Lo stato dell`arte della genetica

IL LABORATORIO DI
IMMUNOEMATOLOGIA
FORENSE
Carlo Previderè
Dipartimento di Sanità Pubblica,,
Medicina Sperimentale e Forense
Sezione di Medicina Legale e Scienze Forensi
Università degli Studi di Pavia
Scienze forensi di interesse medico/biologico:
•
•
•
•
•
Istologia e istopatologia forense
Tossicologica forense
Antropologia forense
Odontologia forense
Psichiatria forense
• Genetica forense
Scienze forensi di interesse chimico/naturalistico
•
•
•
•
Entomologia forense
Balistica forense
Botanica forense (palinologia)
Geologia forense (pedologia)
• l"effetto CSI" è una locuzione che si riferisce al modo in cui
alcune serie televisive di successo hanno cambiato la
percezione che la gente comune ha verso la medicina forense
e le perizie scientifiche in generale, alzando le aspettative e
richiedendo la stessa qualità di risultati che si può apprezzare
in televisione.
l"effetto CSI"
• Nella realtà, gli scienziati forensi non hanno a che fare con
certezze e il modo di riportare le evidenze è, nella maggior
parte dei casi, quello probabilistico.
• In molti casi, il calcolo di queste probabilità è estremamente
complesso e non è facile la presentazione e comprensione dei
risultati. Il Giudice molte volte si trova di fronte ad una
pluralità di tesi contrapposte (accusa e difesa) e all’apparenza
di più di un ragionevole dubbio. Compito del Giudice è
scegliere l’ipotesi migliore.
• Altro importante effetto collaterale dell’effetto CSI è che sono
sempre meno le “tracce” lasciate sulla scena del crimine.
Alcune addirittura sono “prove artefatte”.
-Proteggere e assicurare l’affidabilità dell’analisi
eseguita in modo da garantirne la genuinità
- documentare la catena di custodia
- protocolli di analisi validati in ambito forense
- selezione di marcatori genetici secondo le indicazioni delle Società scientifiche
internazionali
- interpretazione dei risultati secondo le linee guida di società nazionali o
internazionali di genetica forense (ISFG, ENFSI, GeFI)
- certificazione/accreditamento dei laboratori secondo norme ISO/IEC .
- La prova scientifica presentata in Tribunale deve
resistere alle controdeduzioni della difesa (prova che
resiste alla sua negazione).
L’attività del genetista forense
ITER DI UNA TRACCIA:
dalla deposizione all’identificazione genetica
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
•Banche dati del DNA
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
•Le banche dati del DNA
Prelevata direttamente
nel corso del
sopralluogo giudiziario
Consegnata al
laboratorio come reperto
dalla Polizia Giudiziaria
Sopralluogo giudiziario
alla ricerca delle cose e delle tracce pertinenti al reato nonchè alla
conservazione di esse e dello stato dei luoghi (art. 348 commi 1 e 2 c.p.p.)
E’ fondamentale che il sopralluogo giudiziario sia compiuto con le dovute
cautele e da personale specializzato per evitare contaminazioni/alterazioni
della scena del crimine.
Prevedendo una serie di operazioni complesse, è fondamentale la
formazione (training) del personale.
E’ fondamentale il coordinamento delle diverse figure professionali
coinvolte nel sopralluogo (medico-legale, polizia scientifica, genetista
forense, entomologo forense)
Sopralluogo giudiziario
La repertazione e conservazione del campione biologico è fondamentale
per ottenere risultati attendibili dalle analisi del DNA.
Se il reperto non viene conservato in modo idoneo, il DNA può
degradarsi. La degradazione è un processo enzimatico e/o chimico/fisico
che provoca il deterioramento del DNA. Ciò può portare all’impossibilità
di ottenere una tipizzazione genetica da un reperto biologico.
Ispezione del cadavere in sede di esame autoptico
Margini ungueali:
ungueali: prelievo di materiale subungueale
Morsicature:: tamponi per prelievo di saliva
Morsicature
Formazioni pilifere:
pilifere
Tamponi ginecologici:
ginecologici nei casi di violenza sessuale
Campioni di riferimento:
riferimento sangue/tessuti
Reperti consegnati al
laboratorio dalla Polizia Giudiziaria
La catena di custodia
Documentazione della serie di eventi che accompagna un
reperto dal prelievo sulla scena del crimine o sull’indagato al
laboratorio di analisi
(prelievo fasi di trasferimento collocamento definitivo)
Verifica che le operazioni di ricerca dei mezzi di prova siano
avvenute senza contaminazioni sia durante la fase del
sopralluogo che nel corso dell’ispezione del cadavere.
La documentazione di ogni fase delle attività consente a
chiunque un controllo sulle operazioni svolte e sulle
metodiche utilizzate.
Sopralluogo giudiziario
Differente morfologia delle tracce
ematiche
CATEGORIE DI TRACCE EMATICHE
PASSIVE
DA APPOSIZIONE (TRANSFER)
PROIETTATE
MORFOLOGIA DELLE TRACCE EMATICHE
Angle
of
Impact
90°
80°
70°
60°
50°
40°
30°
20°
Gravitational dense zone
at lower edge
10°
Adapted from
Introduction to Forensic Sciences,
W. Eckert, CRC, 1997
Morfologia delle tracce ematiche
Il Bloodstain Pattern Analysis (BPA) consente, attraverso
l’esame della forma, della posizione e della distribuzione delle
tracce ematiche, di interpretare e di comprendere gli eventi che
le hanno originate.
L’analisi della distribuzione delle tracce ematiche presenti su
di un indumento, per esempio, consente di avere conferma
della versione fornita da un indagato ovvero di confutarla.
Questo, per esempio, nel caso in cui sia possibile, attraverso il
BPA, ipotizzare la dinamica dell’evento (vittima in posizione
eretta, supina, seduta; evidenza di lotta tra vittima ed
aggressore).
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
Diagnosi di natura e di specie
i test di orientamento
Suggeriscono la presenza di un certo tipo di campione biologico
Test al luminol per sostanza ematica
Falsi positivi
Detergenti
Tensioattivi
Vernici
Succhi di frutta
Diagnosi di natura e di specie - Sangue
Occorrono metodi specifici per identificare una certa sostanza
Test OBTI per sostanza ematica
Rapid Stain Identification of Human Blood (RSID®-Blood)
utilizza 2 anticorpi monoclonali anti-glicoforina A umana. E’
una proteina espressa specificamente su membrane dei
globuli rossi. Sensibilità: meno di 1 ul
Evidenziano la fluorescenza emessa da substrati biologici
quali liquido seminale, sudore, urina, saliva.
Test assolutamente ASPECIFICO
Campioni biologici da cui è possibile ricavare il DNA per la definizione del profilo genetico
sangue, tracce ematiche
tessuti
saliva
sperma, tracce di liquido seminale
formazioni pilifere
ossa e denti
“touch DNA”
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
Le tappe storiche della genetica forense
Lo stato dell’arte della genetica-forense
La possibilità di tipizzare tracce biologiche era limitata a tracce ematiche e,
pressoché esclusivamente, alla determinazione del gruppo sanguigno nell’ambito
del sistema ABO
Nature. 1985 Mar 7-13;314, 67-73.
Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA.
Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL.
Il DNA è contenuto nel nucleo di ogni cellula. Tutte le cellule di un individuo
recano il medesimo patrimonio genetico.
Era possibile, quindi, ricavare informazioni genetiche da pressoché tutti i substrati
biologici (sangue, sperma, saliva, tessuti anche inclusi in paraffina, formazioni
pilifere, ossa, denti, unghie).
Lo stato dell’arte della genetica-forense
PROFILO GENETICO
MULTILOCUS
Molto bene da sangue
fresco
Necessaria traccia ematica
di una certa dimensione
(alcuni cm2)
Non troppo datata (analisi
sensibile alla degradazione
del DNA)
Profili genetici non-uomo
specifici
Difficile la statistica
Le tappe storiche della genetica forense
Lo stato dell’arte della genetica-forense
Reazione a catena della Polimerasi (PCR)
Tecnica che consente di ottenere milioni di copie di una
determinata sequenza di DNA di interesse
(fotocopiatrice molecolare)
Aumento significativo della sensibilità del saggio
E’, infatti, teoricamente possibile amplificare il DNA estratto da una
singola cellula
Sistema capillare con elettroferogrammi “a picchi”
AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)
D21S11
D7S820
CSF1PO
D8S1179
D3S1358
VWA
D19S433
AMEL
TH01
D13S317
D16S539
D2S1338
TPOX
D18S51
D5S818
FGA
COLD CASE
Lo stato dell’arte della genetica-forense
Il profilo genetico - Standard Internazionale
13
13--17 marcatori genetici
(microsatelliti o STR) più un
marcatore genetico per la diagnosi di
sesso
Nessun informazione circa lo
stato di salute del soggetto
Lo stato dell’arte della genetica-forense
Il profilo genetico - Standard Internazionale
Marcatori genetici selezionati sono affidabili in termini di sensibilità dell’analisi
e riproducibilità dei risultati.
Vagliati e approvati da Società Internazionali di Genetica-Forense
ISFG – International Society of Forensic Genetics;
ENFSI – European Network of Forensic Sciences Institutes
EDNAP – European DNA Profiling Group
Sviluppo di kit commerciali
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
Lo stato dell’arte della genetica-forense
STR
traccia
Amelog. D3S1358
X-Y
15-16
vWA
FGA
18-20
21-23
D8S1179 D18S51 CSF1PO
13-15
12-12
9-10
TH01
TPOX
7-10
8-11
Il test del DNA è un esame comparativo
Il profilo genetico determinato dalla traccia deve essere
confrontato altri profili genetici
•Con il soggetto indagato, con la vittima
•Con i prossimi congiunti, nell’ambito di una identificazione
•Con una banca dati di profili genetici
Lo stato dell’arte della genetica-forense
CONFRONTO DI PROFILI GENETICI
MARKER
Amel
D3S1358
D19S433
D2S1338
D16S539
D18S51
TH01
vWA
FGA
traccia
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
Individuo 1
XY
16-17
14-15
17-19
9-10
12-13
8-9
16-20
21-21
Individuo 2
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
Lo stato dell’arte della genetica-forense
CONFRONTO DI PROFILI GENETICI
MARKER
Amel
D3S1358
D19S433
D2S1338
D16S539
D18S51
TH01
vWA
FGA
traccia
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
Individuo
2
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
0.05
0.03
0.06
0.10
0.11
0.21
0.02
0.04
freq. nella
popolazione
•Dalla comparazione dei profili genetici NON emergono incompatibilità genetiche.
•I profili genetici sono perfettamente sovrapponibili. Vi è quello che viene definito il
“match”.
Lo stato dell’arte della genetica-forense
CONFRONTO DI PROFILI GENETICI
MARKER
Amel
D3S1358
D19S433
D2S1338
D16S539
D18S51
TH01
vWA
FGA
traccia
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
Individuo
2
XY
15-18
14-14
17-20
9-9
12-13
8-9.3
17-19
21-23
0.05
0.03
0.06
0.10
0.11
0.21
0.02
0.04
freq. nella
popolazione
•Viene, quindi, calcolata la “match probability” ovverosia la probabilità di rinvenire a
caso nella popolazione un soggetto che presenti le medesime caratteristiche genetiche
evidenziate per la traccia.
•Per un profilo genetico a 15-17 marcatori la “match probability” è stimata in circa 1
soggetto su 1016 (un soggetto su 10 milioni di miliardi).
•Altro modo di rappresentare la compatibilità tra profili genetici e la LR (likelihood
ratio), ovverosia un rapporto di probabilità, tipicamente ipotesi dell’accusa rispetto ad
ipotesi della difesa. Il numero ottenuto dirà quanto è più probabile un’ipotesi rispetto
all’altra.
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
Lo stato dell’arte della genetica-forense
APPLICAZIONI IN AMBITO IDENTIFICATIVO
Test di paternità/maternità/parentela
Casi di violenza sessuale
Match traccia biologica – individuo sospetto/vittima
Identificazione di persone scomparse
Identificazione nei disastri di massa
Ricostruzioni storiche (Romanov)
Costruzione di banche dati
L’analisi del DNA
serve anche per
scagionare persone
innocenti
ingiustamente
condannate per reati
che non hanno
commesso
www.innocenceproject.org
Lo stato dell’arte della genetica-forense
In più della metà dei casi,
l’approccio scorretto
all’uso di indagini
forensi, quali la
determinazione dei
gruppi sanguigni,
l’analisi del DNA,
l’analisi di formazioni
pilifere, di impronte
papillari, del segno di un
morso hanno giocato un
ruolo fondamentale nella
condanna della persona
innocente
Lo stato dell’arte della genetica-forense
Le Scienze forensi si sono sviluppate in isolamento rispetto al mondo
accademico, modellate per le necessità pratiche dei sistemi giudiziari piuttosto
che seguendo i canoni del confronto e della discussione all’interno della
comunità scientifica internazionale.
Per esempio le tecniche di comparazione delle impronte digitali, formazioni
pilifere, fibre, impronte di denti hanno basi empiriche poco solide non
fornendo, per esempio, il margine di errore dell’analisi.
Lo stato dell’arte della genetica-forense
In UK, caso Hoey (2007).
Sospesa ammissibilità in
Tribunale. Reintrodotto nel
2009
In USA, numerose e
contrastanti sentenze riguardo
l’ammissibilità nel processo
dell’analisi LT-DNA, in
quanto non esiste una
convergenza di opinioni nella
comunità scientifica riguardo
alla interpretazione e
valutazione statistica dei
risultati
In Italia?
Limiti attuali del test del DNA
•Non è possibile stabilire una cronologia della deposizione di una
o più tracce, sia assoluta che relativa
•Il DNA è un substrato molto sensibile a processi di degradazione
e di modificazione chimico/fisica
•In generale, più tempo passa, minori sono le possibilità di
ottenere risultati
•Rivestono, tuttavia, importanza assoluta le
conservazione dei reperti (temperatura, umidità)
modalità
di
•Metodi di individuazione di tracce biologiche nel corso del
sopralluogo giudiziario
•Diagnosi generica, specifica e individuale
•Il profilo genetico
•Valutazione dei risultati
•Applicazioni in ambito identificativo forense
•Limiti del test del DNA
Limiti attuali del test del DNA
Analisi su “touch DNA”
Sono attualmente circa il 50% delle indagini nei laboratori di genetica
forense
Sono difficoltose poiché nel contatto tra il corpo di una persona e un
oggetto possono essere trasferite poche decine di cellule da cui si ricava
una esigua quantità di DNA
In queste condizioni, definite di low copy number DNA (LCN-DNA), le
analisi possono produrre profili genetici di bassa qualità in cui sono
presenti artefatti legati alla bassa quantità di DNA
Tali profili LCN possono non rappresentare le reali caratteristiche
genetiche del campione biologico
Limiti attuali del test del DNA
Profili genetici LCN
(Low Copy Number)
Profili genetici di bassa
qualità in cui sono
presenti artefatti legati
alla bassa quantità di
DNA.
250 pg
100 pg
Più del 50% delle
indagini
identificative
eseguite attualmente nei
laboratori è su oggetti
toccati (touch DNA).
Molto
probabile
condizione di LCN-DNA
50 pg
25 pg
12.5 pgg
PROFILI GENETICI COMMISTI
Originati dal contestuale contributo di substrati biologici riferibili a più soggetti
Soggetto 1
Soggetto 2
Traccia
mista
PROFILI GENETICI COMMISTI
DIFFICILE INTERPRETAZIONE SE NON SI HANNO PROFILI GENETICI DI
COMPARAZIONE.
DIFFICILE ISOLARE I SINGOLI PROFILI GENETICI
Anche se esistono linee guida internazionali (Gill
Gill et al
al.. (2006)
2006) DNA Commission of the
International Society of Forensic Genetics.
Genetics. Recommendations on the interpretation of
mixtures.. Forensic Sci Int 160;
mixtures
160; 90
90--101 ), l’approccio probabilistico è molto complesso.
Effetti della contaminazione: la storia del “fantasma di Hellbronn”
Questa “serial killer” era sospettata di sei omicidi sulla base di un profilo
del DNA costantemente rinvenuto nei reperti nel corso di differenti
sopralluoghi. Tale profilo genetico era stato rinvenuto nei reperti di 40
differenti scene del crimine tra il Sud della Germania e l’Austria, in circa
16 anni.
Venne, infine, accertato che i tamponi di cotone usati per repertare il DNA
erano stati contaminati accidentalmente da una donna che lavorava in una
fabbrica di produzione di tali supporti non identificata della Baviera.
http://news.bbc.co.uk/2/hi/europe/7966641.stm
APPLICAZIONI IN AMBITO IDENTIFICATIVO
Test di paternità/maternità/parentela
Casi di violenza sessuale
Match traccia biologica – individuo sospetto/vittima
Identificazione di persone scomparse
Identificazione nei disastri di massa
Ricostruzioni storiche (Romanov)
Costruzione di banche dati
NEL 2013 FINALMENTE ANCHE IN ITALIA
SARA’ OPERATIVA LA BANCA DATI DEL DNA
A SEGUITO DELLA FIRMA DEL TRATTATO DI PRUM NEL 2005,
L’ITALIA, LA FRANCIA, LA SPAGNA, L’OLANDA, LA
GERMANIA, IL LUSSEMBURGO, IL BELGIO, IL PORTOGALLO,
LA FINLANDIA HANNO DECISO DI CONDIVIDERE I DATI
GENETICI DI SOGGETTI IL CUI PROFILO E’ CONTENUTO IN
UN ARCHIVIO (DATABASE).
Testo dei decreti attuativi, nella versione finale, è all’esame del
Garante della Privacy e pronto per essere inviato al Parlamento
COS’E’ UN DATABASE GENETICO
Con il termine di “banca dati di DNA” o “database di DNA” si
vuole qui indicare la raccolta di profili genetici a scopo
esclusivamente identificativo-forense, costituita con opportune
modalità da un organismo istituzionalmente riconosciuto,
poggiante su una precisa e rigorosa regolamentazione.
•Può contenere i profili genetici di soggetti condannati per specifici
reati
•Può contenere profili genetici ottenuti da tracce rinvenute sul luogo
del reato
•Può contenere profili genetici ottenuti da cadaveri non identificati
•Può contenere profili genetici di parenti di soggetti scomparsi
http://www.councilforresponsiblegenetics.org/dnadata/fullreport.pdf
DATABASE DI DNA IN EUROPA
•1995
INGHILTERRA (7 milioni di profili)
•1996
IRLANDA DEL NORD, SCOZIA
•1997
OLANDA, AUSTRIA
•1998
GERMANIA (1 milione), SLOVENIA
•1999
FINLANDIA, NORVEGIA
•2000
DANIMARCA, SVEZIA, SVIZZERA,
CROAZIA, BULGARIA
•2001
FRANCIA (1 milione), REP. CECA
•2002
BELGIO, ESTONIA, LITUANIA,
SLOVACCHIA
•2003
UNGHERIA, LETTONIA
•2007
SPAGNA
•2009
PORTOGALLO, ITALIA?
IN UN’EU A 27 STATI AD OGGI SOLO L’ITALIA NON HA UNA
BANCA DATI DEL DNA
Yara Gambirasio
scomparsa il 26 novembre 2010
mentre tornava dalla palestra
Rinvenuto il cadavere il
26 febbraio 2011
Sugli indumenti (slip e
pantaloni) rinvenuto un
profilo genetico maschile.
Non appartiene a nessun
sospettato
Ricerca
disperata
tra
quelle persone il cui
telefono cellulare è stato
agganciato dalla cella
vicina alla zona del
rinvenimento del cadavere
Nelle vicinanze
un’autostrada
trafficata
passa
molto
SVILUPPO DEI DATABASE DI DNA IN EUROPA (2003-2008)
Statistiche delle ricerche nel database inglese
Fondamentale strumento per le indagini giudiziarie!
QUALITA’ DEI PROFILI GENETICI
In Europa, i laboratori che inseriscono profili genetici nella banca dati del
DNA sono tutti accreditati per la norma ISO/IEC/EN 17025.
Anche in Italia questo sarà lo standard, anche se, inizialmente (per un
anno), sarà sufficiente la certificazione ISO 9001:2008.
Costo dell’accreditamento per il laboratorio è oneroso: da € 10.000 a
20.000/anno