IL MICROSCOPIO: principi e componenti di base Che cos’è un microscopio? Il microscopio è uno strumento che rende visibili i dettagli più piccoli Il microscopio compie tre operazioni: 1) Ingrandimento: l’immagine del campione è ingrandita 2) Risoluzione: i dettagli nell’immagine sono separati 3) Contrasto: i dettagli sono resi visibili all’occhio umano o ad altri strumenti atti a rilevarli
Relazioni tra il microscopio e l’occhio umano L’occhio umano percepisce i colori del visibile e le differenze di intensità luminosa (intensità che varia dal nero al bianco e tra tutte le tonalità di grigio) Sezione occhio umano Sezione retina I recettori dei colori sono le cellule coniche (cone cells) e quelle che rilevano l’intensità luminosa sono le cellule a bastoncino (rod cells). Entrambi presenti nella retina. La retina è situata nella parte posteriore dell’interno dell’occhio. La cornea e le lenti determinano il meccanismo di far entrare e di focalizzare la luce verso la retina. Da qui, parte ilo messaggio elettrochimico verso il cervello
L’occhio distingue chiaramente i dettagli di un immagine quando questa è diffusa sulla retina con un sufficiente angolo visuale Oggetto posto lontano dall’occhio Oggetto posto vicino dall’occhio
Il microscopio semplice A causa della limitata capacità delle lenti dell’occhio di modificare la propria forma, gli oggetti molto vicini all’occhio non possono avere una immagine focalizzata sulla retina Lenti convesse (spesse al centro) sono stati utilizzati come lente d’ingrandimento o microscopio semplice Il campione è focalizzato sulla retina grazie ad una lente d’ingrandimento posta tra l’oggetto e l’occhio Limiti Posizionamento del campione Illuminazione Aberrazione delle lenti costruzione
Microscopio di Von Leeuwenhoek
Il microscopio composto (Galileo) Il microscopio composto mostra 1. due lenti convesse allineati in serie: una lente vicino all’oggetto (obiettivo) e una lente vicino all’occhio (oculare) 2. Mezzi che permettono il movimento delle lenti e del campione Il microscopio composto determina un ingrandimento a due stadi: 1. l’obiettivo proietta un’immagine ingrandita del campione nel tubo del microscopio 2. l’oculare ingrandisce ulteriormente tale immagine Ad esempio: se si utilizza un obiettivo 10X ed un oculare 15X, l’ingrandimento totale sarà di 150X
Funzionamento di un microscopio 1. la luce di una lampada passa attraverso un condensatore; 2. quindi attraversa il vetrino con il campione posto su un’apertura della piastra porta­oggetti 3. la luce è poi raccolta dall’obiettivo 4. l’obiettivo insieme alle lenti posti nel tubo, focalizzano l’immagine del campione a livello del diaframma dell’oculare 5. l’immagine è poi vista dall’osservatore come se essa è posizionata a 250 mm dall’occhio
Considerazioni sulla formazione dell’immagine L’immagine non deve essere solamente ingrandita ma deve essere anche chiara. Risoluzione Apertura numerica Quando la luce dai vari punti del campione passa attraverso l’obiettivo, questi punti sono visti nell’immagine come piccoli dischi e non punti. Questo è causato dalla diffrazione e diffusione della luce. Tali dischi sul piano dell’immagine, consistono di piccoli cerchi concentrici luminosi e bui. Più piccoli sono questi dischi, meno si sovrappongono e maggiore saranno i dettagli dell’immagine. La capacità di distinguere chiaramente i dettagli più minuti del campione è conosciuta con il nome di potere di risoluzione
Il potere risolvente del microscopio è misurato dalla minima distanza che separa due punti o due linee vicine ma ancora distinguibili.
Se si riduce l’apertura del diaframma di apertura del condensatore, il contrasto aumenta ma diminuisce il potere risolvente. Comunemente si trova un compromesso fra i due estremi
La capacità di un obiettivo di comprendere i vari raggi della luce provenienti da ciascuna parte illuminata del campione, è direttamente relativa all’apertura angolare dell’obiettivo Apertura numerica = n * siin m
n= indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra il campione e la lente frontale
m = grado di apertura angolare dell’obiettivo
L’apertura numerica del microscopio è data da quella dell’obiettivo più quella del condensatore Comparazione di un microscopio a bassa ed alta apertura numerica
I dettagli dell’immagine possono essere rilevati anche con obiettivi di bassa apertura numerica. Infatti, gli obiettivi a bassa apertura numerica hanno una maggiore profondità di campo e quindi una maggiore distanza tra l’obiettivo e il campione rispetto agli obiettivi di alta apertura numerica Comparazione della profondità di campo di un sistema a bassa ed alta apertura numerica
Correzione dell’aberrazione cromatica: i principali colori sono proiettati in un unico punto di focalizzazione Correzione dell’aberrazione sferica: i raggi di luce che passano in posizioni diverse attraverso la lente sono proiettati in un punto di focalizzazione
Componenti ottici di un microscopio L’obiettivo è il più importante componente ottico del microscopio ed è costituito da una serie di lenti
1. La sua funzione di base è acquisire la luce che passa attraverso il campione ed proiettare un’immagine invertita del campione nel corpo del microscopio 2. Dovrebbe avere la capacità di ricostruire i vari punti del campione in corrispondenti punti dell’immagine chiamati “ anti.punti” (disco circolare di diametro definito) 3. Deve essere costruito in modo tale che possa fuocalizzare ad una distanza più vicina possibile al campione e quindi proiettare un immagine ingrandita nel microscopio 4.Dovrebbe avere la parte frontale della lente ritraibile in modo da proteggerla nel caso in cui l’obiettivo richiede di focalizzare molto vicino al campione Tipi di obiettivi 1. Acromatico A) Meno costoso B) Sono corretti cromaticamente per la luce blu e rossa C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il colore verde D) Migliori risultati sono ottenuti con luce che passa attraverso un filtro verde e con immagini in bianco e nero 2. Fluorite A) Più costoso dell’acromatico B) Sono corretti crormaticamente per la luce blu, rossa ed anche verde C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il blu ed il rosso D) Sono uitili per la fotomicrogrsfis a colori 3. Apocromatico A) Più costosi B) Sono corretti cromaticamente per il blu profondo, blu, verde e rosso C) Sono corretti sfericamente per il blu profondo, blu e verde D) Sono i migliori obiettivi per la registrazione e l’osservazione a colori E) Maggiore numero di aperture
Al fine di ottenere immagini piane e non curve esistono degli obiettivi chiamati “ Acromatico piano” o (Fluorite piano” o “ Apocromatico piano” La correzione della curvatura di campo è indispensabile per la registrazione delle immagini
Complessità del sistema delle lenti che costituiscono un obiettivo apocromatico all’incrementare dell’ingrandimento
Descrizione delle caratteristiche sull’obiettivo 1. Ingrandimento (10X, 20X, 40X, ecc.) 2. Il segno ∞ la correzione per l’infinito 3. lo spessore del copri vetrino (0.17 mm) 4. Il tipo di obiettivo 5. Se l’obiettivo è costruito per operare in immersione 6. apertura numerica (0.04­1.4) 7. Banda colorata per distinguere l’ingrandimento
L’oculare Gli obiettivi devono essere utilizzati in combinazione con gli oculari per ottenere i migliori risultati Caratteristiche funzionali dell’oculare 1. La sua funzione base è “ guardare” l’immagine ingrandita proiettata dall’obiettivo ed ingrandire una seconda volta l’immagine (immagine virtuale); 2. Un piccolo oculare serve per acquisire l’immagine (quella proiettata dall’obiettivo) mediante sistemi fotografici o video. 3. Nell’oculare alloggia un diaframma fisso. Ed è sul piano di questo diaframma che sarà proiettata l’immagine dall’obiettivo; 4. Sulla montatura del diaframma fisso si può inserire un reticolo per le
Tipi di oculari Ramsden (oculare positivo) Huygenian (oculare negativo) Nel tipo negativo sono presenti due Nel tipo positivo, le lenti costituite da lenti: la superiore e l’inferiore o lente diversi elementi uniti insieme, sono di campo. Entrambe le lenti sono posti sopra il diaframma fisso. piano­convessi con la parte La porzione in basso dell’oculare si convessa rivolta verso il campione può svitare per poi, a seconda A metà distanza tra queste due lenti dell’uso, porre un reticolo che serve è presente il diaframma fisso
per conteggiare o misurare. Il condensatore Il condensatore è posto sotto la piastra portaoggetti ed, in particolare, tra la lampada per l’illuminazione ed il campione. Caratteristiche funzionali dell’oculare
1. La sua funzione base è quella di “ raccogliere” la luce proveniente dal sistema di illuminazione e concentrarla a raggi paralleli sul campione e, attraversato questo, sul piano focale dell’obiettivo; 2. Esso è costruito in modo tale che la luce arrivi a focalizzarsi all’apertura del suo diaframma; 3. I nuovi modelli di condensatore sono provvisti sistemi di correzione delle lenti; 4. In alcuni microscopi, nel condensatore sono alloggiati gli accessori per il contrasto di fase Condensatore di tipo Abbe Apertura numerica di 1.25 Non è ben corretto per le aberrazioni cromatiche e sferiche Utilizzato per le osservazioni di routine Condensatore di tipo Aplanatico­Acromatico Le aberrazioni cromatiche e sferiche sono ben corrette Utilizzato per l’osservazioni a colori
Considerazioni sull’utilizzo L’appropriato utilizzo dell’apertura del diaframma del condensatore è importante nel determinare l’ottimo livello di illuminazione e di contrasto L’apertura del diaframma controlla l’angolo dei raggi luminosi che passano attraverso il campione e vanno nell’obiettivo Quando si utilizzano obiettivi di basso ingrandimento è preferibile svitare la lente superiore del condensatore oppure utilizzare un condensatore di basso potere L’altezza del condensatore è regolata da uno o due viti. L’aggiustamento di tale altezza è importante per l’illuminazione (vedi dopo)
1. Alla base del condensatore, sotto il condensatore, è presente uno specchio (la superficie frontale è argentata) la cui funzione è quella di riflettere la luce che arriva dal sistema di illuminazione verso il condensatore. Prima dello specchio è posto un diaframma definito diaframma di campo. 2. Nella parte più bassa del tubo di osservazione è incorporata una lente (tube lens) la cui funzione è quella di raccogliere i raggi paralleli del proiettati dall’obiettivo e condurli al piano del diaframma fisso dell’oculare 3. la base del microscopio contiene una lente (collector lens) che è posta di fronte il sistema di illuminazione e la sua funzione è quella di indirizzare la luce, attraverso lo specchio, sul piano
Altre componenti ottici del microscopio Componenti meccanici/elettrici 1. la base del microscopio, a forma differente, permette una grande stabilità. Inoltre, in essa sono presenti i componenti elettrici per azionare e controllare il sistema di illuminazione. Questo è posto nella parte bassa e posteriore della base. La base inoltre presenta il diaframma di campo. 2. Il piano del microscopio presenta un’apertura che permette il passaggio della luce e dove è posto il vetrino con il campione. Inoltre sono presenti delle manopole che muovono il campione (sopra/sotto e sinistra/destra);
3. Sulla parte destra e sinistra del sostegno del microscopio sono presenti le manopole per la messa a fuoco sia grossolana (vite macrometrica) sia fine (vite micrometrica) 4. sotto il piano o piastra è posto un contenitore per l’alloggiamento del condensatore. Questo contenitore può essere svitato e potrebbe avere delle viti per centrare il condensatore all’asse ottico del microscopio 5. sul supporto del microscopio è posto un portaobiettivi (nosepiece) che è fissato o rimovibile, e su esso sono montati gli obiettivi di diverso
6. Tubi rimovibili, sia binoculari sia trinoculari, sono attaccati al sostegno del microscopio sopra il portaobiettivi. Il binoculare è utilizzato solo per vedere mentre il trinoculare è utilizzato anche per fotografare. Essi sono posizionati ad un angolo di 30° per facilitare l’osservazione
L’intelaiatura del microscopio ha le seguenti funzioni: 1. Assicurare la stabilità e rigidità al microscopio; 2. Fornire il supporto per alloggiare gli obiettivi e l’oculare; 3. Contenere il campione su una superficie piana e permettere il movimento di questo campione mediante apposite manopole 4. Fornire il supporto al condensatore, al sistema di illuminazione ed al sistema elettrico I moderni microscopi hanno le caratteristiche di essere ergonomici ed modulari A) Le viti per la messa a fuoco sono concentrici e posti sulla parte superiore del microscopio facilitando così l’operatore (le mani o le braccia non devono essere in alta posizione); B) La base frontale è stretta per permettere un facile accesso agli accessori; C) L’angolo per l’osservazione permette lunghi periodi di lavoro senza affaticarsi; D) Il portaobiettivi è costruito in modo tale che, quando un obiettivo è utilizzato, gli altri due non ostacolano le dita dell’operatore.
Diversi componenti sono intercambiabili: condensatori, obiettivi, oculari, lampade, tubi di osservazione, ecc. Sistema di illuminazione Inizialmente, la sorgente di luce era costituita dalla luce solare mentre successivamente sono state adottate delle lampade elettriche di vario tipo. Queste sorgenti luce erano focalizzate direttamente sul campione mediante un condensatore. Problemi: Scarsa uniformità di illuminazione determinata da: 1. Limitata dimensione della sorgente di luce (poca luce); 2. L’immagine della luce era inopportunamente sovrapposta sull’immagine del campione Nei primi anni del 1900, August Kohler progettò un sistema di illuminazione (Illuminazione Koehler) che superò tali problemi
Illuminazione Koehler Metodo: Una lente (collector lens) è posta di fronte alla sorgente di illuminazione e proietta un’immagine allargata della luce verso il diaframma di apertura del condensatore 1. Poiché la luce è focalizzata di fronte al piano focale del condensatore, la luce emergente attraversa il campione per raggi paralleli; 2. Poiché la luce non è focalizzata sul piano del campione, essa si presenta estesa e non sgranata
La regolazione del diaframma di apertura del condensatore controlla l’angolo del cono di luce che raggiunge il campione; Un secondo diaframma (diaframma di campo) invece controlla il diametro (e non l’angolo) della luce che attraversa il campione. Manipolando questi due diaframmai si raggiunge il miglior compromesso tra risoluzione e contrasto
Procedura per settare l’illuminazione di Koehler 1. Accendere la lampada del microscopio, aprire totalmente entrambi i diaframmi (diaframma di apertura e diaframma di campo); 2. Ruotare il portaobiettivi per portare l’obiettivo 10X sulla il percorso della luce. 3. Porre il campione sulla piastra e focalizzare mediante le viti; 4. Chiudere totalmente il diaframma di campo. Quindi, salire il condensatore e focalizzare l’immagine del diaframma di campo (forma poligono) su quella del campione; Se l’immagine del diaframma di campo non è centrata, usa la manopole del condensatore per centrarla. Poi aprire il diaframma di campo fino alla sua scomparsa dalla vista; 5. Tirare fuori un oculare e guarda dentro il tubo. Nel guardare, aprire e chiudere il diaframma di apertura del condensatore ed aggiustare la sua apertura che sia aperta di 2/3 o ¾ (miglior compromesso tra risoluzione e contrasto). Quindi riporre l’oculare; 6. Osservare i suddetti steps ogniqualvolta si cambia l’obiettivo
Procedura per focalizzare il microscopio 1. Accendere la lampada e settare l’intensità di luce per un’osservazione confortevole 2. Guardando attraverso l’oculare, afferrare i due tubi con le mani ed avvicinarli o allontanarli fino a che si osserva un solo cerchio di visione; 3. Porre un vetrino con il campione sulla piastra ed aumentare o diminuire l’altezza della piastra utilizzando la vite macrometrica. Portare a fuoco e quindi utilizzare la vite micrometrica per una perfetta messa a fuoco; 4. Se si desidera utilizzare un altro obiettivo, la nuovo messa a fuoco sarà eseguita solamente con la vite micrometrica
Tipi di microscopio Microscopio ottico: 1. Per luce trasmessa (quando all’obiettivo giunge la luce che attraversa il campione) 2. Per luce diffusa (quando il campione è illuminato in modo che all’obiettivo giunge solo la luce da esso diffusa) 3. Per luce riflessa (quando l’obiettivo raccoglie la luce riflessa dalla superficie dell’oggetto) Campioni opachi Campioni trasparenti colorati (metodo della colorazione
Per campioni trasparenti sui quali la colorazione può interferire con i processi oggetti di studio (ad esempio, cellula vivente o amebe), si utilizza Microscopio a contrasto di fase Converte in differenze di intensità le differenze di fase che si producono tra la luce che attraversa le parti interne del campione e la luce diretta proveniente dal piano su cui questo è posto Come si forma un’immagine? L’immagine si forma in quanto l’onda elettromagnetica (luce) che attraverso un oggetto opaco è costituita da due onde (incidente e diffratta) sfasate di mezza lunghezza d’onda. Per questo motivo le due onde interferiscono tra loro dando luogo ad un immagine meno luminosa In un mezzo trasparente ci sono sempre due onde, delle quali quella diffratta non è sufficientemente sfasata tale da modificare la lucentezza dell’immagine.
Nel microscopio a contrasto di fase, l’onda diffratta viene separata e modificata in modo che si propaghi sfasata con mezza lunghezza d’onda rispetto a quella incidente. Essa interferisce con l’onda incidente cosicché il campione trasparente viene evidenziato in tutti i suoi particolare come se fosse un oggetto opaco Diaframma circolare Disco ritarda­fase
Disco ritarda­fase
Funzionamento del microscopio a contrasto di fase Diaframma circolare Microscopio a fluorescenza Il campione, illuminato con luce ultravioletta, viene trattato con opportune sostanze coloranti che emettono per fluorescenza nel campo del visibile Immagine al m. a fluorescenza
Microscopio polarizzatore Il campione è posto tra due nicol (funzionanti rispettivamente da polarizzatore e da analizzatore). Utilizzato soprattutto in mineralogia, nell’osservazione di strutture microcristalline, identificabile in base agli effetti cromatici Cristallo al microscopio polarizzatore
Microscopio invertito Il sistema di illuminazione ed il sistema ottico sono rovesciati rispetto a quelli di un normale m. ottico, il che permette di esaminare la parte inferiore del preparato (colture cellulari) Stereomicroscopio Lo stereomicroscopio è uno strumento che vi permette di vedere in tre dimensioni gli oggetti osservando il campione da due angoli leggermente diversi e ottenendo le due immagini necessarie per la visione stereoscopica. Stereomicroscopio E' un microscopio adatto all'entomologia, alla mineralogia, alla botanica, quindi è largamente impiegato in numerosi campi di ricerca,
Microscopio elettronico Particolare tipo di microscopio in cui l’osservazione dell’oggetto è realizzata tramite un fascio di elettroni . Questo permette di ingrandire l’oggetto più di 100.000 volte ad un potere risolvente dell’ordine dell’angstrom
