizzo. Il giorno della preparazione, i tessuti sono stati
scongelati in ghiaccio e in 5 volumi di tampone di lisi freddo (SDS al 2% e 1 pastiglia
di inibitori delle proteasi (CØmplete Protease Inhibitor tablet; Roche, Mannheim,
Germany)). I tessuti sono stati quindi omogenati grazie all’utilizzo di un polytron, per
15 secondi per due volte e incubati a +4°C sotto rotazione per 40’. Infine, gli
omogenati sono stati centrifugati a 8000xg per 30 minuti e i surnatanti recuperati.
La quantità di proteine è stata misurata con il metodo di Bradford utilizzando il kit
Bio-Rad DC protein assay (Bio-Rad, Milano, Italia).
Infine i campioni sono stati aliquotati e conservati a -80°C fino all’utilizzo.
IMMUNOBLOTTING
Il giorno della corsa elettroforetica i campioni sono stati scongelati in ghiaccio, diluiti
alla concentrazione finale di 4μg/μl con loading buffer LDS sample buffer 4x (Life
51
Technologies) e il 5% di β-mercaptoetanolo (Sigma-Aldrich, MO, USA) e denaturati a
95°C per 5’. Infine gli omogenati sono stati caricati (40μg per campione) e fatti
correre in gel a gradiente (4–12% NuPAGE Bis–Tris mini gels 12 well 1 mm gels, Life
Technologies, CA, USA) e successivamente trasferiti su membrane in polyvinylidene
difluoride (PVDF) seguendo il protocollo della ditta (Amersham GE Healthcare, UK).
Al termine, il corretto trasferimento è stato evidenziato con la colorazione in rosso
ponceau della membrana, che è stata poi lavata in H2O distillata per numerose volte.
Parallelamente ai campioni sono stati fatti correre 5μl di marker dei pesi specifici
(BioRad, Milano, Italia) per identificare le bande specifiche.
A questo punto è stato effettuato il blocco della membrana per 1 ora a
temperatura ambiente; la soluzione di blocco è stata ottimizzata a seconda
dell’anticorpo primario utilizzato: per il marcatore della tyrosine hydroxylase (TH) e
del brain-derived neurotrophic factor (BDNF) è stata utilizzata una soluzione di
blocco costituita da Tris 20mM, NaCl 137mM, pH=7.4, e 0.1% Tween-20 (TBS-T) con
il 5% di non fat dry milk (NFM); invece per il marcatore del Cannabinoid receptor 2
(CB2) la membrana è stata bloccata in TBS-T con il 5% di BSA. Successivamente le
membrane sono state incubate con gli anticorpi primari per una notte a +4°C in
agitazione: Ab monoclonale di topo anti-TH (Millipore Temecula, CA, USA; diluito
1:1000 in TBS-T con NFM 5%), Ab policlonale di coniglio anti-BDNF (Santa Cruz
Biotechnology, Texas, USA; diluito 1:500 in TBS-T con NFM 5%), Ab policlonale di
52
coniglio anti-CB2 (offerto gentilmente dal professor Ken Mackie, Indiana University;
diluito 1:1000 in TBS-T con BSA 5%).
Quindi, le membrane sono state lavate in TBS-T e messe in incubazione per 1 ora a
temperatura ambiente con gli anticorpi secondari: Horse Radish Peroxidase (HRP)
anti-mouse (Vector, CA, USA; diluito 1:5000 in TBS-T) e HRP anti-rabbit (Santa Cruz
Biotechnology, Texas, USA). Infine le membrane vengono lavate in TBS-T, incubate
con la soluzione di rivelazione in chemiluminescenza, ECL-Detection reagent come
descritto dalla ditta (Amersham GE Healthcare, UK) e infine acquisite e digitalizzate
utilizzando il LAS-4000 (FujiFilm).
Tutte le membrane sono state inoltre, strippate a 60°C per 30 minuti in
stripping buffer (2% SDS in Tris-HCl pH 7.4 0.05 M e lo 1 % β-mercaptoetanolo) e
incubate con l’anticorpo monoclonale per il marcatore della proteina endogena
costitutiva house keeping protein, β-Actina (1:20000 in TBS-T/5%BSA, AbCam, UK)
per la normalizzazione del carico di proteine.
Successivamente è stata effettuata l’analisi densitometrica semi-quantitativa
dei segnali acquisiti, utilizzando il software Multi Gauge -ver.2.0- (FujiFilm). I segnali
delle bande specifiche sono stati normalizzati con le densità della corrispondente
banda della protenia endogena β-Actina. Quindi, i dati normalizzati sono stati
espressi come rapporto proteina/β-actina.
53
2.6
ANALISI STATISTICA
I dati densitometrici sono stati calcolati e espressi come media ± SEM o come
ratio proteina/β-actina.
I dati dei ratti trattati con METH e SAL sono stati comparati utilizzando un two-tailed
unpaired Student’s t-test; mentre i dati dei ratti trattati con METH-THC e METH-VEH
sono stati analizzati mediante un’analisi delle varianze (ANOVA) a 2 vie utilizzando
come fattori il trattamento (Δ9-THC e VEH) e il tempo del trattamento (PRE e POST),
seguita da ANOVA di livello inferiore, quando è stato ritenuto appropriato. Inoltre,
l’analisi dei ratti post-trattati con Δ9-THC e pre-trattati con SR, è stata effettuata con
un’ANOVA a 2 vie con il trattamento (Δ9-THC e VEH) e il pre-trattamento (SR e VEH)
come fattori. I dati riguardanti i marcatori per IBA-1 in IHC e per TH, BDNF e CB2 in
WB, sono stati analizzati mediante un’ANOVA a 2 vie utilizzando come fattori, il
trattamento (METH e SAL) e il post-trattamento (Δ9-THC e VEH), seguita da un twotailed unpaired Student’s t-test quando è stato ritenuto appropriato.
Inoltre è stata utilizzata una ANOVA a misure ripetute per le temperature e i pesi
corporei.
I confronti tra i gruppi nei post-hoc sono stati eseguiti usando il test del
Bonferroni.
54
3
RISULTATI
3.1
EFFETTO DELLA METH E DEL Δ9-THC SULLA TEMPERATURA CORPOREA, SUL
PESO E SULLA MORTALITA’
L’alterazione della temperatura corporea dei ratti, indotta dalla METH è stata
analizzata mediante una ANOVA a 2 vie a misure ripetute e l’effetto del Δ9-THC è
stato analizzato separando il pre-trattamento dal post-trattamento.
Le iniezioni ripetute di METH inducono un’ipertermia tempo-dipendente
[treatment: F(1,35)=82.3, p<0.0001; time: F(4,140)=43.8, p<0.0001; treatment x time:
F(4,140)=32.6, p<0.0001]. Non sono state riscontrate differenze nelle temperature
basali dei ratti trattati con SAL e con METH (SAL:37.57 ± 0.10; METH: 37.26 ± 0.13).
Come indicato in figura 8, il trattamento con METH induce un aumento della
temperatura immediatamente dopo la prima iniezione e il massimo effetto
ipertermico si ottiene dopo la terza e quarta somministrazione. Il post hoc del
Bonferroni ha mostrato che i ratti trattati con METH presentano temperature
significativamente più elevate dei ratti trattati con SAL a tutti i tempi, T0, T1, T2, T3
e T4.
Per quanto riguarda il pre-trattamento è stata eseguita una ANOVA a 2 vie
con il trattamento (METH) e il pre-trattamento (Δ9-THC1 e Δ9-THC3) come fattori e
il tempo come fattore a misure ripetute (T0, T1, T2, T3, T4). Non sono state
55
osservate differenze tra le temperature basali dei ratti dei diversi gruppi
sperimentali (METH:37.46 ± 0.13; SAL:37.55 ± 0.10; Δ9-THC1+METH:37.82 ± 0.13;
Δ9-THC1+SAL:37.7 ± 0.27; Δ9-THC3+METH:36.92 ± 0.22; Δ9-THC3+SAL:37.3 ± 0.23).
L’analisi a 2 vie ha rivelato un effetto principale del trattamento [F(1,36)=195.0,
p<0.0001]; del tempo [F(4,144)=48.8, p<0.0001+; un’interazione tra tempo e
trattamento [time x treatment: F(4,144)=51.1, p<0.0001] e infine un’interazione tra
tempo e pre-trattamento [time x pre-treatment: F(8,144)=3.3, p=0.001564]. Il post-hoc
col test del Bonferroni ha mostrato che i ratti trattati con METH presentano
temperature rettali significativamente più elevate se comparate alle temperature
rettali dei ratti trattati con SAL (1h: p<0.05; 3h: p<0.01; 5 e 7h : p<0.0001) (Fig.8).
L’effetto del Δ9-THC sulle temperature corporee dei ratti trattati con METH o SAL è
stato analizzato separatamente per le dosi di 1 e 3 mg/Kg, mediante una ANOVA a 2
vie a misure ripetute con il trattamento (METH), il pre-trattamento (Δ9-THC1 o Δ9THC3) e il tempo (T0, T1, T2, T3, T4) come variabili. L’analisi a due vie ha rivelato che
il trattamento con METH induce un’ipertermia tempo-dipendente sia nei ratti pretrattati con Δ9-THC1 [treatment: F(1,36)=60.7, p<0.0001; time: F(4,36)=11.7, p<0.0001;
treatment x time interaction: F(4,36)=10.1, p<0.0001], che nei ratti pre-trattati con Δ9THC3 [treatment: F(1,36)=81.7, p<0.0001; time: F(4,36)=33.2, p<0.0001; treatment x
time interaction: F(4,36)=31.8, p<0.0001]. Come mostrato in figura 8, i ratti che hanno
ricevuto il trattamento con Δ9-THC1-METH e con Δ9-THC3-METH presentano
56
temperature rettali più elevate rispetto ai ratti trattati con Δ9-THC1-SAL e Δ9-THC3SAL. Inoltre, non è stata evidenziata alcuna differenza tra i gruppi trattati con METH
e pretrattati con SAL e quelli pretrattati con Δ9-THC1 o Δ9-THC3. Pertanto, il pretrattamento con entrambe le dosi di Δ9-THC (1 e 3 mg/Kg) non riduce l’ipertermia
indotta dal trattamento con METH.
57
Fig. 8
T0
T1
T2
T3
T4
Figura 8. Temperatura corporea: effetto del trattamento con METH e del pretrattamento con Δ9-THC1 e Δ9-THC3
I ratti sono stati trattati con METH (4 x 10mg/Kg) o SAL e pre-trattati con Δ9-THC (1
o 3 mg/Kg) o con VEH. Le temperature rettali sono state misurate subito prima
dell’inizio del trattamento (T0, temperature basali) e 1h dopo ciascuna
somministrazione di METH o SAL (T1, T2, T3. T4). I valori sono stati espressi come
media ± SEM.
METH: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs il tempo corrispondente del gruppo di
controllo (SAL). Δ9-THC1-METH: ##p<0.01, ###p<0.001 vs il tempo corrispondente del
+
+++
proprio gruppo di controllo (Δ9-THC1-SAL). Δ9-THC3-METH: p<0.05,
tempo corrispondente del proprio gruppo di controllo (Δ9-THC3-SAL).
Le frecce indicano ciascuna somministrazione di METH o SAL.
p<0.001 vs il
58
Il post-trattamento è stato analizzato con una ANOVA a 2 vie con il
trattamento (METH) e il post-trattamento (Δ9-THC1 e Δ9-THC3) come fattori, e il
tempo come fattore a misure ripetute (T0, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8). Anche in
questo caso, non sono state osservate differenze tra le temperature basali dei ratti
dei diversi gruppi sperimentali (METH: 36.52 ± 0.20; SAL: 36.93 ± 0.29; METH-Δ9THC1: 36.86 ± 0.17; SAL-Δ9-THC1: 37.01 ± 0.10; METH-Δ9-THC3: 36.40 ± 0.32; SALΔ9-THC3: 36.50 ± 0.19). L’ANOVA a 2 vie ha mostrato un effetto principale del
trattamento
[F(1,49)=166.6,
p<0.0001];
del
tempo
[F(8,392)=59.8,
p<0.0001];
un’interazione tra tempo e trattamento *time x treatment: F(8,392)=63.5, p<0.0001]; e
un’interazione tra tempo, trattamento e post-trattamento [time x treatment x posttreatment: F(16,392)=1.9, p=0.016124]. Il post-hoc col test del Bonferroni (Fig.9) ha
mostrato un effetto ipertermico tempo dipendente indotto dal trattamento con la
METH, nei tempi T1, T2, T3, T4; inoltre il test ha evidenziato che il post-trattamento
con Δ9-THC a entrambe le dosi non influenza le temperatura corporea dei ratti.
59
Fig.9
Figura 9. Temperatura corporea: effetto del trattamento con METH e del posttrattamento con Δ9-THC1 e Δ9-THC3
I ratti sono stati trattati con 4 iniezioni di METH alla dose di 10 mg/Kg o con SAL e
post-trattati con Δ9-THC1 o Δ9-THC3 o VEH. Le temperature rettali sono state
misurate al tempo T0, prima di iniziare il trattamento (temperature basali), 1h dopo
ciascuna somministrazione di METH (T1, T2, T3, T4), e 30 min dopo ciascuna
iniezione di Δ9-THC (T5, T6, T7, T8). Tra le temperature basali dei ratti non sono
state riscontrate differenze. I valori delle temperature sono stati espressi come
media ± SEM. Il trattamento con METH aumenta in maniera significativa la
temperatura corporea rispetto ai ratti trattati con SAL. Il post-trattamento con il Δ9THC, a entrambe le dosi, non induce alcun effetto sulle temperature.
***p<0.001 vs il tempo corrispondente del gruppo di controllo.
Le linee verdi indicano ciascuna somministrazione di Δ9-THC1 o Δ9-THC3 o VEH.
60
Per quanto riguarda i pesi corporei dei ratti, in accordo con i nostri dati
precedenti [Bortolato M, et al 2010]. 24h dopo l’ultima somministrazione di METH i
ratti
hanno mostrato una diminuzione significativa (p<0.0001; -10%) del peso
corporeo rispetto ai ratti trattati con SAL
Infine, il test di Fisher ha rivelato che la METH induce una mortalità di circa il
27%, percentuale in accordo con i dati presenti in letteratura [Krasnova IN and
Cadet JL, et al. 2009].
61
3.2
EFFETTO DELLA METH SULLA IMMUNOREATTIVITA’ DELLA GFAP E DEL nNOS
Gli effetti della neuroinfiammazione e dello stress ossidativo indotti dalla
METH, sono stati misurati valutando l’IR della GFAP e del nNOS nelle aree di
interesse, PFC e CPU. Il t-Test ha rivelato che, il regime neurotossico di METH induce
un aumento dei livelli di IR della GFAP sia nella PFC (t(24)=2.83, p<0.01; +27%; Fig.10
A) che nel CPu (t(20)=9.06, p<0.0001, +137%; Fig.10 A), così come un aumento del
numero di neuroni nNOS positivi nel CPu (t(29)=4.02, p<0.001; +21%, Fig.10 B). Non è
stata evidenziata alcuna differenza nel numero di cellule nNOS-positive nella PFC.
62
Fig.10
Figura 10. La METH aumenta i livelli di IR della GFAP e il numero di neuroni nNOS
positivi
Sia in A che in B i ratti sono stati trattati con un regime neurotossico di METH (4 x
10mg/Kg) o con VEH. I valori delle percentuali di densità di GFAP-IR (A) e del numero
di neuroni nNOS positivi per mm2 (B) sono stati espressi come media ± SEM.
**p<0.01 e ***p<0.001 vs il gruppo di controllo trattato con salina (unpaired
Student’s t-test a due code).
63
3.3
IL Δ9-THC RIDUCE L’INCREMENTO DELL’ESPRESSIONE DELLA GFAP E DEL nNOS
INDOTTO DALLA METH
L’effetto del Δ9-THC sulla neuroinfiammazione e sullo stress ossidativo indotti
dalla METH, è stata analizzato tramite una ANOVA a 2 vie con il trattamento (Δ9-THC
1 e Δ9-THC3) e il tempo del trattamento (pre-trattamento, PRE e post-trattamento,
POST) come fattori.
Per quanto riguarda l’effetto del Δ9-THC sull’attivazione astrogliale indotta da
METH in PFC, l’analisi a due vie ha evidenziato un effetto principale del trattamento
[F(2,32)=25.49, p<0.0001] e il post-hoc Bonferroni ha rivelato che entrambe le dosi di
Δ9-THC, 1 e 3 mg/Kg, diminuiscono in maniera significativa (p<0.001) l’IR della GFAP
paragonata ai rispettivi controlli. Non è stato evidenziato né un effetto del tempo
[F(1,32)=0.22, p=0.638+, né un’interazione tra i fattori *treatment x time: F(2,32)=1.42,
p=0.254]. I dati del pre-trattamento e del post-trattamento sono stati analizzati
separatamente mediante un’analisi delle varianze a 1 via. L’ANOVA ha evidenziato
una diminuzione dell’IR della GFAP sia nel pre-trattamento che nel post-trattamento
con Δ9-THC a entrambe le dosi, rispetto ai controlli trattati solo con METH (PRE:34% e -37%, per 1 e 3 mg/kg, rispettivamente; p<0.01; POST:-47% e -29%; p<0.001
and p<0.05, rispettivamente) (Fig.11).
64
Fig.11
Figura 11. Il Δ9-THC riduce l’astrogliosi indotta dalla METH nella PFC
A. I ratti sono stati trattati con METH (4 x 10mg/Kg) e pre-trattati (PRE) o posttrattati (POST) con il Δ9-THC alle dosi di 1 o 3 mg/Kg. La somministrazione di Δ9-THC
a entrambe le dosi, sia come pre-trattamento che come post-trattamento, riduce la
neuroinfiammazione astrocitaria indotta dalla METH. PRE: -34% e -37%; POST: -47%
e -29%, per Δ9-THC1 e Δ9-THC3 rispettivamente verso i gruppi di controllo.
#
###
**p<0.01 vs PRE METH-VEH; p<0.05 e
p<0.001 vs POST METH-VEH (post-hoc
Bonferroni). La linea orizzontale tratteggiata indica la percentuale della densità di
fibre GFAP-IR del gruppo di controllo trattato con SAL-VEH. B. Immagini
rappresentative della IR in immunofluorescenza della GFAP nella PFC, dei gruppi
SAL-VEH, METH-VEH, METH-Δ9-THC3 e METH-Δ9-THC1.
La barra indica un’unità pari a 100μm.
65
Nello striato l’ANOVA a 2 vie ha evidenziato un effetto significativo del
trattamento [F(2,32)=16.28, p<0.0001+ e un’interazione tra trattamento e tempo di
trattamento [treatment x time: F(2,32)=8.12, p<0.01]. Al fine di comparare ciascun
gruppo all’altro è stato effettuato il post-hoc col test del Bonferroni, che ha
evidenziato che l’IR della GFAP è diminuita in maniera significativa nei ratti pretrattati con Δ9-THC3 (-53%, p<0.001) e nei ratti post-trattati con Δ9-THC1 (-50%,
p<0.001) se confrontati con i loro rispettivi gruppi di controllo (rispettivamente VEHMETH e METH-VEH; Fig.12).
66
Fig.12
Figura 12. Il Δ9-THC riduce l’astrogliosi indotta dalla METH in CPu
A. I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig. 11. Il pretrattamento con Δ9-THC3 e il post-trattamento con Δ9-THC1 riducono
significativamente l’astrogliosi indotta dal trattamento con METH (-53% e -50%,
###
rispettivamente). ***p<0.001 vs PRE METH-VEH;
p<0.001 vs POST METH-VEH
(post-hoc Bonferroni). La linea orizzontale tratteggiata indica la percentuale della
densità di fibre GFAP-IR del gruppo di controllo trattato con SAL-VEH. B. Immagini
rappresentative della IR in immunofluorescenza della GFAP in CPu, nei gruppi SALVEH, METH-VEH, METH-Δ9-THC3- e METH-Δ9-THC1.
La barra indica un’unità pari a 100μm.
67
Infine, per quanto concerne lo stress ossidativo indotto dalla METH nello
striato, l’ANOVA a 2 vie ha mostrato un effetto principale del trattamento
[F(2,37)=20.53, p<0.0001] e il successivo post-hoc col Bonferroni ha evidenziato che il
Δ9-THC a entrambe le dosi (Δ9-THC 1 e 3 mg/Kg) induce una diminuzione
significativa (p<0.001) dell’espressione del nNOS rispetto ai controlli. Non è stato
osservato alcun effetto del tempo [F(1,37)=0.031, p=0.86], né interazione tra
trattamento e tempo [treatment x time: F(2,37)=1.032, p=0.366]. Successivamente,
per poter valutare meglio l’effetto del Δ9-THC, i dati del tempo del trattamento (pretrattamento e post-trattamento) sono stati analizzati separatamente mediante una
ANOVA a 1 via, seguita dal post-hoc col test Bonferroni. Come è mostrato in figura
13, sia il pre-trattamento che il post-trattamento con entrambe le dosi di Δ9-THC (1
e 3 mg/Kg) inducono una diminuzione del nNOS neuronale nello striato. In
particolare, il pre-trattamento con la dose inferiore di Δ9-THC induce una riduzione
del 19% (p<0.05) del numero di neuroni positivi per nNOS, mentre il Δ9-THC3 induce
una diminuzione del 25% (p<0.01). Infine, il post-trattamento con Δ9-THC alla dose
di 1 mg/Kg diminuisce il numero dei neuroni nNOS-positivi del 28% (p<0.001),
mentre la dose più elevata di Δ9-THC induce una riduzione del 21% (p<0.05).
68
Fig.13
Figura 13. Il Δ9-THC riduce l’aumentata espressione dei neuroni nNOS positivi
indotta dalla METH
A. I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.11. Sia il pretrattamento che il post-trattamento con entrambe le dosi di Δ9-THC in CPu
diminuisce il numero di neuroni nNOS positivi. PRE: -19% e -25%; POST: -28% e 21%, rispettivamente per Δ9-THC1 e Δ9-THC3. *p<0.05 e **p<0.01 vs PRE METH#
###
VEH; p<0.05 e
p<0.001 vs POST METH-VEH (post-hoc Bonferroni). La linea
tratteggiata rappresenta i valori dei neuroni nNOS positivi nel gruppo SAL-VEH (31 ±
1.03). B. Immagini rappresentative del IR del nNOS in immunofluorescenza in CPu,
nei gruppi SAL-VEH, METH-VEH, METH-Δ9-THC1 e METH-Δ9-THC3.
La barra indica un’unità pari a 100μm.
69
3.4
EFFETTO DEL SR SULL’IR DELLA GFAP E SULL’ESPRESSIONE DEL nNOS
Per
valutare
il
possibile
coinvolgimento
del
recettore
CB1
nella
neuroprotezione indotta dal Δ9-THC, è stato testato l’effetto dell’antagonista (SR)
del recettore CB1 sul post-trattamento con la dose inferiore di Δ9-THC. SR di per se
non modifica nè i valori dell’IR della GFAP in PFC (SAL-VEH=1.30 ± 0.10; SAL-SR=1.03
± 0.17) e in CPu (SAL-VEH=0.75 ± 0.08; SAL-SR=0.66 ± 0.04), nè l’espressione del
nNOS nello striato (SAL-VEH=31.36 ± 1.04; SAL-SR=27.00 ± 1.40).
L’effetto del SR sull’IR della GFAP nella PFC dei ratti trattati con METH e posttrattati con il Δ9-THC (o il VEH), è stato valutato con una ANOVA a 2 vie con il
trattamento (Δ9-THC) e il pre-trattamento (SR) come fattori. L’analisi delle varianze
ha evidenziato un effetto principale del trattamento [F(1,35)=12.02, p=0.0014] e del
pre-trattamento [F(1,35)=7.09, p=0.011+, così come un’interazione tra il trattamento e
il pre-trattamento [Δ9-THC x SR: F(1,35)=32.88, p<0.0001]. Il successivo post-hoc con il
Bonferroni ha rivelato che, nei ratti trattati con Δ9-THC, l’IR della GFAP diminuisce
significativamente (p<0.001) rispetto ai ratti di controllo trattati solo con METH.
Inaspettatamente, l’analisi ha mostrato che anche il pre-trattamento con l’SR, da
solo o in combinazione con il Δ9-THC, riduce in maniera significativa (p<0.001) l’IR
della GFAP rispetto al gruppo di controllo (Fig.14).
70
Fig.14
Figura 14. Effetto del SR sull’IR della GFAP in PFC
I ratti trattati con la METH sono stati post-trattati con Δ9-THC (1mg/Kg) e pretrattati con l’antagonista del CB1, SR (1mg/Kg). Parallelamente, gruppi di controllo
sono stati trattati con i veicoli rispettivi ai trattamenti. Gli animali trattati con Δ9THC e pre-trattati con VEH, così come quelli trattati con SR, da solo o in
combinazione con il Δ9-THC, mostrano una significativa diminuzione dell’
espressione della GFAP-IR rispetto al controllo trattato con METH. ***p<0.001 vs
METH-VEH+VEH (post-hoc Bonferroni).
71
Per quanto riguarda l’IR della GFAP nello striato, come mostrato in figura 15,
l’ANOVA a 2 vie ha evidenziato un effetto principale del trattamento (Δ9-THC)
[F(1,35)=12.70, p=0.001] e del pre-trattamento (SR) [F(1,35)=36.49, p<0.0001], e
un’interazione fra i due fattori *Δ9-THC x SR: F(1,35)=19.86, p<0.0001]. Il post-hoc col
Bonferroni infine, ha rivelato che entrambi i trattamenti, Δ9-THC e SR, somministrati
da soli o in combinazione, diminuiscono significativamente (p<0.001) la percentuale
di fibre IR per la GFAP, rispetto al gruppo di controllo (METH-VEH+VEH).
72
Fig.15
Figura 15. Effetto del SR sull’IR della GFAP in CPu
I ratti sono stati trattati come viene descritto nella legenda della Fig.14. I trattamenti
con Δ9-THC e con SR, da soli o in combinazione tra loro, inducono una riduzione
significativa della percentuale di densità di GFAP-IR rispetto al gruppo di controllo
trattato solo con METH. ***p<0.001 vs METH-VEH+VEH (post-hoc Bonferroni).
73
Infine, per quanto concerne l’espressione del nNOS, l’analisi delle varianze a 2
vie ha evidenziato un’interazione significativa tra i due fattori dell’analisi, Δ9-THC e
SR [Δ9-THC x SR: F(1,40)=32.45, p<0.0001+. L’analisi post-hoc con il test del Bonferroni
ha rivelato che sia il trattamento con il Δ9-THC che il trattamento con l’SR da soli,
inducono una diminuzione significativa (p<0.0001) del numero dei neuroni positivi
per l’nNOS rispetto al gruppo di controllo trattato solo con METH. Il gruppo di ratti
trattato con METH-SR+Δ9-THC invece, mostra un aumento del numero di neuroni
positivi per l’nNOS (p<0.01; post-hoc col Bonferroni) rispetto al gruppo METHVEH+THC (Fig.16).
74
Fig.16
Figura 16. Effetto del SR sull’espressione dei neuroni nNOS positivi in CPu
I ratti sono stati trattati come è descritto in Fig.14. La somministrazione del SR
diminuisce parzialmente l’effetto del Δ9-THC sull’overespressione indotta da METH.
SR di per se diminuisce i neuroni nNOS positivi rispetto al gruppo di controllo.
***p<0.001 vs METH-VEH+VEH e
Bonferroni).
##
p<0.05 vs METH-VEH+Δ9-THC (post-hoc
75
Questi risultati suggeriscono che il post-trattamento con il Δ9-THC alla dose di
1mg/Kg, è capace di diminuire l’over-espressione del nNOS e l’IR della GFAP indotte
dalla METH, attraverso meccanismi rispettivamente mediati e non mediati dal
recettore CB1.
76
3.5
EFFETTO DEL POST-TRATTAMENTO CON Δ9-THC SULL’ESPRESSIONE DELLA TH
INDOTTA DALLA METH
Allo scopo di valutare l’effetto neuroprotettivo del Δ9-THC è stata valutata
l’espressione della proteina TH in alcune aree cerebrali, la corteccia e il CPu, tramite
l’analisi delle varianze a 2 vie con il trattamento (METH) e il post-trattamento (Δ9THC1) come fattori
Per quanto riguarda la corteccia, l’ANOVA a 2 vie ha evidenziato un effetto
principale del trattamento [F(1,34)=8.53, p=0.0056+ e un’interazione tra i fattori
[treatment x post-treatment: F(1,34)=11.31, p=0.007]. Il post hoc Bonferroni ha
rivelato che il trattamento con la METH induce una significativa diminuzione
(p<0.01) dell’espressione della proteina TH rispetto al gruppo di controllo trattato
con SAL. Il post-trattamento con Δ9-THC1 aumenta in maniera significativa
l’espressione della TH rispetto agli animali trattati con METH (p<0.05), ripristinando
quasi i valori basali della TH (Fig.17).
77
Fig.17
A
B
50 KDa
Figura 17. Δ9-THC inibisce il decremento dell’espressione della TH indotta dalla
METH nella corteccia
A. I ratti sono stati trattati con METH (4 x 10mg/Kg) o con SAL e post-trattati con Δ9THC (1mg/Kg) o con VEH. Il trattamento con METH diminuisce in maniera
significativa (-50%) l’espressione della TH rispetto al controllo, mentre il posttrattamento con Δ9-THC ripristina i livelli di espressione della proteina, aumentando
la sua espressione (+33%) rispetto al trattamento con la METH. **p<0.01 vs SAL#
VEH; p<0.05 vs METH-VEH (post-hoc Bonferroni). B. Immagini rappresentative
dell’immunoblot effettuato per la TH in corteccia, nei gruppi sperimentali METH-Δ9THC, SAL-Δ9-THC, SAL-VEH e METH-VEH. In basso la proteina endogena β-Actina con
la quale è stata eseguita la normalizzazione dei valori di ciascun campione.
78
Per quanto concerne lo striato, l’analisi a 2 vie ha mostrato un effetto
principale del trattamento [F(1,34)=6.91, p=0.013] e del post-trattamento [F(1,34)=13.4,
p=0.0008+, e un’interazione tra i fattori *treatment x post-treatment: F(1,34)=17.15,
p=0.0002]. Il post-hoc Bonferroni ha rivelato che i ratti trattati con la METH anche in
CPu hanno ,una diminuzione significativa della TH (p<0.001) rispetto ai controlli
(SAL), e che il post-trattamento con Δ9-THC ripristina completamente l’espressione
della proteina (p<0.001 vs METH-VEH) (Fig.18).
79
Fig.18
A
B
50 KDa
Figura 18. Δ9-THC inibisce il decremento dell’espressione della TH indotta dalla
METH in CPu.
A. I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.17. L’espressione
della TH nello striato è diminuita in maniera significativa (-45%) nei ratti trattati con
METH rispetto a quelli trattati con il VEH. Il post-trattamento con Δ9-THC aumenta
in maniera significativa (+42%) l’espressione della TH rispetto ai ratti trattati con
###
METH. ***p<0.001 vs SAL-VEH; p<0.001 vs METH-VEH (post-hoc Bonferroni). B.
Immagini rappresentative dell’immunoblot effettuato per la TH nello striato, nei
gruppi sperimentali METH-VEH, SAL-VEH, SAL-Δ9-THC e METH-Δ9-THC. In basso la
proteina endogena β-Actina con la quale è stata eseguita la normalizzazione dei
valori di ciascun campione.
80
3.6
IL Δ9-THC RIDUCE L’AUMENTATA ESPRESSIONE DI IBA-1 INDOTTA DALLA
METH
L’espressione
dell’IBA-1,
indice
di
attivazione
microgliale
e
di
neuroinfiammazione, è stata valutata sia in PFC che in CPu tramite un’ANOVA a 2 vie
con il trattamento (METH) e il post-trattamento (Δ9-THC) come fattori.
In PFC l’ANOVA ha rivelato un effetto principale del trattamento *F(1,13)=7.45,
p=0.017] e del post-trattamento [F(1,13)=5.66, p=0.033+, e un’interazione tra i fattori
[trattamento x post-trattamento: F(1,13)=5.16, p=0.041]. Il post-hoc Bonferroni ha
evidenziato che il trattamento con la METH induce un aumento significativo (p<0.05)
dell’espressione dell’IBA-1 rispetto ai ratti trattati con SAL, mentre il posttrattamento con Δ9-THC induce una diminuzione significativa (p<0.05) del numero
di cellule positive per IBA-1, rispetto ai ratti trattati con METH (Fig.19).
81
Fig.19
A
B
METH-VEH
METH-Δ9-THC
SAL-VEH
SAL-Δ9-THC
Figura 19. Il Δ9-THC diminuisce l’aumentata espressione delle cellule microgliali
IBA-1 positive indotta dalla METH in PFC
A. I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.17. Il trattamento
con METH induce un aumento dell’espressione dell’IBA-1 (+38%) rispetto al
controllo (SAL-VEH). Il post-trattamento con Δ9-THC ripristina i valori basali di IBA-1IR, diminuendo l’incremento dell’IBA-1-IR indotto dal trattamento con la METH.
#
*p<0.05 vs SAL-VEH, p<0.05 vs METH-VEH (post-hoc Bonferroni). B. Immagini
rappresentative della IR dell’IBA-1 in immunofluorescenza in PFC, nei gruppi METHVEH, METH-Δ9-THC, SAL-VEH e SAL-Δ9-THC.
La barra micrometrica indica un’unità pari a 100μm.
82
In CPu, come è mostrato in figura 20, l’ANOVA a 2 vie ha evidenziato un
effetto principale del post-trattamento [F(1,14)=8.29, p=0.012] e un’interazione tra i
fattori [trattamento x post-trattamento: F(1,14)=6.48, p=0.023]. Il confronto fra i
gruppi, effettuato con l’analisi post-hoc Bonferroni, ha evidenziato che il
trattamento con la METH induce un aumento significativo (p<0.05) del numero di
cellule IBA-1 positive rispetto ai ratti trattati con SAL. Il post-trattamento con Δ9THC diminuisce significativamente (p<0.01) l’espressione delle cellule microgliali
positive per IBA-1 indotta dalla METH, riportando i livelli di IBA-1 ai valori basali.
83
Fig.20
A
B
METH-VEH
METH-Δ9-THC
SAL-VEH
SAL-Δ9-THC
Figura 20. Il Δ9-THC diminuisce l’aumentata espressione delle cellule microgliali
IBA-1 positive indotta dalla METH in CPu
A. I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.17. Il numero di
cellule microgliali IBA-1-IR è aumentato significativamente dal trattamento con
METH (+31%) rispetto al controllo (SAL-VEH). L’aumento di espressione di IBA-1 è
inibito dal post-trattamento con Δ9-THC che ripristina i valori basali dell’IBA-1R .
#
##
*p<0.05 vs SAL-VEH; p<0.05 e p<0.01 vs METH-VEH (post-hoc Bonferroni). B.
Immagini rappresentative della IR dell’IBA-1 in immunofluorescenza in PFC, nei
gruppi METH-VEH, METH-Δ9-THC, SAL-VEH e SAL-Δ9-THC. La barra indica un’unità
pari a 100μm.
84
3.7
ESPRESSIONE DELLA NEUROTROFINA BDNF NEI RATTI TRATTATI CON METH E
POST-TRATTATI CON Δ9-THC
Allo scopo di valutare il coinvolgimento della neurotrofina BDNF nella
neurotossicità indotta dalla METH e nella neuroprotezione indotta dal Δ9-THC, i
livelli di questa proteina sono stati valutati tramite western blot nella corteccia
cerebrale e nel CPu. I risultati sono stati analizzati mediante un’ANOVA a 2 vie con il
trattamento (METH) e il post-trattamento (Δ9-THC) come fattori.
L’analisi a 2 vie ha mostrato sia in corteccia che in CPu un effetto principale del
trattamento (METH) [F(1,29)=4.82, p=0.036 e F(1,32)=5.57, p=0.024; rispettivamente per
la corteccia e per il CPu+. Dall’analisi non è emerso alcun effetto del posttrattamento né interazione tra i fattori. In entrambe le aree cerebrali, il trattamento
con la METH aumenta l’espressione della proteina BDNF, mentre il post-trattamento
con il Δ9-THC non è in grado di bloccare gli effetti indotti dalla METH (Fig.21).
85
Fig.21
A
B
Figura 21. Espressione della proteina neurotrofica BDNF nella corteccia e nel CPu
di ratti trattati con METH e METH-Δ9-THC
I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.17. In entrambe le
aree cerebrali, corteccia e CPu, dei ratti trattati con METH-VEH e METH-Δ9-THC è
presente un aumento significativo del BDNF rispetto ai ratti trattati con SAL-VEH e
#
SAL-Δ9-THC. CORTECCIA: *p<0.05 vs SAL-VEH , p<0.05 vs SAL-THC; CPu: **p<0.01 vs
##
SAL-VEH , p<0.01 vs SAL-THC (upaired Student’s t-test).
86
3.8
ESPRESSIONE DEL RECETTORE CB2 NEI RATTI TRATTATI CON METH E POST-
TRATTATI CON Δ9-THC
L’espressione del recettore CB2 è stata analizzata tramite western blot, al fine
di valutare un possibile coinvolgimento di questa proteina nella neurotossicità
indotta da METH e nel meccanismo di protezione indotto dal Δ9-THC.
Come mostrato in figura 22, l’ANOVA a 2 vie ha evidenziato un effetto principale del
trattamento sia in corteccia che in CPu [F(1,31)=5.17, p=0.029; F(1,31)=5.96, p=0.020,
rispettivamente+. L’ANOVA non ha dimostrato nessun effetto del post-trattamento
con Δ9-THC, né alcuna interazione trattamento (METH) e post-trattamento (Δ9-THC)
87
Fig.22
Figura 22. Espressione del recettore CB2 nei ratti trattati con METH e METH-Δ9THC
I ratti sono stati trattati come descritto nella legenda della Fig.17. In entrambe le
aree cerebrali, corteccia e striato, dei ratti trattati con METH-VEH o METH-Δ9-THC si
vede un aumentata espressione del recettore CB2 rispetto ai ratti controllo (SAL
#
post-trattato con VEH o con Δ9-THC). CORTECCIA: **p<0.01 vs SAL-VEH , p<0.05 vs
#
SAL-THC; CPu: *p<0.05 vs SAL-VEH , p<0.05 vs SAL-THC (upaired Student’s t-test).
88
4
DISCUSSIONE
In questo studio di dottorato è stato dimostrato che il trattamento dei ratti
con un binge di METH (4 x 10 mg/Kg) induce una forte ipertermia e aumenta sia il
numero di neuroni positivi per nNOS (in CPu), marker del danno neuronale, che l’IR
per la GFAP e per l’IBA1 (in PFC e in CPu), rispettivamente markers della
neuroinfiammazione astrogliale e microgliale. Inoltre, questo trattamento induce
una diminuzione dell’espressione della TH (nella corteccia e nello striato), marker di
neurotossicità e neurodegenerazione. Questi dati sono in linea con quelli riportati in
letteratura [Krasnova IN and Cadet JL, 2009; Thomas DM, et al. 2004; Perry VH, et al.
2007] e supportano il fatto che il binge di METH (4 x 10 mg/Kg) usato in questo
studio sia un modello di neurotossicità e neurodegenerazione. Il binge di METH è il
modello più frequentemente utilizzato nel ratto ed è generalmente associato alla
neurotossicità, alla deplezione di DA e 5HT, all’ipertermia e ad una mortalità elevata
[Davidson C, et al. 2001]. La validità di questo modello è supportata anche da un
nostro precedente studio che ha dimostrato che un regime di METH (4 x 4 mg/Kg) è
stato capace di indurre neurotossicità, valutata come riduzione delle terminazioni
5HTergiche e DAergiche in diverse aree cerebrali 3 e 7 giorni dopo l’ultima
somministrazione di METH. [Bortolato M, et al. 2009].
89
Nel corrente studio, utilizzando questo modello di neurotossicità indotta dalla
METH, sono stati messi in luce gli effetti neuroprotettivi del Δ9-THC, il principale
costituente della cannabis sativa. In particolare, è stato dimostrato che il Δ9-THC,
riduce l’espressione dei due markers di tossicità neuronale, nNOS e GFAP, che sono
aumentati con il trattamento con la METH.
In particolare, l’over-espressione del nNOS, indotta dalla METH in CPu, viene
attenuata sia dal pre-trattamento che dal post-trattamento con Δ9-THC alla dose di
1 mg/Kg e 3 mg/Kg. L’ossido nitrico (NO) gioca un ruolo chiave nella neurotossicità
indotta dalla METH; esso è sintetizzato dall’enzima neuronale nNOS, funziona come
neuromodulatore e viene implicato in numerosi disturbi del SNC, fra cui la
neurotossicità indotta dalla METH [Davidson C, et al. 2001+. L’aumento
extracellulare di GLU indotto da una dose neurotossica di METH attiva i recettori
NMDA causando un aumento intracellulare di Ca2+, che a sua volta induce
l’attivazione del nNOS mediante un meccanismo dipendente dalla via Ca2+calmodulina, con produzione finale di NO. Quest’ultimo è capace di reagire con gli
ioni superossido formatisi dall’autossidazione della DA, dando origine alle specie
reattive dell’azoto (RNS) *Marshall JF and O’Dell SJ, 2012].
Uno studio condotto su topi trattati con METH, ha dimostrato che il
pretrattamento con un inibitore di questo enzima, il 7-NI, previene la neurotossicità
90
indotta dalla METH [Izthak SF and Ali J, 1996+; l’effetto neuroprotettivo di questo
inibitore sembra coinvolgere anche un meccanismo di riduzione dell’ipertermia
indotta dalla METH [Callahan BT and Ricaurte GA, 1998]. Infatti è stato dimostrato
che il binge di METH nei topi nNOS-KO non induce neurotossicità DAergica, né
ipertermia [Izthak Y, et al. 1998].
Numerosi studi descrivono le interazioni tra i cannabinoidi e l’enzima NOS
suggerendo il coinvolgimento del recettore CB1 nella regolazione della sintesi del
NO. Ad esempio, è stato dimostrato che il trattamento con Δ9-THC dei neuroni della
retina, previene la neurotossicità mediata dal NO e dai perossinitriti e pertanto
protegge questi neuroni dalla tossicità mediata dai recettori NMDA [El-Remessy AB,
et al. 2003]. Inoltre, uno studio condotto sui neuroni cerebrocorticali di topo, ha
dimostrato che la tossicità indotta dal NMDA viene ridotta sia in vitro che in vivo dal
trattamento con un agonista del recettore CB1, il WIN, tramite un meccanismo che
coinvolge l’attivazione del nNOS e della PKA. Lo stesso studio ha rivelato anche una
maggiore attività dell’enzima nNOS nelle cellule della corteccia cerebrale dei topi
CB1-KO rispetto a quella dei wild-type [Kim YS and Joh TH, 2006].
In questo progetto di dottorato, è stato inoltre dimostrato che in PFC e in CPu
sia il pre- che il post-trattamento con Δ9-THC riduce l’astrogliosi indotta dalla METH,
suggerendo che l’effetto neuroprotettivo possa essere almeno parzialmente
91
mediato dalle proprietà anti-infiammatorie del Δ9-THC. In particolare mentre in PFC
entrambe le dosi di Δ9-THC (1 e 3 mg/kg) riducono l’astrogliosi, in CPu il Δ9-THC
riduce l’astrogliosi rispettivamente a 3mg/kg nel pre-trattamento e a 1mg/kg nel
post-trattamento. La mancata dose-risposta negli effetti del Δ9-THC nel ridurre
l’over espressione del nNOS in CPu e l’astrogliosi potrebbe suggerire che la massima
protezione sia ottenuta con la dose più bassa (1 mg/kg), dovuto al cosidetto effetto
ceiling.
La neuroinfiammazione è un evento importante nella neurotossicità indotta
dalla METH; infatti è stato dimostrato che l’attivazione astrocitaria viene indotta dal
trattamento con un binge di METH, che aumenta i livelli di GFAP nello striato, nella
corteccia e nell’ippocampo *Thomas DM, et al. 2004]. Farmaci antinfiammatori
(come il ketoprofene, l’indometacina, la tetraciclina e la miociclina) proteggono dalla
gliosi e dalla neurotossicità indotta dalla METH [Asanuma M, et al. 2003]. Goncalves
e collaboratori nel 2010 hanno dimostrato che l’indometacina previene l’upregolazione della GFAP indotta dalla METH nell’ippocampo di topo *Goncalves J, et
al. 2010]. Inoltre è stato dimostrato che gli agonisti dei recettori cannabinoidi
inibiscono la produzione di NO nella microglia, nei neuroni e nei macrofagi [Massi P,
et al. 2008]. Infine, numerose evidenze, utilizzando diversi approcci sperimentali
incluso le tecniche immunoistochimiche, hanno rivelato la presenza dei recettori
92
CB1 in colture cellulari di astrociti e in sezioni di cervello di ratto e topo [Stella N,
2004].
La neurotossicità indotta dalla METH, e il trattamento con il Δ9-THC sono
generalmente associati rispettivamente a effetti ipertermici e ipotermici [Krasnova
IN and Cadet JL, 2009]. Pertanto, in questo studio è stato testato l’effetto del
trattamento col Δ9-THC a 1 e 3 mg/Kg sull’ipertermia indotta dalla METH.
Contrariamente ad altri studi [Tourino C, et al. 2010] che hanno dimostrato che il
Δ9-THC era in grado di ridurre l’ipertermia indotta dal MDMA, nel nostro studio sia il
pre-trattamento che il post-trattamento con Δ9-THC non previene l’effetto
ipertermico della METH. Questi risultati suggeriscono che l’effetto neuroprotettivo
del Δ9-THC è indipendente dalla temperatura e che probabilmente è mediato da
altri meccanismi tra cui per esempio quelli CB1-recettore-mediati.
Allo scopo di evidenziare un possibile meccanismo CB1-mediato è stato
effettuato un pre-trattamento con SR, l’antagonista dei recettori CB1, sui ratti posttrattati con Δ9-THC alla dose di 1 mg/Kg. La scelta di analizzare il coinvolgimento del
recettore CB1 solo sul post-trattamento con Δ9-THC alla dose di 1 mg/Kg, è
secondaria agli effetti di neuroprotezione osservati con questo schema di
trattamento (i.e. GFAP e nNOS in CPu) e al possibile effetto ceiling (vedi paragrafo
precedente).
93
E’ stato dimostrato che SR attenua l’effetto neuroprotettivo del Δ9-THC
sull’over-espressione del nNOS indotta dalla METH. Questo effetto potrebbe essere
mediato dai recettori presinaptici CB1 presenti sulle terminazioni glutammatergiche
o sugli astrociti, il cui blocco determina un aumento del rilascio di GLU e quindi
eccitotossicità. SR invece non è in grado di bloccare la capacità della Δ9-THC di
diminuire l’astrogliosi indotta dalla METH sia nello striato che nella corteccia
prefrontale. Questi dati rivelano che il Δ9-THC potrebbe inibire l’astrogliosi indotta
dalla METH non attraverso un meccanismo CB1-dipendente, ma tramite un
meccanismo CB2-mediato. In accordo con tale ipotesi, recentemente Tourino e
collaboratori (2010) hanno dimostrato che il Δ9-THC sopprimeva l’attivazione
astrocitaria indotta da MDMA attraverso un meccanismo mediato dal recettore CB2
[Tourino C, et al. 2010].
Inaspettatamente, i dati relativi all’effetto del SR dimostrano che in CPu e in
PFC di per se induce una diminuzione sia del nNOS che dell’astrogliosi attivati dalla
METH; tale effetto non è stato mai descritto precedentemente. Numerosi studi
hanno riportato che SR esercita un ruolo neuroprotettivo in modelli animali
d’ischemia cerebrale e danno neuronale indotto da NMDA *Pellegrini-Giampietro
DE, et al. 2009; Hansen HS, et al. 1998+. Nei modelli animali di occlusione dell’arteria
cerebrale l’effetto neuroprotetivo del SR era associato con: i) un aumento dei
contenuti striatali di AEA; ii) un aumento dell’attività enzimatica della fosfolipasi D
94
che idrolizza la N-acilfosfatidiletanolamina (NAPE); e iii) una ridotta espressione e
attività della FAAH [Muthian S, et al. 2004; Amantea D, et al. 2007; Berger C, et al.
2004]. Inoltre Pegorini e collaboratori nel 2006 hanno suggerito un possibile ruolo
del recettore vanilloide TRPV1 nell’effetto neuroprotettivo del SR, dimostrando che
l’effetto neuroprotettivo del SR nel modello animale di ischemia cerebrale
transitoria, è bloccato dall’antagonista dei TRPV1, la capsazepina *Pegorini S, et al.
2006]. Questi dati suggeriscono che SR può avere un effetto protettivo contro
l’eccitotossicità, attraverso il blocco dei CB1 e prevenendo la loro attivazione
mediata dalla produzione di AEA endogeno che si accumula durante il danno
cerebrale [Marinelli S, et al. 2002+. Poiché l’AEA attiva sia i recettori CB1 che i TRPV1
[De Petrocellis L, et al. 2001], le aumentate concentrazioni di AEA attivano e
desensitizzano i recettori vanilloidi [Pegorini S, et al. 2006], inducendo un effetto
neuroprotettivo. Inoltre è stato dimostrato che, in seguito al danno neuronale,
l’aumento intracellulare di Ca2+ induce la produzione di NAPE e N-aciletanolamina
(NAE), inclusa l’AEA *Hansen HS, et al. 1998].
In alternativa, l’effetto protettivo del SR potrebbe essere mediato da un
meccanismo che agisce sul rilascio di GLU, che sia indipendente dal CB1, come viene
riportato da uno studio effettuato in vitro sui sinaptosomi ippocampali di ratto e
topo [Kofalvi A, et al. 2003].
95
Allo scopo d’identificare altri meccanismi coinvolti nell’azione neuroprotettiva
indotta dal Δ9-THC, oltre a quelli mediati dal CB1, è stato analizzato l’effetto del
post-trattamento con il Δ9-THC alla dose di 1 mg/Kg sull’espressione di altri markers
di neurotossicità.
Il Δ9-THC, sia nella corteccia che nello striato, protegge i terminali DAergici,
infatti attenua l’effetto della METH sui livelli della TH, riportando i valori di
quest’ultima ai livelli basali. In maniera consistente, nei modelli di neurotossicità
indotta dalla METH, l’espressione della TH è utilizzata come indice della perdita dei
terminali DAergici la cui riduzione è parallela alla diminuzione di DA misurata in
HPLC [Nader J, 2014; Thiriet C, et al. 2005].
In accordo con i risultati del presente lavoro, recenti dati di Nader e
collaboratori nel 2014, hanno dimostrato che il pre-trattamento con Δ9-THC (3
mg/Kg) o con gli inibitori della FAAH (URB597) e della MAGL (JZL184) riporta i livelli
di TH ai valori basali. Questo effetto è bloccato dall’antagonista selettivo per i
recettori CB2, l’AM630, ma non dal SR, antagonista dei recettori CB1*Nader J, 2014].
Inoltre i nostri dati dimostrano che il post-trattamento con Δ9-THC sia in CPu
che in PFC diminuisce l’incremento dei valori dell’IBA1 indotti dalla METH
riportandoli ai valori basali.
96
Torres e collaboratori (2010) hanno dimostrato che l’agonista selettivo per i
recettori CB2, il JWH-015, blocca l’attivazione della microglia indotta dal MDMA,
suggerendo un coinvolgimento di tale recettore nel meccanismo di neuroprotezione
nella neurotossicità indotta da MDMA. Inoltre nel loro lavoro Torres et coll hanno
riportato anche un incremento della immunoreattività per i recettori CB2, la cui
aumentata espressione è diminuita dalla somministrazione di JWH-015 [Torres E, et
al. 2010].
I nostri dati dimostrano che il trattamento con METH, induce un aumento
dell’espressione del recettore CB2, che però non viene modificata in seguito al posttrattamento con il Δ9-THC.
Il mancato effetto del nostro post-trattamento (Δ9-THC 1mg/kg) sull’espressione del
recettore CB2 può essere attribuita sia all’utilizzo di droghe d’abuso differenti, i.e
MDMA vs METH, che al differente trattamento cannabinoide, JWH vs THC, che non
è un agonista selettivo dei CB2r ma agisce su entrambi i recettori CB1 e CB2.
Infine è stato dimostrato che il trattamento con la METH, aumenta i livelli
della proteina neurotrofica BDNF sia in corteccia che in striato. Numerose evidenze
indicano come i fattori neurotrofici, regolando la plasticità sinaptica, possano
contribuire al fenomeno di “neuro-adattamento” secondario all’abuso di droghe
97
psicoattive [Fumagalli F, et al. 2007], tipo la METH. Inoltre è ampiamente noto che. il
BDNF i) esercita una forte influenza sulla funzionalità neuronale sia durante lo
sviluppo che nell’adulto, ii) ha un azione neuroprotettiva in diverse condizioni
sperimentali di danno cerebrale e iii) svolge un ruolo importante nei processi
cognitivi e comportamentali [Fumagalli F, et al. 2003; Fumagalli F, et al. 2007].
Nonostante ciò in letteratura sono presenti dati divergenti sugli effetti che il
trattamento con droghe psicostimolanti può indurre sull’espressione del mRNA e
della proteina del BDNF. Fumagalli e collaboratori,(2007) hanno dimostrato che il
trattamento acuto con cocaina induce un aumento sia dei livelli di mRNA che di
proteina del BDNF. Il trattamento cronico con la stessa sostanza induce una marcata
up-regolazione del mRNA del BDNF, ma diminuisce fortemente i livelli della proteina
[Fumagalli F, et al. 2007]. Il trattamento con un binge di METH induce un aumento
dell’espressione del BDNF nell’ippocampo e nello striato nei ratti a 11 e a 15 giorni
dalla nascita [Curtis EK, 2006]. Il trattamento con un binge di METH induce anche un
aumento dell’espressione del mRNA del BDNF in ratti adulti sacrificati 1h o 7h o 24h
dopo il trattamento con METH [Braun AA, et al. 2011].
Pertanto i nostri dati dimostrano, in linea con quelli di Braun (2011) che
dimostrano un incremento del mRNA per il BDNF, che il trattamento con la METH,
up-regola l’espressione della proteina del BDNF. Questi dati indicano che
98
l’aumentata produzione del BDNF possa essere un meccanismo di compenso al
danno neurotossico indotto dalla METH.
Il trattamento con Δ9-THC non interagisce con questo tipo di meccanismo
compensatorio e non modifica l’aumentata espressione della proteina BDNF.
In conclusione questo studio fornisce i primi dati che dimostrano che il Δ9-THC
riduce i danni cerebrali indotti dal trattamento con METH, attraverso meccanismi
CB1-mediati e -non mediati. I dati suggeriscono un possibile coinvolgimento del
recettore CB2 nel meccanismo di neuroprotezione del Δ9-THC, tuttavia al fine di
mettere in luce il reale coinvolgimento di questo recettore nel meccanismo
neuroprotettivo indotto dal Δ9-THC è necessario condurre ulteriori studi.
99
BIBLIOGRAFIA
1)
Amantea D, Spagnuolo P, Bari M, Fezza F, Mazzei C, et al. (2007)
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is involved in neuroprotection afforded by 17beta-estradiol. FEBS J. 274:
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La presente tesi è stata prodotta durante la frequenza del corso di dottorato in Neuroscienze,
dell’Università degli Studi di Cagliari, a.a. 2013/2014 - XXVII ciclo, con il supporto di una borsa di studio
finanziata con le risorse del P.O.R. SARDEGNA F.S.E. 2007-2013 - Obiettivo competitività regionale e
occupazione, Asse IV Capitale umano, Linea di Attività l.3.1 “Finanziamento di corsi di dottorato finalizzati
alla formazione di capitale umano altamente specializzato, in particolare per i settori dell’ICT, delle
nanotecnologie e delle biotecnologie, dell'energia e dello sviluppo sostenibile, dell'agroalimentare e dei
materiali tradizionali”.
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